PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ ( CP) CỦA Cymbidium mosaic virus ( CyMV )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TẠO DỊNG GEN MÃ HĨA PROTEIN VỎ (CP) CỦA Cymbidium mosaic virus (CyMV) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : LÊ QUANG TRUNG Mã số sinh viên : 07126221 Niên khóa : 2007 – 2011 Tháng 07/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO i TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TẠO DỊNG GEN MÃ HĨA PROTEIN VỎ (CP) CỦA Cymbidium mosaic virus (CyMV) Hướng dẫn khoa học: Sinh viên thực : ThS NGUYỄN XUÂN DŨNG LÊ QUANG TRUNG KS NGUYỄN THỊ NGỌC THẢO Tháng 07/2011 ii LỜI CẢM ƠN  Thực khoá luận tốt nghiệp hội giúp tơi ơn lại kiến thức có học hỏi nhiều điều Trong trình thực khố luận tơi giúp đỡ từ gia đình, nhiều thầy cơ, anh chị bạn bè Tôi xin chân thành cảm ơn:  Đầu tiên xin thành kính ghi ơn ba mẹ sinh thành, ln bên để có ngày hơm nay, cảm ơn anh chị em bạn bè giúp đỡ động viên suốt thời gian qua  Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Công Nghệ Sinh Học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho suốt trình học tập trường  Ban lãnh đạo Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp  Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Xuân Dũng KS Nguyễn Thị Ngọc Thảo tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình thực tập thực khố luận Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh  Tơi xin gửi lời cảm ơn đến tất anh chị làm việc phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử phòng Cơng nghệ Sinh học Thực vật tận tình bảo tơi suốt thời gian qua  Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp DH07SH gắn bó, động viên, giúp đỡ suốt năm qua. Xin Chân thành cảm ơn! i TÓM TẮT Những năm gần đây, lan xếp vào loại trồng công nghiệp có doanh thu cao Nhiều vườn lan với hình thức khác mọc lên nhiều nơi Song để phát triển loại trồng này, nhà vườn phải đối diện với nhiều tác nhân gây bệnh, yếu tố bất lợi làm suy giảm suất thiệt hại kinh tế lan đem lại Cymbidium mosaic virus lồi virus gây hại dòng phong lan, có tên gọi khác virus khảm vàng Cây lan nhiễm loại virus sức sống, phẩm chất hoa,… giảm đáng kể; làm kìm hãm ngành công nghiệp trồng lan Việc nghiên cứu biện pháp kiểm soát bệnh virus vấn đề quan tâm Đề tài “Phân lập tạo dòng gen mã hóa protein vỏ (CP) Cymbidium mosaic virus (CyMV)” thực nhằm góp phần vào việc kiểm soát hiệu bệnh virus CyMV gây lan Nghiên cứu bắt đầu với việc kiểm tra tình trạng nhiễm virus lan với cặp mồi phát kỹ thuật RT–PCR từ mẫu nhiễm virus, đồng thời thiết kế mồi đặc hiệu cho trình tự gen CP chèn đoạn gen khuếch đại vào vector pJet1.2/blunt Sau tiến hành hóa biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli DH5α, sàng lọc thu nhận dòng E coli DH5α mang plasmid chứa gen quan tâm Một số kết thu nhận sau: Đề tài phân lập gen CP virus CyMV thu nhận dòng vi khuẩn E coli DH5α chứa plasmid nhân dòng mang trình tự gen CP virus CyMV Xác định trình tự gen CP virus CyMV Việt Nam ii SUMMARY Thesis title: “Isolation and cloning Cymbidium mosaic virus (CyMV) coat protein gene” Recently, the orchids is typed in one of the industrial plant, which have offered several benefits The orchids have been planned in many ways at the fields In order to develop these plants, growers have to face to challenges such as pathogen, inconvenient weather which will be decreased yield and damage economy for growers Cymbidium mosaic virus also known as yellow mosaic virus is major pathogen causes yellow mosaic disease in different orchid genera The quality of orchids and flower orchids which are infected this virus, will be decreased Especially, it also affect the orchid industry This study was made to effective control diseases caused by Cymbidium mosaic viru Fristly, Cymbidium mosaic virus was detected by RT-PCR method Simultaneously, designing the CP cloning primers from the CyMV genomes sequences in NCBI Secondly, the CP gene sequence was amplified by RT-PCR and these primers Then, the CP gene was inserted into the vector pJet1.2/blunt to create the recombinant vectors And, they were transformed into E coli DH5α Finally, isolating the E coli DH5α contained the recombinant vectors Some results: We have set up process successfully and have isolated the E coli DH5α contained the recombinant vectors We have also analyzed sequence the recombinant vector and confirmed the target sequence iii MỤC LỤC ĐỀ MỤC Trang LỜI CẢM ƠN……………………………………………………………………… i TÓM TẮT…………………………………………………………………………… ii SUMMARY………………………………………………………………………… iii MỤC LỤC…………………………………………………………………………… iv DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT………………………………………………… vi DANH SÁCH CÁC BẢNG………………………………………………………….viii DANH SÁCH CÁC HÌNH…………………………………………………………….ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.3 Yêu cầu .2 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược Cymbidium mosaic virus (CyMV) .3 2.2 Các phương pháp phát virus lan .5 2.2.1 Phương pháp ELISA 2.2.2 Phương pháp RT-PCR 2.3 Tổng quan mồi sử dụng phản ứng PCR 2.3.1 Các yêu cầu cần đảm bảo thiết kế mồi .7 2.3.2 Các bước thiết kế mồi 2.4 Sơ lược phương pháp PCR kỹ thuật tạo dòng gen 2.4.1 Phương pháp PCR 2.4.2 Sơ lược kỹ thuật tạo dòng gen 10 2.5 Tình hình nghiên cứu ngồi nuớc 11 2.5.1.Tình hình nghiên cứu nước 11 2.5.1.1 Các nghiên cứu phát virus 11 2.5.1.2 Các nghiên cứu phân lập, tạo dòng gen CyMV 12 2.5.2 Tình hình nước 14 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Địa điểm thời gian 16 iv 3.2 Vật liệu nghiên cứu 16 3.3 Hóa chất, dụng cụ trang thiết bị thí nghiệm 16 3.3.1 Hóa chất .16 3.3.2 Dụng cụ trang thiết bị thí nghiệm 17 3.4 Nội dung phương pháp nghiên cứu .18 3.4.1 Nội dung 18 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 18 3.4.2.1 Kiểm tra tình trạng nhiễm virus CyMV mẫu địa lan 18 3.4.2.2 Thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại gen CP virus CyMV 20 3.4.2.3 Khuếch đại gen CP kỹ thuật RT–PCR 20 3.4.2.4 Tạo dòng gen CP vào vi khuẩn E coli DH5α 21 3.4.2.5 Giải trình tự đoạn gen nhân dòng 24 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Kiểm tra tình trạng nhiễm virus CyMV mẫu địa lan 25 4.2 Thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại gen CP virus CyMV 25 4.3 Khuếch đại gen CP kỹ thuật RT – PCR 26 4.4 Tạo dòng gen CP vào vi khuẩn E coli DH5α 27 4.4.1 Chèn đoạn gen CP vào vector nhân dòng hóa biến nạp plasmid 27 4.4.2 Kiểm tra đoạn gen nhân dòng .27 4.5 Giải trình tự đoạn gen nhân dòng 29 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .32 5.1 Kết luận 32 5.2 Đề nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 v DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT AMV : Avian myeloblastosis virus bp : base pair BSA : Bovine serum albumin BYMV : Bean yellow mosaic virus PAMV : Potato aucuba mosaic virus cDNA : Complementary deoxyribonucleotic acid CP : Coat protein CTAB : Cetyl trimethylammonium bromide CymRSV : Cymbidium ringspot virus CyMV : Cymbidium mosaic virus DAS-ELISA : A double antibody sandwich enzyme - linked immunosorbent assay DNA : Deoxyribonucleotic acid dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid ELISA : Enzyme - linked immunosorbent assay FCCP : Forward Cymbidium mosaic virus coat protein kDa : kiloDalton LB : Luria – Bertain MLV : Murine leukemia virus NCBI : National Center for Biotechnology Information NCR : Noncoding region NMV : Narcissus mosaic virus ORF : Open reading frame vi ORSV : Odontoglossum ringspot virus PCR : Polymerase chain reaction RCCP : Reverse Cymbidium mosaic virus coat protein RdRp : RNA - dependent RNA polymerase RIPA : Rapid immunofilter paper assay RNA : Ribonucleotic acid RT-PCR : Reverse transcription - Polymerase chain reaction SMYEaV : Strawberry mild yellow edge - Associated virus TAE : Tris - acetate - EDTA Taq polymerase: Thermus aquaticus polymerase TGB : Triple – gene - block Tm : Melting temperature UH : University of Hawaii WClMV : White clover mosaic virus vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Thông tin cặp mồi 19 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng RT–PCR phát virus CyMV 19 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng RT–PCR phát virus CyMV 20 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc 22 Bảng 4.1 Thông tin cặp mồi dùng cho khuếch đại gen CP virus CyMV 26 viii Hình 4.9 Kết so sánh gen CP dòng C3.9 ngân hàng gen (NCBI) 31 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Thiết kế cặp mồi FCCP – RCCP thích hợp để khuếch đại gen CP CyMV mẫu địa lan (Cymbidium) Phân lập gen CP virus CyMV mẫu địa lan (Cymbidium) phản ứng RT-PCR Tạo dòng vi khuẩn E coli DH5α mang vector nhân dòng pJet 1.2/blunt chứa gen CP virus CyMV 5.2 Đề nghị Nghiên cứu tạo vector biểu cho gen CP CyMV Biểu hiện, thu nhận tinh protein vỏ (CP) CyMV 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng Việt: Nguyễn Xuân Dũng, Nguyễn Quốc Tồn, Đặng Quỳnh Chi, Nguyễn Quốc Bình Phát Cymbidium mosaic virus Odontigossum ringspot virus Multiplex RT-PCR Real-time PT-PCR Tuyển tập Hội nghị Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn Quốc khu vực Phía nam năm 2009 Hồ Huỳnh Thùy Dương 2002 Sinh Học Phân Tử, Nhà Xuất Bản Giáo Dục Lê Thị Ánh Hồng, Phan Tố Phượng, Trần Duy Quý, Nguyễn Mai Chi, Nguyễn Thúy An, Nguyễn Hằng Phương, Mai Thu Hà, Lương Thị Hải, Đàm Quốc Trụ, Nguyễn Văn Đồng 1999 Ứng dụng kỹ thuật phân tử phát xác định bệnh hại thực vật Việt Nam Báo cáo Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, Hà nội 1999, p 301 - 313 Đỗ Thanh Lâm 2006 Điều tra bệnh virus Cymbidium mosaic virus gây địa lan thành phố Đà Lạt, luận văn kỹ sư nông học, trường đại học Nơng Lâm Tp HCM, 46 trang Lê Đình Lương 2001 Nguyên lý kỹ thuật di truyền, Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật Vũ Triệu Mân 2003 Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật NXB Hà Nội Nguyễn Ngọc Quỳnh, Nguyễn Duy, Hồng Ngọc Trâm, Phạm Thị Mỹ Hạnh, Lý Phương Loan, Bùi Thị Thu Ngân 2007 Ứng dụng phương pháp RT-PCR chuẩn đoán virus gây bệnh khảm vàng CyMV bệnh đốm vòng ORSV hoa lan Dendrobium Phalaenopsis Hội thảo ứng dụng kỹ thuật nhân giống nuôi trồng hoa lan thành phố Hồ Chí Minh, Tp Hồ Chí Minh 2007, p 47 - 51 Nguyễn Thư Thanh 1990 Vi sinh vật học đại cương, Nhà xuất Nông Nghiệp Nguyễn Văn Uyển 1996 Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật (Methods in plant biotechnology), tập 2, Nhà xuất Nông Nghiệp 10 Phạm Hùng Vân 2009 PCR Real-time PCR, vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y Học 11 Bùi Trang Việt, Lê Thị Phương Hồng 2006 Sinh học di truyền phân tử, phần I (Sinh học di truyền), Nhà xuất Nông Nghiệp 12 Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Tp HCM 2009 Tài liệu lớp đào tạo ngắn hạn kỹ thuật phản ứng chuỗi PCR  Tài liệu tiếng Anh: 13 Sherpa A R et al 2007 Complete nucleotide sequence analysis of Cymbidium mosaic virus Indian isolate: futher evidence for natural recombination among potexviruses J.Biosci, 32(4), p 663 – 669 14 Bhat A.I et al 2006 Detection and Identification of Cymbidium mosaic virus infecting vanilla (Vanilla planifolia Andrews) in India based on Coat Protein Gene Sequence Relationships J Plant biochemistry and biotechnology Vol, 15, p 33 – 37 33 15 Chen Chang et al 2005 Transgenic resistance to Cymbidium mosaic virus in Dedrobium Expressing the viral capsid protein gene.Transgenic Res, 14, p 41 – 46 16 Christopher Howe 2007 Gene Cloning and Manipulation, Second edition Cambridge (www.Cambridge.org/9780521819936) 17 Dharmaraj MS S 2008 RT-PCR: The basic Http://www.ambion.com/techlib/basics/rtpcr/index.html#1 18 Dominic W.S.Wong 2006 The ABCs of Gene Cloning, second edition Springer 19 Flynn P 1996 Virus Diseases of Orchids Horticulture and Home Pest New IC 475(8) 20 Hu J S, Ferreira S and Wang M 1993 Detection of cymbidium mosaic virus, odontoglossum ringspot virus, tomato spotted wilt virus, and potyviruses infecting orchids in Hawaii Plant Disease, 77(5), p 464 - 468 21 Frowd J A and TREMAINE J H 1977 Physical, chemical, and properties of Cymbidium mosaic virus Phytopathology, 67, p 43 – 49 22 Julia Lodge, Pete Lund and Steve Minchin 2007 Gene Cloning Taylor and Francis 23 Lim S.T., Wong S.M., Yeong C.Y., Lee S.C and Goh C.J 1993 Rapid detection of cymbidium mosaic virus by polymerase chain reaction (PCR) Virological Methods, 41, p 37 - 46 24 Liu et at 2009 Quantitative detection of Cymbidium mosaic virus by real-time PCR Front Biol China 2009, 4(3), p 314 - 320 25 Li-Jen Liao et al 2004 Transgene silencing in Phalaenopsis expressing the coat protein of Cymbidium Mosaic Virus is a manifestation of RNA-mediated resistance Molecular biology, 13, p 229 – 242 26 Marais F 2002 Virus Diseases Orchid Society of Northern Transvaal Http://www.ont.co.za/virus_diseases.htm 27 Moran J and Knoxfield 1999 Virus diseases of orchids Http://www.dpi.vic.gov.au/DPI/nreninf.nsf/childdocs/ 28 Navalinskiene M., Raugalas J., Samuitiene M 2005 Viral diseases of flower plants 16 Identification of viruses affecting orchids (Cymbidium Sw.) Biologija Nr 2, p 29 - 34 29 Srifah P et al 1996 Use of reverse transcription-polymerase chain reaction for cloning of coat protein-encoding genes of cymbidium mosaic virus Gene, 179, p 105 – 107 30 Ajjikuttira P et al 2002 Genetic variability in the coat protein genes or two orchid viruses: Cymbidium mosaic virus and Odontoglossum ringspot virus Arch Virol, 147(10), p 1943 – 1954 31 Ajjikuttira P et al 2005 Reciprocal function of movement proteins and complementation of long-distance movement of Cymbidium mosaic virus RNA by Odontoglossum ringspot virus coat protein J Gen Virol, 86(PT 5), p 1543 – 1553 34 32 Robert T McMillan et al 2005 Color break in orchid flower Proc Fra State Hort Soc, 118, p 287 – 288 33 Ryu K.H and Park W.M 1995b The complete nucleotide sequence and genome organization of Odontoglossum ringspot tobamovirus RNA Arch Virol, 140, p 1577 1587 34 Ryu K.H., Park W M 1995a Rapid detection and identification of odontoglossum ringspot virus by polymerase chain reaction amplification FEMS Microbiology letters, 133(1995), p 265 - 269 35 Ryu K.H, Yoon K.E., and Park W.M 1995 Detection by RT-PCR of cymbidium mosaic virus in orchids Phytopathology, 143, p 643 - 646 36 Seoh ML., Sek-Man Wong and Lee Zhang 1998 Simultaneous TD:RT-PCR detection of cymbidium mosaic potexvirus and odontoglossum ringspot tobamovirus with a single pair of mồis Journal of Virological Methods 72(2), p 197 - 204 37 Lee S C et al 2007 Performances and application of antisera produced by recombinant capsid protein of Cymbidium mosaic virus and Odontoglossum ringspot virus Eur J Plant pathol, 122, p 297 – 306 38 Tanaka S, Nishii H., Ito S., Iwaka M K 1997 Detection of Cymbidium mosaic potexvirus and Odontoglossum ringspot tobamovirus from Thai orchids by rapid immunofilter paper assay Plant Disease 81(2), p 167 - 170 39 Chia T-F et al 1992 Characterization of Cymbidium mosaic virus coat protein gene and its expression in transgenic tobacco plants Plant molecular biology, 18, p 1091 – 1099 40.Brown T.A 1997 Gene cloning an introduction, third edition, Chapman & Hall 41 University of Illinois Extention 1990 Common virus diseases of orchids Report on plant diseases Department of crop sciences University of Illinois at Urbana Champaign Http://www.aces.uiuc.edu/vista/pdf_pubs/614.pdf 42 Wong S.M., Chng C.G., Lee Y.H., Tan K and Zettler F.W 1994 Incidence of cymbidium mosaic and odontoglossum ringspot viruses and their significance in orchid cultivation in Singapore Crop protection, 13(3), p 235 - 239 43 Wong S.M et al 1997 Cymbidium mosaic potexvirus RNA: complete nucleotide sequence and phylogenetic analysis Arch Virol, 142, p 383 – 391 44 Wen – Wei Hu et al 1998 The use of DIG – labeled cDNA probes for the detection of cymbidium mosaic potexvirus (CymMV) and odontoglossum ringspot tobamovirus (ORSV) in orchids Arch Virol, 143, p 1265 – 1275 45 You-Xiu Zheng et al 2010 Odontoglossum Ringspot Virus causing flower crinkle in Phalaenopsis hybrids European journal of plant pathology, 128(1), p – 46 Khentry Y et al 2006 Incidence of Cymbidium mosaic virus and Odontoglossum ringspot virus in Dendrobium spp in Thailand Kasesart J (Nat Sci.), 40, p 49 – 57 47 Zettler F.W., Ko N.J., Wisler G.C., Elliott M.S, Wong S.M 1990 Viruses of orchid and their control Plant Disease, 74(9), p 621 - 626 35  Các trang web tham khảo: 48 http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/index.html 49 http://fokker.wi.mit.edu/mồi3/input.html 50 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 36 PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần môi trường 1.1 Môi trường LB ( Luria – Bertain) lỏng - Yeast extract 5g - Tryptone 10 g - NaCl 10 g - Nước cất đủ 1000 ml (pH đưa 7,0 với khoảng 0,4 ml NaOH N) 1.2 Môi trường LB Agar - Yeast extract 5g - Tryptone 10 g - NaCl 10 g - Agar 15 g - Nước cất đủ 1000 ml 1.3 Dung dịch TAE X - Tris - acetat 40 mM - EDTA (pH = 8) mM 1.4 Loading dye - Bromephenol blue 0,25% - Glicerol TAE X 40% 1.5 Dung dịch ampicillin 100 mg/l Cân 100 mg ampicillin (dạng bột) hòa tan ml nước khử ion, lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0,45 µm 1.6 Dung dịch CaCl2 M (100 ml) Cân 14,7 gam CaCl2.2H2O hòa tan với nước khử ion vừa đủ 100 ml Sau hấp khử trùng 121oC, 20 phút Giữ lạnh 4oC 1.7 Gel agarose 1% Cân gam agarose cho hòa tan với TAE 0,5 X vừa đủ 100 ml Sau đun cho agarose tan hoàn toàn (khoảng phút) Để nguội đến 40 - 50oC, đổ gel vào khuôn, gel nguội gỡ lược khỏi miếng gel, lấy gel khỏi khuôn cách nhẹ nhàng đặt vào bồn điện di có sẵn dung dịch TAE 0,5 X Phụ lục Quy trình tạo tế bào khả nạp E.coli DH5α - Tế bào E.coli DH5α nuôi LB lỏng, 37oC, 24 h (1) - Erlen 250 ml (2) chứa 100 ml LB thêm 1ml dịch E.coli (1) - Sau đem ni 37oC, lắc 250 vòng/phút OD600 đạt 0,3 – 0,4 (không vượt 0,4) - Chia dịch tiện vào falcon 50 ml (ủ lạnh) Cho vào đá lạnh 10 phút - Các bước tiến hành đá - Ly tâm phút, 1.600 xg (3.000 rpm), 4oC - Đổ phần dịch lỏng, hòa tan nhẹ kết tủa 10 ml CaCl2 - Ly tâm phút, 1.100 xg (2.500 rpm), 4oC Đổ phần lỏng, hòa tan nhẹ kết tủa 10 ml CaCl2 lạnh - Giữ phần tế bào hòa tan đá 30 phút - Ly tâm phút, 1.100 xg (2.500 rpm), 4oC Đổ phần lỏng, hòa tan nhẹ kết tủa 1,5 ml CaCl2 lạnh - Thêm 0,75 ml glycerol 65% vào ống - Chia 100 µl tế bào vào effendorf trữ lạnh trước - Giữ tủ - 80oC Phụ lục Enzyme cắt giới hạn Enzyme Trình tự đặc hiệu EcoRI G*AATTC BamHI G*GATCC Số vị trí cắt Nguồn gốc (tên vi sinh vật) Ở thực khuẩn thể Ở pBR 322 Escherichia coli RY13 Bacillus amyloliquefaciens H Phụ lục Kết giải trình tự dòng C3.9 mồi R - pJet1.2 (Chú thích: gen CP có trình tự từ vị trí 36 kết thúc tai vị trí 707, vị trí đặc hiệu BamHI 30, EcoRI 710.) Phụ lục Hình ảnh so sánh kết giải trình tự NCBI Phụ lục Hình ảnh so sánh với trình tự AB541560.1 NCBI Phụ lục Hình ảnh so sánh với trình tự AB197973.1 NCBI Phụ lục Hình ảnh so sánh với trình tự DQ067881.1 NCBI ... cDNA : Complementary deoxyribonucleotic acid CP : Coat protein CTAB : Cetyl trimethylammonium bromide CymRSV : Cymbidium ringspot virus CyMV : Cymbidium mosaic virus DAS-ELISA : A double antibody... antibody sandwich enzyme - linked immunosorbent assay DNA : Deoxyribonucleotic acid dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid ELISA : Enzyme - linked immunosorbent... Transcription-PCR) Trước hết, RNA chuyển thành cDNA (Complementary Deoxyribonucleotic Acid) nhờ enzyme phiên mã ngược từ Mo MLV (Murine leukemia virus) AMV (Avian myeloblastosis virus) Mồi sử