PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ ( CP )CỦA Odontoglossum ringspot virus ( ORSV )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TẠO DỊNG GEN MÃ HĨA PROTEIN VỎ (CP) CỦA Odontoglossum ringspot virus (ORSV) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : TRẦN THỊ BÍCH THÚY Niên khóa : 2007 – 2011 Tháng 07/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TẠO DỊNG GEN MÃ HĨA PROTEIN VỎ (CP) CỦA Odontoglossum ringspot virus (ORSV) Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS NGUYỄN XUÂN DŨNG TRẦN THỊ BÍCH THÚY KS NGUYỄN THỊ NGỌC THẢO Tháng 07/2011 LỜI CẢM ƠN Con thành kính ghi ơn Ba Mẹ người thân gia đình ln tạo điều kiện động viên suốt trình học tập trường Thực luận văn tốt nghiệp hội giúp ôn lại kiến thức có học hỏi nhiều điều Trong trình thực luận văn tơi giúp đỡ nhiều từ Thầy Cơ, gia đình bạn bè Tôi xin chân thành cảm ơn: ThS Nguyễn Xuân Dũng KS Nguyễn Thị Ngọc Thảo giúp đỡ tơi từ ngày đầu thực tập đến hồn thành luận văn Trung tâm Ban lãnh đạo Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa luận tốt nghiêp Ban Giám hiệu Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, tất quý Thầy Cô truyền đạt kiến thức cho suốt trình học tập trường Các anh chị làm việc phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử phòng Cơng nghệ Sinh học Thực vật tận tình bảo tơi suốt thời gian qua Tập thể lớp DH07SH, đặc biệt bạn phòng 17F gắn bó, động viên, giúp đỡ tơi suốt năm qua. Xin chân thành cảm ơn! Trần Thị Bích Th i TĨM TẮT Odontoglossum Ringspot virus (ORSV) loại vi rút gây thiệt hại nghiêm trọng mặt kinh tế cho người trồng lan.Việc nghiên cứu tìm biện pháp kỹ thuật thích hợp để góp phần làm giảm chi phí phát vi rút ORSV lan việc làm cần thiết Đề tài “Phân lập tạo dòng gen mã hóa protein vỏ (CP) Odondoglossum ringspot virus (ORSV)” thực nhằm tạo sở cho nghiên cứu việc kiểm soát vi rút cách hiệu Đề tài bắt đầu với việc kiểm tra tình trạng nhiễm vi rút ORSV mẫu lan thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại gen CP vi rút ORSV Các mẫu có chứa vi rút sử dụng để ly trích RNA vi rút khuếch đại gen mã hóa cho protein vỏ (CP) phương pháp RT-PCR Đoạn gen CP sau phân lập chèn vào vectơ pJET 1.2/blunt sau vectơ mang gen biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α phương pháp hóa biến nạp Tiến hành kiểm tra hiệu chèn biến nạp cách sàng lọc dòng vi khuẩn môi trường kháng sinh chọn lọc kiểm tra diện đoạn gen Một số kết đạt nghiên cứu phân lập gen CP vi rút ORSV, thu nhận dòng tế bào vi khuẩn E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa trình tự gen mã hóa protein vỏ CP vi rút ORSV xác định trình tự gen CP vi rút ORSV Việt Nam ii SUMMARY Odontoglossum Ringspot virus (ORSV) is one of the virus that causes severe damage to economically for orchid growers Nowaday, researching to find appropriate technical measures to help reduce the cost of detecting the virus ORSV is a necessary target Project "Isolation and cloning the Odondoglossum CP ringspot virus (ORSV) coat protein (CP) gene" was done to create the basis for further research to control this virus effectively This project has begun with checking the status of the sample was infected with virus by using RT-PCR method with specific primers, and then designing primers which amplify the CP gene of the ORSV virus The CP gene sequence was amplified by RT-PCR with the designed primers The amplified CP gene was inserted into pJet1.2/blunt vector to create the recombinant vectors Before, they were transformed into E.coli DH5α Finally, isolation of E.coli DH5α containing the recombinant vectors was performed by using antibiotic selection The presence of the target gene in transformed E.coli DH5α was checked by using clony PCR Some achievements: we have isolated the ORSV CP gene, have obtained the DH5α E coli cells which containing the recombinant vector And, we have also analyzed the sequence of this recombinant vector iii iv MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Ảnh hưởng vi rút trồng 2.2 Các loại vi rút gây bệnh cho lan triệu chứng 2.3 Giới thiệu Odontoglossum ringspot virus 2.4 Các phương pháp phát vi rút lan 2.4.1 Phương pháp ELISA 2.4.2 Phương pháp RT-PCR 2.5 Sơ lược phương pháp PCR kỹ thuật tạo dòng gen 2.5.1 Phương pháp PCR 2.5.2 Sơ lược kỹ thuật tạo dòng gen 2.5.2.1 Những bước việc tạo dòng gen 2.5.2.2 Tầm quan trọng tạo dòng gen .10 2.6 Một số yêu cầu mồi thiết kế mồi .10 2.7 Tình hình nghiên cứu phát Odontoglossum ringspot virus lan .11 2.7.1 Tình hình nghiên cứu nước 11 2.7.2 Tình hình nghiên cứu nước 12 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 14 3.2 Vật liệu nghiên cứu 14 v 3.2.1 Mẫu .14 3.2.2 Hóa chất 14 3.2.3 Dụng cụ trang thiết bị thí nghiệm 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Kiểm tra tình trạng nhiễm vi rút ORSV mẫu lan 16 3.3.2 Thiết kế mồi đặc để khuếch đại gen CP 17 3.3.3 Phân lập gen CP 18 3.3.4 Chèn đoạn gen CP vào plasmid nhân dòng 19 3.3.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn sàng lọc 19 3.3.6 Kiểm tra diện đoạn gen nhân dòng 20 3.3.6.1 Kiểm tra phương pháp PCR khuẩn lạc 20 3.3.6.2 Kiểm tra enzym cắt hạn chế .21 3.3.7 Kiểm tra trình tự gen CP phương pháp giải trình tự .22 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Kiểm tra tình trạng nhiễm vi rút ORSV mẫu lan .23 4.2 Thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại gen CP 23 4.3 Phân lập gen CP 23 4.4 Chèn đoạn gen CP vào plasmid nhân dòng biến nạp plasmid tái tổ hợp .24 4.5 Kiểm tra diện đoạn gen nhân dòng 26 4.5.1 Kiểm tra phương pháp PCR khuẩn lạc 26 4.5.2 Kiểm tra phương pháp sử dụng enzym cắt hạn chế 28 4.6 Giải trình tự plasmid có chứa đoạn gen CP .30 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Đề nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO .34 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Amp: Ampicillin Bp : Base pair Cp: Coat protein CGMMV: Cucumber green mottle mosaic virus CNSH: Công nghệ Sinh học cDNA: Complementary Deoxyribonucleotic Acid CyMV: Cymbidium mosaic virus dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate DNA: Deoxyribonucleotide acid ELISA: Enzym-linked immunosorbent assay LB: Luria- Bertani RNA: Ribonucleic acid kb: Kilobase pair kDa: Kilo Dalton MCS: Multiple cloning site MP: Movement protein NCBI: National Center for Biotechnology information ORF: Open reading Frame ORSV: Odontoglossum ringspot virus PCR: Polymerase chain reaction PMMV: Pepper mild mottle mosaic virus RdRp: RNA-Deppendent RNA polymerase RT-PCR: Reverse transcription Polymerase Chain Reaction SHMV: Sunn - hemp mosaic virus TAE: Tris-acetate-EDTA Taq polymerase: Thermus aquaticus polymerase TMV: Tobacco mosaic virus TMGMV: Tobacco mild green mosaic virus ToMV: Tomato mosaic virus vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Thành phần phản ứng RT–PCR phát vi rút ORSV 17 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng RT–PCR khuếch đại gen CP vi rút ORSV .18 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng cho phản ứng PCR khuẩn lạc 20 viii Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi FpJET RpJET gel agarose 1% - là: sản phẩm PCR khuẩn lạc O4.12, O4.11, O3.9, O3.7, O2.6; L: thang 4.5.2 Kiểm tra phương pháp sử dụng enzym cắt hạn chế Dòng khuẩn lạc kiểm tra có mang plasmid chứa đoạn gen CP (O4.11và O4.12) tăng sinh qua đêm mơi trường LB có bổ sung ampicillin 100 µg/ml Dòng khuẩn lạc sau tăng sinh sử dụng để tách chiết plasmid, sản phẩm plasmid sau tách điện di kiểm tra, theo lý thuyết, plasmid có chứa đoạn gen nhân dòng kích thước 3451 bp (gồm kích thước pJET 1.2/blunt (2974bp) kích thước đoạn gen CP (477bp)) Kết điện cho thấy sản phẩm plasmid thu có kích thước nằm vị trí khoảng 3000 - 4000 bp so với thang chuẩn (Hình 4.8) Điều cho phép chúng tơi dự đốn plasmid có mang đoạn gen CP vi rút ORSV 28 Hình 4.8 Kết điện di sản phẩm plasmid sau tách gel agarose 1% 2: plasmid mang đoạn gen CP; L: thang Để khẳng định lại đoạn gen chèn vào plasmid đoạn gen CP, tiến hành thực phản ứng cắt hai enzym cắt loại với hai enzym cắt mồi thiết kế BamHI HindIII Nếu đoạn gen chèn vào plasmid đoạn gen CP sản phẩm cắt dự kiến thu cho vạch có kích thước 477 bp Kết sau điện di sản phẩm cắt, thu vạch có kích thước khoảng 500 bp (Hình 4.9) Đến đây, chúng tơi khẳng định chắn plasmid có mang đoạn gen mục tiêu Hình 4.9 Kết điện di sản phẩm cắt enzym BamHI HindIII gel agarose 1% 3: plasmid cắt BamHI HindII; 4: đối chứng âm: plasmid không cắt; L: Thang 29 Sự xuất vạch có kích thước khoảng 300 bp kết cắt có vị trí cắt enzym HindIII plasmid, ngồi vị trí cắt đầu ’ đoạn gen, tiến hành cắt với tổ hợp enzym BamHI HindIII, Plasmid tái tổ hợp bị cắt vị trí khác (một vị trí BamHI vị trí HindIII) Một số sản phẩm tạo từ vị trí cắt vạch có kích thước khoảng 300 bp thể kết điện di sản phẩm cắt (Hình 4.9) 4.6 Giải trình tự plasmid có chứa đoạn gen CP Cuối cùng, để xác định trình tự đoạn gen nhân dòng, chúng tơi tiến hành gửi giải trình tự dòng vi khuẩn thu sau kiểm tra phản ứng cắt với enzym cắt hạn chế Kết giải trình tự sau so sánh với liệu GenBank công cụ hỗ trợ ClustalW Blast (NCBI) có dòng O4.12 chọn Kết giải trình cho thấy gen CP tạo dòng có kích thước 477 nucleotid Với codon khởi đầu ATG codon kết thúc TAA (Hình 4.10) ATGTCTTACACTATTACAGACCCGTCTAAGCTGGCTTATTTAAGCTCGGCTTGGGCTGACC CCAATTCACTAATCAACCTTTGTACCAATTCTCTGGGTAATCAGTTCCAAACACAACAAGC TCGAACAACTGTTCAACAGCAGTTTGCTGATGTTTGGCAGCCGGTTCCTACTTTGACCAGT AGGTTCCCTGCAGGCGCTGGTTACTTCAGAGTTTATCGCTATGATCCTATATTAGATCCTTT AATAACTTTCTTAATGGGTACTTTTGATACTCGTAATAGAATAATCGAGGTAGAAAATCCG CAGAATCCGACAACTACGGsAAACATTAGATGCAACTCGTAGAGTTGATGATGCAACTGTA GCAATAAGATCTGCAATAAATAATCTATTAAATGAGTTAGTTAGGGGAACTGGTATGTACA ATCAAGTCTCATTTGAGACGATGTCTGGACTTACTTGGACCTCTTCCTAA Hình 4.10 Kết giải trình tự gen CP ORSV, dòng O4.12 Trình tự xác định so sánh với liệu ngân hàng gen NCBI công cụ BLAST Kết cho thấy gen CP nhân dòng vào dòng vi khuẩn O4.12 có trình tự tương đồng từ 98 - 100% so với cơng bố trình tự gen CP ORSV NCBI (Hình 4.11) 30 Hình 4.11 Kết so sánh trình tự gen CP tạo dòng ORSV với trình tự cơng bố ngân hàng liệu NCBI cơng cụ BLAST 31 Hình 4.12 Kết so sánh trìn h tự gen CP tạo dòng với trình tự gen CP (AB541503.1) Choi,S., Yoon,J and Chung,B., cơng bố năm 2010 Đến đây, khẳng định phân lập tạo dòng gen CP vi rút ORSV 32 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Như vậy, nghiên cứu thành công việc phát mẫu lan bị nhiễm vi rút ORSV thiết kế cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen CP vi rút Sử dụng mồi thiết kế sử dụng để phân lập gen mã hóa cho protein vỏ CP ORSV, việc tạo dòng gen mã hố protein vỏ CP thành cơng, tạo dòng vi khuẩn mang plasmid chứa trình tự gen mã hóa protein vỏ CP vi rút ORSV 5.2 Đề nghị - Tạo dòng gen CP với số lượng lớn nhằm phục vụ cho nghiên cứu - Nghiên cứu tạo vectơ biểu để biểu gen mã hoá protein vỏ CP vi rút ORSV tạo dòng - Tiếp tục nghiên cứu biểu thu nhận protein vỏ ORSV 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Xuân Dũng, Nguyễn Quốc Toàn, Đặng Quỳnh Chi, Nguyễn Quốc Bình 2009 Phát Cymbidium mosaic virus Odontigossum ringspot virus Multiplex RT-PCR Real-time PT-PCR Tuyển tập Hội nghị Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn Quốc khu vực Phía nam Phạm Duy, Huỳnh Văn Thái 2005 Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Huỳnh Thùy Dương 2002 Sinh Học Phân Tử, Nhà Xuất Bản Giáo Dục Phạm Thành Hổ 2007 Di truyền học Nhà xuất Giáo dục Đỗ Ngọc Liên 2007 Sinh học màng tế bào, tập Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội Lê Đình Lương 2001 Nguyên lý kỹ thuật di truyền Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật Nguyễn Ngọc Quỳnh, Nguyễn Duy, Hồng Ngọc Trâm, Phạm Thị Mỹ Hạnh, Lý Phương Loan, Bùi Thị Thu Ngân 2007 Ứng dụng phương pháp RT-PCR chuẩn đoán vi rút gây bệnh khảm vàng CyMV bệnh đốm vòng ORSV hoa lan Dendrobium Phalaenopsis Hội thảo ứng dụng kỹ thuật nhân giống nuôi trồng hoa lan thành phố Hồ Chí Minh, trang 47-51 Nguyễn Văn Uyển 1996, Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật (Methods in plant biotechnology), tập Nhà xuất Nông Nghiệp Phạm Hùng Vân 2009 PCR Real-time PCR, vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y Học 10 Bùi Trang Việt, Lê Thị Phương Hồng, 2006 Sinh học di truyền phân tử, phần I (Sinh học di truyền) Nhà xuất Nông Nghiệp 11 Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Tp HCM 2009 Tài liệu lớp đào tạo ngắn hạn kỹ thuật phản ứng chuỗi PCR 34 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 12 Cheng C G., Wong S M., Mahtani P H., Loh C S., Goh C., Kao M C., Chung M C and Watanabe Y The complete sequence of a Singapore isolate of Odonto glossum ringspot virus and comparison with other tobamoviruses Gene, 171, p 155-161 13 Hu J S., Ferreira S and Wang M 1993 Detection of cymbidium mosaic virus, odontoglossum ringspot virus, tomato spotted wilt virus, and potyviruses infecting orchids in Hawaii Plant Disease, 77, p 464-468 14 J.S HU, S FERREIRA, M WANG, and M Q XU, Department of Plant Pathology, University of Hawaii, 3190 Maile Way, Honolulu, HI96822, Detection of Cymbidium Mosaic Virus, Odontoglossum Ringspot Virus, Tomato Spotted Wilt Virus, and Potyviruses Infecting Orchids in Hawaii 15 Khentry Y., Paradornuwat A., Tantiwiwat S., Phansiri S and Thaveechai N 2006 Incidence of Cymbidium mosaic virus and Odontoglossum ringspot virus on in vitro Thai native orchid seedlings and cultivated orchid mericlones Kasesart J (Nat Sci.) 40, p 49-57 16 Ryu K.H and Park W.M 1995b The complete nucleotide sequence and genome organization of Odontoglossum ringspot tobamovirus RNA Arch Virol, 140, p 1577-1587 17 Seoh ML., Sek-Man Wong and Lee Zhang 1998 Simultaneous TD:RT-PCR detection of cymbidium mosaic potexvirus and odontoglossum ringspot tobamovirus with a single pair of primers Journal of Virological Methods 72, p 197-204 18 Svánchez M.D 1999 Feed, animal waste and nutrient balances Proceedings of the Regional Workshop on Area-Wide Integration of Crop-Livestock Activities, Hochiminh City, Vietnam, pp 19 T.A Brown 1997 Gen cloning an introduction, third edition, Chapman & Hall 20 Wong S.M., Chng C.G., Lee Y.H., Tan K and Zettler F.W 1994 Incidence of cymbidium mosaic and odontoglossum ringspot viruses and their significance in orchid cultivation in Singapore Crop protection, 13, p 235-239 CÁC TRANG WEB THAM KHẢO 21 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 22 http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.html 23 http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/index.html 24 http://www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail.php 35 PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần môi trường 1.1 Môi trường LB ( Luria – Bertain) lỏng - Yeast extract 5g - Tryptone 10 g - NaCl 10 g - Nước cất đủ 1000 ml (pH đưa 7,0 với khoảng 0,4 ml NaOH 5N) 1.2 Môi trường LB agar - Yeast extract 5g - Tryptone 10 g - NaCl 10 g - Agar 15 g - Nước cất đủ 1000 ml Phụ lục Thành phần số hóa chất 2.1 Dung dịch TAE X - Tris - acetat 40 mM - EDTA (pH = 8) mM 2.2.Loading dye - Bromephenol blue 0,25% - Glicerol TAE X 40% 2.3 Dung dịch ampicillin 100 µg/ml - Cân 100 µg Ampicillin (dạng bột) hòa tan ml nước khử ion, lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0.45 µm 2.4 Dung dịch CaCl2 M (100 ml) - Cân 14,7 g CaCl2.2H2O hòa tan với nước khử ion vừa đủ 100 ml Sau hấp khử trùng 121oC, 20 phút Giữ lạnh 4oC Phụ lục Điện di sản phẩm PCR đọc kết Bảng Thành phần điện di gel agarose 1% Nguyên liệu Thành phần Lượng Gel agarose Agarose 1g TAE 0,5 X 100 ml TAE 0,5 X 200 ml Ethidium Bromide 10 mg/ml Dung dịch điện di TAE Dung dịch nhuộm Hỗn hợp agarose TAE 0,5 X đun agarose tan hoàn toàn (khoảng - phút), làm nguội đổ vào khn có cắm lược để hình thành giếng sau đông Sau gel đông, mẫu đưa vào giếng (trộn µl loading buffer với 10 µl sản phẩm PCR) Điện di thực 100 V 30phút (thời gian thay đổi tùy theo kích thước miếng gel) Gel sau điện di nhuộm ethidium bromide để phát kích thước DNA 30 phút, giải nhuộm nước hình máy Geldoc Phụ lục Quy trình tạo tế bào khả nạp E.coli DH5α - Tế bào E.Coli DH5α nuôi LB lỏng, 37oC, 24 - Erlen 250 ml chứa 100 ml LB thêm ml dịch E.Coli - Sau đem ni 37oC, lắc 250 vòng/phút OD600 đạt 0,3 – 0,4 (không vượt 0,4) - Chia dịch sau nuôi cấy vào falcon 50 ml (ủ lạnh) Cho vào đá lạnh 10 phút - Các bước tiến hành đá - Ly tâm phút, 1.600xg (3000 rpm), 4oC - Đổ bỏ phần dịch lỏng, hòa tan nhẹ kết tủa 10 ml CaCl2 - Ly tâm phút, 1.100 xg (2.500 rpm), 4oC Đổ phần lỏng, hòa tan nhẹ kết tủa 10 ml CaCl2 lạnh - Giữ phần tế bào hòa tan đá 30 phút - Ly tâm phút, 1.100 xg (2.500 rpm), 4oC bỏ phần lỏng, hòa tan nhẹ kết tủa 1,5 ml CaCl2 lạnh - Thêm 0,75 ml glycerol 65% vào ống -Chia 100 µl tế bào vào eppendorf trữ lạnh trước - Giữ tủ - 80oC Phụ lục Ezyme cắt giới hạn Enzym Trình tự đặc hiệu HindIII A AGCTT BamHI G GATCC Phụ lục Kết quả giải trình tự File: O412-RPJet12.ab1 Run Ended: 2011/2/25 18:51:38 Signal G:1302 A:1547 C:1644 T:1941 Sample: O412_RPJet12 Lane: 80 Base spacing: 15.408842 950 bases in 11539 scans >110224-50_O18_O412-FPJet12.ab1 950 Trình tự đoạn gen CP vị trí nucleotide số 36 kết thúc vị trí số 512 Phụ lục7 Các hình ảnh so sánh NCBI Hình1 Kết so sánh trình tự gen CP ORSV, dòng O4.12 với trình tự cơng bố ngân hàng liệu NCBI Hình So sánh với trình tự AB541503.1 Hình So sánh với trình tự EU653020.1 ... 14 3.2.3 Dụng cụ trang thi t bị thí nghiệm 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Kiểm tra tình trạng nhiễm vi rút ORSV mẫu lan 16 3.3.2 Thi t kế mồi đặc để khuếch... nhiễm khỏe mạnh Điều cho thấy cần thi t để thi t lập nên quy trình chuẩn đốn bệnh vi rút xác để bảo đảm sưu tập lan bệnh vi rút (Phan Chỉnh Nguyên, 2009) 2.3 Giới thi u Odontoglossum ringspot virus... they were transformed into E.coli DH5α Finally, isolation of E.coli DH5α containing the recombinant vectors was performed by using antibiotic selection The presence of the target gene in transformed