Tách dòng và biểu hiện gene mã hóa chitinase của Bacillus licheniformis KNUC213 trong nấm men Pichia pastoris

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Tình hình nghiên cứu chitinase trên thế giới Đặc điểm nuôi cấy của chủng vi khuẩn KNUC213 trên môi các trườ

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

**************************

CHU THỊ HOA

TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE MÃ HÓA CHITINASE CỦA

BACILLUS LICHENIFORMIS KNUC213 TRONG NẤM MEN PICHIA

Trang 2

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phí Quyết Tiến-người thầy đã dìu dắt tôi những bước đi đầu tiên trên con đường nghiên cứu khoa học, truyền đạt cho tôi những kiến thức, chỉ bảo tận tình và có những đóng góp mới mẻ, sâu sắc về lĩnh vực nghiên cứu Đồng thời, thầy cũng tạo điều kiện tốt nhất về thời gian và điều kiện làm việc khi tôi thực hiện những nghiên cứu trong luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Hiếu, KS Quách Ngọc Tùng và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn thí nghiệm, thường xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên môn, góp ý cho luận văn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi học tập và rèn luyện trong suốt quá trình thực tập

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh trường Đại học

Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo mọi điều kiện về mặt thời gian, luôn động viên khích lệ tôi trong quá trình học tập

Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn yêu thương, ủng hộ, động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

để tôi có được kết quả như ngày hôm nay

Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2012

Học viên

Chu Thị Hoa

Trang 3

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

- Sorbitol

Trang 4

Tình hình nghiên cứu chitinase trên thế giới

Đặc điểm nuôi cấy của chủng vi khuẩn KNUC213 trên môi

các trường thạch khác nhau

Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa của chủng KNUC213

khi sử dụng kit API 50 CHB sau 48 giờ nuôi cấy ở 37C

Ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ muối, pH đến khả năng

phát triển của chủng B licheniformis KNUC213

Kết quả so sánh độ tương đồng trình tự amino acid của

endochitinase từ B licheniformis KNUC213 (AEQ55312)

với các trình tự amino acid của chitinase tương ứng từ các

chủng B licheniformis khác được đăng ký trên GenBank

(NCBI)

So sánh hoạt tính enzyme chitinase của các chủng nghiên

cứu tại các thời điểm khác nhau

Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính rCHI của chủng

Trang 5

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 CHITIN 3

1.1.1 Cấu trúc hóa học của chitin 3

1.1.2 Vai trò và ứng dụng của chitin 4

1.2 CHITINASE 5

1.2.1 Giới thiệu về chitinase 5

1.2.2 Cơ chế thủy phân chitin 5

1.2.3.2 Dựa vào phản ứng phân cắt 6

1.2.3.3 Căn cứ vào cấu trúc phân tử 7

1.2.4 Cấu trúc phân tử chitinase 8

1.2.5 Nguồn thu nhận chitinase 9

1.2.5.1 Chitinase từ thực vật 9

1.2.5.2 Chitinase từ động vật 10

1.2.5.3 Chitinase từ vi sinh vật 10

1.2.5.4 Chitinase từ vi sinh vật tái tổ hợp 11

1.2.6 Vai trò và ứng dụng của chitinase 12

1.2.7 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của chitinase 13

1.2.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 13

1.2.7.2 Ảnh hưởng của pH 14

1.2.7.3 Ảnh hưởng của ion kim loại 14

1.2.8 Tình hình nghiên cứu chitinase trên thế giới và Việt Nam 15

Trang 6

1.2.8.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15

1.2.8.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 17

1.3 BIỂU HIỆN CHITINASE TRONG PICHIA PASTORIS 18

1.3.1 Đặc điểm của hệ biểu hiện P pastoris 18

1.3.2 Vector biểu hiện ở pPICZA 20

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 VẬT LIỆU 22

2.1.1 Các chủng sinh vật và plasmid 22

2.1.2 Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu 22

2.1.3 Các dung dịch sử dụng và môi trường nghiên cứu 22

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn KNUC213 24

2.2.2 Tách DNA tổng số của vi khuẩn Bacillus licheniformis KNUC213 25

2.2.3 Khuếch đại gen chi mã hóa chitinase của B licheniformis KNUC21325 2.2.4 Điện di DNA trên gel agarose 27

2.2.5 Tinh sạch sản phẩm PCR 27

2.2.6 Cắt và ghép nối gen 27

2.2.7 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli bằng phương pháp sốc nhiệt 28

2.2.8 Tách chiết plasmid từ vi khuẩn 29

2.2.9 Giải trình tự gen chi 29

2.2.10 Thiết kế vector biểu hiện gen chi trong P pastoris 30

2.2.11 Biến nạp vector tái tổ hợp vào P pastoris X33 bằng phương pháp xung điện 30 2.2.12 Biểu hiện rCHI 31

2.2.13 Tách chiết enzyme ngoại bào 32

2.2.14 Điện di protein trên gel polyacrylamide-SDS 32

2.2.15 Xác định hoạt tính của enzyme chitinase 32

2.2.16 Xác định đặc tính của rCHI 34

Trang 7

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN KNUC213 36

3.1.1 Đặc điểm nuôi cấy 36

3.1.2 Đặc điểm hình thái tế bào 37

3.1.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 37

3.2 TÁCH DÒNG GEN chi MÃ HÓA CHITINASE CỦA CHỦNG B licheniformis KNUC213 40

3.2.1 Tách DNA tổng số 40

3.2.2 Khuếch đại gen chi bằng kỹ thuật PCR 40

3.2.3 Tách dòng gen chi trong vector pJET1.2/blunt 41

3.2.4 Giải và phân tích trình tự gen chi của B licheniformis KNUC213 43

3.3 BIỂU HIỆN GEN chi MÃ HÓA CHITINASE TỪ CHỦNG B licheniformis KNUC213 TRONG P pastoris X33 45

3.3.1 Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA::chi 45

3.3.2 Tạo chủng P pastoris tái tổ hợp có khả năng biểu hiện rCHI 46

3.3.3 Biểu hiện rCHI bởi chủng P pastoris Y2 48

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 51

3.4.2 Ảnh hưởng của pH 52

3.4.3 Ảnh hưởng của ion kim loại 54

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

KẾT LUẬN 56

KIẾN NGHỊ 57

Phụ lục 1: Sơ đồ cấu trúc plasmid pJET1.2/blunt 62

Phụ lục 2: Sơ đồ cấu trúc plasmid pPICZA 63

Phụ lục 3: Khả năng sử dụng các nguồn cacbon của chủng Bacillus licheniformis KNUC213 65

Phụ lục 4: Trình tự gen chi của chủng Bacillus licheniformis KNUC213 66

Trang 8

MỞ ĐẦU

Chitin là polyme sinh học không phân nhánh, được cấu thành từ các đơn vị N-acetyl D-glucosamin (GlcNAc) thông qua liên kết β-(1,4)-glucozit Chitin rất phổ biến, phân bố rộng rãi trong tự nhiên chỉ sau cellulose và đóng vai trò là polysaccharide cấu trúc của các sinh vật như: thành tế bào của nấm, khung vỏ ngoài của động vật chân đốt, vỏ ngoài của các loài giáp xác và giun tròn Một trong những phương pháp chuyển hóa chitin tạo các dẫn xuất mạch ngắn chitin-oligosaccharide có giá trị kinh tế và ứng dụng cao, an toàn đối với con người và môi trường là sử dụng enzyme chitinase

Chitinase (EC 3.2.1.14) là enzyme phân hủy cơ chất chitin không hòa tan trong nước thành các sản phẩm chitooligosaccharide hòa tan thông qua quá trình thủy phân liên kết β-(1,4)-glucozit Hiện nay, chitinase được ứng dụng chủ yếu trong sản xuất chitooligosaccharide, nano-chitin, N-acetyl D-glucosamine Đây là những sản phẩm giá trị ứng dụng cao và được sử dụng trong thực phẩm, nông nghiệp, y dược, kháng nấm và côn trùng Ngoài ra, chitinase còn được sử dụng như thuốc trừ sâu sinh học trong nông nghiệp nhờ khả năng phân hủy chitin cấu trúc trong thành tế bào của nấm, côn trùng gây bệnh và xử lý các chất thải giàu chitin

Theo các công bố trên thế giới, chitinase có thể thu nhận từ nhiều nhóm

vi sinh vật như: vi khuẩn (Serratia sp., Bacillus sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Pseudomonas sp., Alteromonas sp…), nấm sợi (Trichoderma sp.,

Gliocladium virens, Fusarium chlamydosporum, Trichothecium roseum, Stachybotry elegans, Talaromyces ﬂavus,…), xạ khuẩn (Streptomyces griseus, Str plicatus, Str lydicus…) Tuy nhiên, chitinase thu nhận từ các chủng tự

nhiên thường không ổn định, hoạt tính không cao, chứa nhiều loại chitinase khác nhau (nhóm exochitinase và endochitinase) ảnh hưởng đến phổ sản phẩm thủy phân chitin cũng như quy mô thu nhận và ứng dụng chitinase nhằm tạo ra các sản phẩm chuyển hóa của chitin

Trang 9

Hiện nay, nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đã nâng cao hiệu suất của quá trình sản xuất chitinase bằng cách tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ

hợp Cho đến nay gen chi mã hóa chitinase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác

nhau đã được biểu hiện thành công trong nấm men, vi khuẩn; trong đó hệ

thống biểu hiện trên nấm men Pichia pastoris đang được sử dụng rộng rãi do

có các đặc tính: nuôi cấy đơn giản, đạt sinh khối cao trên môi trường khoáng

rẻ tiền, dễ dàng nâng cấp quy mô sản xuất, dễ điều khiển hệ thống biểu hiện enzyme nhờ quá trình cảm ứng Xuất phát từ những tiềm năng ứng dụng của

chitinase và ưu điểm của hệ thống biểu hiện trên P pastoris, chúng tôi đã thực hiện đề tài: ―Tách dòng và biểu hiện gene mã hóa chitinase của B

licheniformis KNUC213 trong Pichia pastoris‖ nhằm nâng cao quá trình sinh

tổng hợp endochitinase có hoạt tính cao, tạo tiền đề cho sản xuất enzyme ở quy mô lớn

Đề tài được thực hiện tại phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam với các nội dung chính sau:

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn KNUC213 có hoạt tính chitinase nhằm khai thác nguồn gen

- Tách dòng và phân tích trình tự gen chi mã hóa chitinase của chủng B

Trang 10

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CHITIN

1.1.1 Cấu trúc hóa học của chitin

Chitin là polyme sinh học không phân nhánh, cấu thành từ các đơn vị N-acetyl D-glucosamine (GlcNAc) thông qua liên kết β-(1-4)-glycosyl (Hình 1.1) Chitin là một trong các polymer sinh học phổ biến nhất trong tự nhiên chỉ đứng sau cellulose (cấu trúc hóa học của chitin gần giống với cellulose)

và đóng vai trò là polysaccharide cấu trúc của các sinh vật như: thành tế bào của nấm, khung vỏ ngoài của động vật chân đốt, vỏ ngoài của các loài giáp xác và giun tròn Trong cấu trúc của chitin, nhóm (-OH) ở nguyên tử C2 được thay thế bằng nhóm axetyl amino (-NHCOCH3)

Liên kết β-(1-4)-glycosyl của mỗi đơn phân trong cấu trúc của chitin lệch nhau một góc 180o tạo nên mạch xoắn và loại liên kết này kém bền, dễ

bị cắt đứt bởi tác nhân có tính axit hay enzyme [7] Cấu tạo hóa học của chitin được thể hiện trong hình 1.1 Công thức phân tử của chitin: (C8H13O5N)n, Khối lượng phân tử: (203,09)n với thành phần các nguyên tố:

C = 47,29%; H = 6,4%; O = 39,4%; N = 6,91%

Hình 1.1 Công thức cấu tạo hóa học của chitin

Các nghiên cứu nhiễu xạ sử dụng tia X cho thấy, chitin tồn tại dưới ba dạng α-, β- và γ-chitin do sự khác nhau về sắp xếp của các nhánh phân tử bên trong tinh thể chitin Trong α-chitin, các nhánh được sắp xếp theo hướng đối song (antiparallel), β-chitin gồm các nhánh song song và γ-chitin được hình thành từ hỗn hợp hai loại α-chitin và β-chitin Trong ba loại trên thì α-chitin là

Trang 11

phổ biến và được ứng dụng nhiều nhất [26] Tất cả các dạng chitin đều có mặt trong thành phần của vỏ tôm, trong các loài nhuyễn thể, vỏ cua cũng như trong biểu bì của các loại côn trùng… Dạng β-chitin, được tìm thấy trong protein của mực ống [2]

1.1.2 Vai trò và ứng dụng của chitin

Chitin và các dẫn xuất chitin/chitosan oligosaccharide và glucosamine… có nhiều đặc tính quý như: có hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, có khả năng tự phân huỷ sinh học cao, không gây dị ứng, không gây độc hại cho người và gia súc, có khả năng tạo phức với một số kim loại như:

D-Cu2+, Ni2+, Co2+ Trong số đó D-glucosamine là loại monome có tính năng

ưu việt được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp dược do khả năng tăng cường hấp thụ kháng sinh vào máu cũng như góp phần trong điều trị các bệnh viêm khớp và viêm nang khối u [8] Ngoài ra D-glucosamine còn là vật liệu ban đầu để điều chế các chất trung gian D-arabrinose và axit D-arabonic cần thiết để sản suất riboflavin và vitamin B6 Do vậy chitin và một số dẫn xuất của chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: xử lý nước thải và bảo vệ môi trường, dược học và y học, nông nghiệp, công nghiệp, công nghệ sinh học…

Do chitin là sản phẩm polyme tự nhiên nên đặc trưng chung của chitin

là không độc, có tính chất tạo màng, tạo sợi, hấp thụ các ion kim loại, làm đông các dịch huyền phù có chứa các chất hòa tan và các đặc tính sinh học đặc biệt khác Những đặc tính sinh học, hóa lý của chitin mở ra những hướng ứng dụng mới và được xem là các polyme sinh học quan trọng, có nhiều tiềm năng sử dụng cao hơn xelluloza trong rất nhiều lĩnh vực [27] Ngoài ra, sự có mặt của nhóm N-acetyl trong chitin cũng mở ra nhiều hướng mới trong lĩnh vực tổng hợp hóa học để tạo ra nhiều vật liệu polyme có cấu trúc phức tạp hơn và có các định hướng ứng dụng khác nhau [20]

Trang 12

1.2 CHITINASE

1.2.1 Giới thiệu về chitinase

Chitinase là enzyme xúc tác quá trình phân hủy cơ chất chitin không hòa tan trong nước thành các sản phẩm chitooligosaccharide hòa tan trong nước thông qua quá trình thủy phân liên kết glucosyl Chitinase có trong nhiều loại sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm mốc, côn trùng, thực vật và động vật Chitinase đóng các vai trò khác nhau trong các sinh vật như: là một phần trong hệ tiêu hóa của động vật không xương sống, phân hủy một phần

vỏ cutin trong các loài côn trùng và giáp xác; giúp thực vật kháng lại các loại nấm gây bệnh, là một phần trong các tác nhân gây bệnh của virus, giúp nấm phân hủy và thu nhận cơ chất Chitinase có mặt trong nhiều loại sinh vật bao gồm virus, vi khuẩn, nấm, côn trùng, thực vật bậc cao và các loại động vật Chitinase từ vi khuẩn đóng vai trò trong thu nhận dinh dưỡng và ký sinh

1.2.2 Cơ chế thủy phân chitin

Hình 1.2 Cơ chế thủy phân chitin bởi chitinase

Chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase) xúc tác quá trình phân hủy cơ chất chitin thành các sản phẩm chitooligosaccharide hòa tan trong nước thông qua quá trình thủy phân liên kết β-1,4- glycosyl giữa C1 và C4 của hai phân tử N -acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong phân tử chitin (Hình 1.2)

Trang 13

1.2.3 Phân loại chitinase

1.2.3.1 Dựa vào trình tự amino acid

Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại chitinase thành 5 nhóm:

- Nhóm I: Là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycine hoặc prolin ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết) Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác

- Nhóm II: Là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase ở nhóm I Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn

- Nhóm III: Trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II

- Nhóm IV: Là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I

- Nhóm V: Dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa

ở thực vật bậc cao

1.2.3.2 Dựa vào phản ứng phân cắt

Enzyme phân giải chitin được phân loại thành 3 loại: endochitinase, chitin-1,4-β-chitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucosamineidase (exochitinase)

- Endochitinase (EC 3.2.1.14): là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharide

- Chitin-1,4- β-chitobiosidase: là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các dimer chitobiose

Trang 14

- N-acetyl- β-D-glucosamineidase (exochitinase): là enzyme tiếp tục phân cắt chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-glucosamine

1.2.3.3 Căn cứ vào cấu trúc phân tử

Chitinase được sắp xếp thành ba họ glycohydrolase 18 glycohydrolase

19 và glycohydrolase 20

- Họ glycohydrolase 18: Là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, cấu trúc không gian của một số chitinase thuộc họ glycohydrolase 18 đã được

nghiên cứu bao gồm chitinase vi khuẩn (Serratia marcascens) và chitinase

thực vật Tâm hoạt động của các enzyme này tạo thành từ 8 sợi xoắn α/β cuộn tròn Sợi số 8 của phiến cuộn vào bên trong cấu trúc hình nhộng với vòng xoắn thể hiện như một chiếc nhẫn hướng ra ngoài (Hình 1.3) Các chitinase thuộc họ glycohydrolase 18 được thu nhận từ các chủng vi sinh vật như:

Aeromonas hydrophila, B circularis, Trichoderma harzianum, Serratia marcescens…

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc không gian của enzyme chitinase Serratia

marcescens

- Họ glycohydrolase 19: Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu

ở thực vật như: cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu

hà lan (Pisum sativum), ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Str griceus, vi khuẩn

Haemophilus influenzae… Các loại chitin thuộc họ 19 có cấu trúc hình cầu

với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển

Trang 15

- Họ glycohydrolase 20: Họ glycohydrolase 20 bao gồm Glucosamine acetyl hexosaminidase có nguồn gốc từ vi khuẩn và người

β-N-acetyl-D-1.2.4 Cấu trúc phân tử chitinase

Chitinase là enzyme quan trọng được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực khác nhau như y học, công nghiệp, nông nghiệp và nghiên cứu Nhiều

nghiên cứu gen chi mã hóa chitinase đã được công bố, và tập trung chủ yếu vào các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus với kích thước gen 1731 - 2388 bp

(Bảng 1.1), đây là những tiền đề cơ bản để tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ hợp có hiệu suất biểu hiện enzyme cao

Bảng 1.1 Gen chi mã hóa chitinase từ các chủng Bacillus licheniformis

Trang 16

Hình 1.4 Mô hình cấu trúc không gian của chitinase Hodeum vungare

Chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân

tử khoảng 30 kDa Ở loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương (cá, lưỡng

cư, thú) chitinase có trọng lượng phân tử cao vào khoảng 120 kDa Giá trị pI chitinase có thay đổi từ 3,0-10,0 ở thực vật bậc cao và tảo; pI từ 4,7-9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm, cá và 3,5-8,8 ở vi sinh vật Chitinase tách chiết từ

lúa mạch (Hodeum vulgare) đã được tinh thể hóa và phân tích cấu trúc bằng

tia X (Hình 1.4 )

1.2.5 Nguồn thu nhận chitinase

Enzyme chitinase hiện diện ở hầu hết các gi ới sinh vật như: vi sinh vật, thực vật hay trong các loại động vật không xương sống, động vật có xương sống [19]

1.2.5.1 Chitinase từ thực vật

Chitinase tham gia vào cơ chế tự vệ của thực vật chống lại các nấm kí sinh gây bệnh cho cây trồng Người ta đã quan sát thấy chitinase tách chiết từ cây cần tây có khả năng ức chế sợi nấm phát triển Tuy nhiên, một số tác giả khác cho rằng chitinase còn có vai trò khác: tham gia vào quá trình hình thành

phôi Những thực vật bậc cao có khả năng tạo chitinase như: cao su (Hevea

brasiliensis), thuốc lá (Nicotiana sp.), lúa mạch (Hordeum vulgare) cà rốt,

đậu nành (hạt), khoai lang (lá) và đặc biệt một số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp chitinase

Trang 17

1.2.5.2 Chitinase từ động vật

Từ một số động vật nguyên sinh, từ các mô và tuyến khác nhau trong

hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật không xương như: ruột khoang, giun tròn,

thân mềm, chân đốt (trong dịch ruột của ốc sên Helix aspersa), có thể thu

nhận được chitinase Đối với động vật có xương sống, chitinase được tiết ra

từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ Ngoài ra, enzyme chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển

và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài của chúng trong quá trình biến thái hay lột xác Tuy nhiên, hoạt tính của chitinase thu từ thực vật, động vật

còn chưa cao, vì vậy việc thu nhận chitinase chủ yếu vẫn từ vi sinh vật

1.2.5.3 Chitinase từ vi sinh vật

Chitinase được tạo ra bởi các loài nấm sợi thuộc các chi Trichoderma,

Aspergillus, Calvatia và cả ở các nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus

Chitinase từ nấm cũng đóng vai trò quan trọng về mặt dinh dưỡng, hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi do chitin là thành phần chính của vách tế bào nấm Chitinase còn giữ vai trò chính trong hoạt động ký sinh nấm nhằm đối kháng lại các loài nấm gây bệnh thực vật

Ngoài nấm, chitinase được tìm thấy trong vi khuẩn như

Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus

Chitinase có thể là một loại enzyme cảm ứng, trong các môi trường nuôi cấy

vi khuẩn khi bổ sung chitin đã tăng khả năng sinh tổng hợp, đồng thời ổn định hoạt tính chitinase sau quá trình tách chiết Ngoài ra, vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân giải chitin trong môi trường tạo nguồn cacbon cung cấp cho hoạt động sinh trưởng và phát triển Tuy nhiên, chitinase từ nấm và vi khuẩn biển được các nhà khoa học quan tâm hơn cả vì có khả năng chịu pH, nồng độ

Trang 18

muối, hoạt tính cao, đặc hiệu với nguồn cơ chất và sinh ra trong thời gian ngắn

1.2.5.4 Chitinase từ vi sinh vật tái tổ hợp

Những hệ biểu hiện phổ biến nhất hiện nay bao gồm E coli, B subtilis, S cerevisiae, P pastoris, A niger và tế bào động vật Mỗi hệ biểu

hiện có những ưu điểm và giới hạn riêng, tuỳ thuộc sản phẩm protein mà cần

lựa chọn hệ biểu hiện phù hợp B subtilis có khả năng biểu hiện và bài tiết rất tốt protein có nguồn gốc vi khuẩn ra ngoài môi trường nuôi cấy E coli có thể

biểu hiện hầu hết các protein kích thước vừa phải, không quá kỵ nước hay

chứa nhiều gốc cystein Tuy nhiên, con đường tiết protein của E coli có nhiều giới hạn Hệ biểu hiện E coli và B subtilis đều có chung một nhược điểm là

mặc dù có khả năng sản xuất protein của sinh vật nhân chuẩn ở mức độ cao, nhưng những protein này thường không mang họat tính hoặc không hòa tan [11] Hệ biểu hiện trong tế bào động vật có thể biểu hiện các nhóm protein khác nhau và có ý nghĩa đặc biệt trong y dược học, tuy nhiên quá trình chọn lọc, nhân dòng và nuôi cấy tế bào phức tạp hơn nhiều so với cách sử dụng vi sinh vật Hệ biểu hiện trong nấm men là một giải pháp hữu hiệu khắc phục những giới hạn trên

Nấm men là hệ biểu hiện đang được sử dụng rộng rãi hiện nay bởi nó

có nhiều ưu điểm Chúng là sinh vật nhân chuẩn được nghiên cứu rất kỹ về mặt di truyền, có khả năng tích hợp các gen lạ của các sinh vật nhân thực khác vào genome của mình Ngoài ra, chúng là sinh vật nhân chuẩn duy nhất

có khả năng thực hiện được các thao tác kỹ thuật di truyền phân tử dễ dàng

như ở E coli và có khả năng phát triển rất mạnh trong môi trường nuôi cấy

Đặc biệt, ở nấm men có quá trình sửa đổi sau dịch mã hoàn thiện để trở thành dạng protein hoạt động và có khả năng tiết protein ra ngoài môi trường hiệu

quả [11] S cerevisiae là chủng nấm men đầu tiên được sử dụng để biểu hiện gen Tuy vậy, S cerevisiae cũng có một số giới hạn do chưa có hệ vector biểu

hiện hữu hiệu, các plasmid dùng để biểu hiện thường là d ạng đa phiên bản

Trang 19

(multi-copy) nên rất dễ bị đào thải [11] Từ những hiểu biết kỹ lưỡng về hệ

biểu hiện S cerevisiae, hệ biểu hiện P pastoris đã ra đời và khắc phục được

những nhược điểm trên

Nhiều tác giả trên thế giới đã nâng cao khả năng sinh tổng hợp các chủng tự nhiên bằng cách tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ hợp đã được tập

trung nghiên cứu, một số công bố đã tạo thành công các chủng Escherchiasa

coli, Pichia pastoris tái tổ hợp mang gen mã hóa chitinase từ các nguồn sinh

vật khác nhau như: kết quả phân tích và giải trình tự gen chi từ Bacillus

lichenif ormis CBFO S-03 cho thấy, trình tự gen chi bao gồm 1797 bp, khung

đọc mở của gen bắt đầu với một codon khởi đầu ATG và kết thúc bằng codon TAA, mã hóa cho 598 amino acid, protein có khối lượng phân tử là 62 kDa,

có nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt độ của enzyme tương ứng là 55oC và pH 9,0 [25] Năm 2008, Cemal và cộng sự tiến hành phân lập, biểu hiện, tinh

sạch và nghiên cứu đặc điểm của enzyme chitinase từ chủng Bacillus

licheniformis A1, kết quả phân tích trình tự gen chi có kích thước 1779 bp mã

hóa cho 592 amino acid, có độ tương đồng cao (99%) so với trình tự gen chiB

từ Bacillus licheniformis được đăng kí trên Genbank có mã số AY205293,

khối lượng phân tử là 71 kDa, có hoạt tính tối ưu ở nhiệt độ 65oC và pH 6,0

1.2.6 Vai trò và ứng dụng của chitinase

Chitinase đã và đang được quan tâm và nghiên cứu nhiều trên thế giới

do có khả năng ứng dụng rộng lớn Chitinase được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau trong y học, công nghiệp, nông nghiệp và nghiên cứu Đánh dấu các hạt vàng trên chitinase và chitosanase giúp các nhà khoa học định vị chitin và chitosan trong nghiên cứu cấu trúc, hóa học tế bào và miễn dịch học Trong công nghiệp, chitinase được sử dụng để sản xuất các loại chitooligosaccharide, N-acetyl D-glucosamine có chức năng kháng khuẩn, kích thích enzyme lysozym hoạt động và tăng cường miễn dịch Ngoài ra, chitinase được ứng dụng tạo ra các protein đơn bào; tạo ra các thể nguyên

Trang 20

sinh (protoplast) của nấm mốc, nấm men; diệt các nấm gây bệnh; xử lý các chất thải giàu chitin; kiểm soát qúa trình lây nhiễm của mầm gây bệnh sốt rét

Để thu được các loại chitin phân tử lượng thấp có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau Bằng phương pháp hóa học, chitin bị phân cắt bởi acid hữu cơ hay vô cơ cho hiệu suất thấp, chi phí cao, đặc biệt còn gây ô nhiễm môi trường Bên cạnh đó, mức độ an toàn của sản phẩm cũng là vấn đề đáng lưu ý khi ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm, y dược… Việc sử dụng phương pháp thủy phân bởi chitinase để phân cắt chitin là phương pháp an toàn nhất hiện nay Sản phẩm thu hồi sau phản ứng thủy phân bởi enzyme an toàn, hiệu suất thu hồi cao, không gây ô nhiễm môi trường

1.2.7 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của chitinase

1.2.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme Ở nhiệt

độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt độ giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới 0oC hoạt độ của enzyme giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp Theo những nghiên cứu trước đây, nhiệt độ tối ưu cho chitinase ở vi sinh vật hoạt động là 40oC, ngoại trừ chitinase của

Aspergillus niger hoạt động trên cơ chất là glycol chitin có nhiệt độ tối thích

là 50oC Tùy theo nguồn gốc thu nhận mà chitinase có thể có những nhiệt độ

tối ưu khác nhau Chitinase từ B licheniformis phân lập từ suối nước nóng có

khả năng hoạt động ở nhiệt độ 80oC, tuy nhiên chitinase từ côn trùng (tằm ) hoạt động kém ở nhiệt độ 40oC có thể do côn trùng phát triển ở nhiệt độ 25oC nên nhiệt độ tối ưu của chitinase từ côn trùng không cao Chitinase từ chủng

vi khuẩn biển có nhiệt độ tối ưu là 50oC như: Salinivibrio costicola,

Alteromonas [29], Vibrio alginolyticus và chitinases từ Aeromonas sp 10S-24

[9] Chitinase tái tổ hợp từ chủng B circulans 4.1, Aeromonas sp No 10S

-24 có nhiệt độ tối ưu là 50oC [20]

Trang 21

1.2.7.2 Ảnh hưởng của pH

Hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào pH môi trường, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của các ion H+ và OH- cũng ảnh hưởng rõ rệt đến tốc độ phản ứng của enzyme Giá trị pH tối ưu của chitinase dao động từ 4 đến 9 đối với các chitinase ở thực vật bậc cao và tảo, ở động vật là 4,8 đến 7,5 và ở vi sinh vật là 3,5 đến 8,0 pH tối thích của chitinase còn phụ thuộc vào cơ chất

sử dụng khi phản ứng Đa số các chitinase đa được nghiên cứu có pH tối thích

khoảng 5,0 khi sử dụng cơ chất là chitin như chitinase của Streptomyces

grieus có pH tối ưu là 6,3 Hầu hết các chitinase của vi khuẩn biển có hoạt

tính cao hơn ở pH kiềm (pH = 8,0) cũng với cơ chất là chitin [29] Tuy nhiên,

một số chitinase tái tổ hợp như chitinase từ A caviae biểu hiện hoạt tính tối

ưu ở pH 6,2 - 6,5 [9], hay như từ B circulans 4.1, B sphaericus J1-1 có pH tối ưu là 7,0 [20] và chủng B licheniformis CBFOS-03 có pH tối ưu là 9 [25]

1.2.7.3 Ảnh hưởng của ion kim loại

Các ion kim loại làm biến đổi vận tốc phản ứng của enzyme, chúng có thể kích thích hoặc ức chế hoạt động của enzyme Một số ion kim loại có khả năng liên kết phối trí với các nguyên tử oxy hoặc nguyên tử nitơ của nhóm cacboxyl, amine hoặc peptide của các enzyme, làm cho trung tâm hoạt động của enzyme có độ bền rất lớn, đồng thời các ion kim loại này tạo ra các cấu trúc thuận lợi cho enzyme hoặc làm cho enzyme kết gắn được với cơ chất, do

đó tốc độ thủy phân của enzyme được tăng lên Chitinase từ chủng Bacillus

sp DAU101 bị ức chế mạnh mẽ bởi Zn2+, Cu2+ và EDTA Tuy nhiên, hoạt tính của enzyme này lại tăng khi bổ sung các ion Co2+, Mg2+, Ca2+ và Ba2+, những cation này có thể bảo vệ các enzyme chống lại sự biến tính nhiệt và do

đó duy trì hoạt động của enzyme ở nhiệt độ cao [32]

Các ion kim loại nặng ở nồng độ gây biến tính có thể kìm hãm không thuận nghịch hoạt độ của enzyme Các ion kim loại như: Hg+, Ag+ là những chất ức chế hoạt tính enzyme chitinase Một số nghiên cứu cho thấy, chất tẩy rửa và EDTA gây ức chế hoạt tính của chitinase thu nhận từ chủng

Trang 22

Enterobacter sp NRG4 và exochitinase Bacillus thuringiensis subsp [32]

Hoạt tính chitinase từ chủng Alcaligenes xylosoxydans bị ức chế 25% khi có

mặt ion Cu2+ ở nồng độ 5 mM/l, tuy nhiên không bị ảnh hưởng bởi các ion

Ca2+, Ba2+ và Mg2+ ở cùng nồng độ Hoạt tính của chitinase từ chủng

Enterobacter sp G-1 không bị ảnh hưởng bởi ion Ca2+ Chitinase từ

Enterobacter aerogenes được kích hoạt bởi các ion Zn2+, Ca2+, Ba2+ và Mn2+

và bị ức chế mạnh mẽ bởi Mg2+ và Co2+

1.2.8 Tình hình nghiên cứu chitinase trên thế giới và Việt Nam

1.2.8.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Tiềm năng ứng dụng rộng lớn của chitinase đã và đang được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu nhiều trên thế giới Rất nhiều nước tiến hành nghiên cứu quá trình sản xuất chitinase như: Nhật, Canada, Mỹ, Hàn Quốc… được tổng hợp trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Tình hình nghiên cứu chitinase trên thế giới

Nghiên cứu hoạt tính

enzyme chitinase từ khoai

lang

Xác định khối lượng phân tử chitinase khoảng 16 kDa, pH tối ưu là 5,0, nhiệt độ tối ưu trong 25oC

Hou WC và cs,

1998 Viện hàn lâm Sinica, NanKang, Đài Loan [13]

Tinh sạch và xác định đặc

điểm của chitinase từ chủng

Streptomyces sp M-20

Trọng lượng phân tử của chitinase sau tinh sạch là 20,0 kDa

Kim JK và cs,

2003 Đại học Soonchunhyang, Cheonan, Hàn Quốc [16]

Xác định khả năng kháng

nấm của chitinase từ chủng

Xác định khối lượng phân tử chitinase là 70 kDa

Chien-Jui Huang và cs,

Trang 23

Bacillus cereus 28-9 Nghiên cứu biểu hiện và tinh

sạch chitinase từ E coli tái tổ

hợp

2004 Đại học Quốc Gia Đài Loan [7]

Tinh sạch và nghiên cứu đặc

tính của chitinase chịu nhiệt

từ Bacillus licheniformis

SK-1

Khối lượng phân tử của chitinase sau tinh sạch là 72 kDa, điểm đẳng điện (pI) là 4,62 Enzyme hoạt động trong dải nhiệt độ từ 40-70oC

và pH 4-9

Sanya K và Rath P, 2009 [24]

Tinh sạch và nghiên cứu đặc

điểm của của chủng

Bacillus circulans No41

trong Escherichia coli

Biểu hiện thành công gen chi trong E coli M15 Khối

lượng phân tử của chitinase

là 66 kDa Chitinase hoạt động tối ưu ở pH 7,0 và nhiệt

Chitinase có khối lượng phân

tử khoảng 58 kDa điểm đẳng điện là 4.47 pH tối ưu là 5,8

và nhiệt độ tối ưu là 45oC

Yan-Jun Wang,

và cs, 2009 [32]

Nhu cầu sử dụng chitinase có xu hướng gia tăng tại nhiều nước trên thế giới Tuy nhiên, giá thành sản xuất chitinase cao đã làm giới hạn khả năng ứng dụng, do vậy để sản xuất chitinase trong công nghiệp cần có nhiều phương pháp khác nhau: tuyển chọn chủng giống, thành phần môi trường, điều kiện lên men… để có thể sản xuất enzyme nhanh, giá thành rẻ

Trang 24

1.2.8.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Hiện nay, việc nghiên cứu các quy trình và sản xuất chitinase, chitooligosaccharide, N-acetyl glucosamine đang được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm Các phương pháp sản xuất chitooligosaccharide và N-acetyl glucosamine như thủy phân bằng axit dần được thay thế bằng phương pháp sử dụng chitinase và chitosanase Bởi ưu điểm an toàn, áp dụng quy mô sản xuất lớn, hiệu suất thu hồi khá cao Ngoài ra, việc điều chế glucosamine từ chitin làm thuốc chống đau xương khớp là một vấn đề có ý nghĩa quan trọng trong y dược, điều chế bằng phương pháp dùng chitinase cùng với chitosanase để thủy phân chitin thành glucosamine có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với phương pháp hóa học [8] Những nghiên cứu trong những năm gần đây do các tác giả Nguyễn Đinh Nga, Trần Cát Đông, Nguyễn Văn Thanh (ĐH Y dược TP.HCM – khoa Dược) và Đinh Minh Hiệp (Sở KH&CN TP.HCM) thực hiện

khảo sát chitinase chiết tách từ lá khoai lang và từ Trichoderma ở 2 lĩnh vực: mức độ kháng và hiệu lực gây tăng tác động của clotri-mazol trên Candida

albicans Kết quả bước đầu của nghiên cứu này cho khả năng mở ra một triển

vọng của hướng phối hợp chitinase với thuốc kháng nấm trong việc điều trị bệnh nhiễm vi nấm da, niêm mạc qua đó giúp rút ngắn được thời gian, tăng hiệu quả điều trị

Ngoài việc ứng dụng các kỹ thuật truyền thống, một con đường khác là

sử dụng công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất enzyme, đây là hướng đi hiện đại phù hợp để sản xuất enzyme ở qui mô công nghiệp mà các nước tiên tiến đã và đang thực hiện Hướng đi này giúp nâng cao năng suất sinh tổng hợp enzyme đồng thời lượng enzyme thu được dễ dàng tinh sạch hơn khi sử dụng chủng tự nhiên Tại Việt Nam, trong những năm gần đây cũng đã có một

số nghiên cứu tách dòng và tạo chitinase tái tổ hợp bởi Phí Quyết Tiến và cộng sự, Viện công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam,

có nhiều công trình công bố thành công trong việc biểu hiện chitinase tái tổ

hợp có nguồn gốc từ vi sinh vật trong Escherichia coli Ngoài ra, PGS TS

Trang 25

Trương Nam Hải và cộng sự 1999, đã tiến hành nghiên cứu đặc tính kháng nấm của chitinase và sản xuất thành công chitinase tái tổ hợp có nguồn gốc từ

thực vật trên Escherichia coli

Năm 2008, Trần Đình Toại và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sản xuất glucosamine từ vỏ tôm để điều trị bệnh viêm khớp Kết quả, nhóm tác giả đã nghiên cứu tìm được quy trình thu nhận chitin từ đầu, vỏ tôm phế liệu bằng phương pháp sinh học và tạo thành công glucosamine

Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu điều kiện lên men chitinase từ các chủng vi sinh vật tự nhiên được các nhà khoa học tại Việt Nam công bố và thu được nhiều kết quả khả quan Năm 2010, Nguyễn Phương Nhuệ và cộng

sự Viện Công nghệ sinh học đã công bố công trình tuyển chọn và nghiên cứu

khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase từ chủng B circulans HT11 để ứng

dụng thu nhận chitooligosaccharide chức năng

Nhìn chung, có thể tổng kết các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào sàng lọc và nghiên cứu đặc điểm các vi sinh vật tự nhiên có khả năng sinh chitinase Các nghiên cứu trên được thực hiện tại Viện bảo vệ thực vật – Bộ

NN và PT nông thôn (nhóm nghiên cứu của GS Phạm Thị Thùy), trường Đại học Cần Thơ-Bộ Giáo dục (nhóm nghiên cứu của TS Trang Sĩ Trung), Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội (nhóm nghiên cứu của TS Lê Thanh Hà), Trường Đại học Quốc gia Hà Nội-Bộ Giáo dục (nhóm nghiên cứu của PGS

TS Dương Văn Hợp) Gần đây, nhóm nghiên cứu của PGS TS Quyền Đình Thi (Viện Công nghệ sinh học-Viện KHCN Việt Nam) đã nghiên cứu tách dòng và biểu hiện chitinase có nguồn gốc từ nấm mốc nhằm ứng dụng trong phòng trừ các vi sinh vật gây hại trong nông nghiệp

1.3 BIỂU HIỆN CHITINASE TRONG PICHIA PASTORIS

1.3.1 Đặc điểm của hệ biểu hiện P pastoris

Hiện nay có bốn hệ tế bào sinh vật chủ thường được sử dụng để biểu

hiện gen, bao gồm vi khuẩn (E coli; B subtilis), nấm men (S cerevisiae; P

pastoris), tế bào thực vật và tế bào động vật Ngoài ra còn có thể biểu hiện

Trang 26

trên một vài loại nấm sợi nhưng chưa có hiệu quả cao Trong nghiên cứu này,

chúng tôi sử dụng hệ biểu hiện nấm men Pichia pastoris

P pastoris là một trong số không nhiều nấm men có khả năng sử dụng

methanol như nguồn cacbon duy nhất Ứng dụng của P pastoris trong biểu

hiện xuất phát từ việc khai thác promoter AOX, một promoter liên quan tới quá trình đồng hóa methanol Gen ngoại lai chứa trong plasmid tái tổ hợp có

khả năng tích hợp vào hệ gen của P pastoris nhờ quá trình tiếp hợp và trao

đổi chéo, do vậy, làm tăng tính ổn định của gen này trong tế bào chủ

P pastoris có khả năng tiết protein ngoại bào lớn và đã được sử dụng

để tạo ra nhiều protein của người, động vật và thực vật P pastoris có thể sinh

trưởng trong điều kiện nuôi cấy liên tục trong một thời gian dài và có khả năng lên men với mật độ tế bào cao Môi trường nuôi cấy không đắt tiền, chỉ bao gồm nguồn cacbon như glycerol và methanol, biotin, muối, nước Chúng

có thể sinh trưởng trên môi trường pH tương đối thấp và sử dụng nguồn cacbon là methanol mà hầu hết các vi sinh vật khác không sử dụng được Do

vậy, P pastoris nuôi cấy ít mẫn cảm với nhiễm của vi sinh vật từ bên ngoài

P pastoris có khả năng tổng hợp lượng lớn protein ngoại lai trong

peroxisome, thuận tiện cho việc vận chuyển và tiết protein Ngoài ra, P

pastoris không là tác nhân gây bệnh, không chứa virus trong tế bào và còn có

một promoter mạnh có thể kiểm soát chặt chẽ được bằng nguồn cacbon

Chính vì vậy, P pastoris thường được chọn để sản xuất các protein tái tổ hợp

dụng trong y học và công nghiệp thực phẩm

Nhiều kỹ thuật áp dụng cho nấm men S cerevisiae cũng có thể áp dụng cho nấm men P pastoris như biến nạp bằng cách tạo tế bào khả biến, cắt ghép

gen, tái tổ hợp gen Các gen his4, leu2, arg4, trp1 và ura3 của nấm men

Saccharomyces được biểu hiện trong các chủng Pichia khuyết dưỡng So với

S cerevisiae, P pastoris thuận lợi hơn trong quá trình gắn thêm các chuỗi

hydratcarbon vào các phân tử protein tiết (quá trình glycosyl hoá) Cả S

cerevisiae và P pastoris đều có khả năng glycosyl hoá vào một nhóm amin

Trang 27

bằng các gốc manose Tuy nhiên chiều dài của đoạn oligosaccharide gắn thêm

vào phân tử protein sau dịch mã ở P pastoris (8-14 gốc manose trên một chuỗi) ngắn hơn ở S.cerevisiae (10-50 gốc) Giống như S cerevisae, thể biến nạp ổn định của P pastoris có thể được tạo ra nhờ sự tái tổ hợp giữa đoạn

DNA được biến nạp với các vùng tương đồng trong genome Nhiệt độ sinh

trưởng của P pastoris khoảng 28-30C Nếu nhiệt độ trong môi trường nuôi cấy cao hơn 32C sẽ ảnh hưởng tới quá trình tiết protein, thậm chí dẫn đến chết tế bào [11]

1.3.2 Vector biểu hiện ở pPICZA

Hầu hết các vector biểu hiện trong P pastoris đều là plasmid được thiết

kế phù hợp để có thể tích hợp vào hệ gen của và P pastoris, chỉ một số ít hệ biểu hiện trong P pastoris được thực hiện trên plasmid Những plasmid này

đều chứa một khởi đầu sao chép Ori và một gen kháng kháng sinh để có thể chọn lọc các thể tái tổ hợp trên môi trường có chất kháng sinh Trong nghiên cứu này, sử dụng vector biểu hiện pPICZA là phương tiện chuyển gen chi vào nấm men P pastoris X33 Vector pPICZA có những thành phần không thể thiếu của một vector biểu hiện như: promoter mạnh, trình tự sao chép

(ori), vị trí khởi đầu phiên mã, tín hiệu kết thúc dịch mã, các trình tự đa cắt

nối (MCS) và các gen chỉ thị (Phụ lục 2) Tuy nhiên, hệ vector này có những

ưu điểm vượt trội so với các hệ vector biểu hiện khác đó là:

- 5’AOX1 promoter cho phép mức độ biểu hiện cao khi được cảm ứng bởi

methanol trong P pastoris Đây là promoter mạnh có nguồn gốc từ gen mã hóa cho alcohol oxidase ở P pastoris

- Đầu C với đuôi myc epitope cho phép phát hiện protein tái tổ hợp bởi kháng thể Anti-myc hoặc kháng thể Anti-myc-HRP

- Đầu C với đuôi polyhistidine cho phép tinh sạch protein tái tổ hợp sử dụng cột kim loại

Trang 28

- Chứa gen Sh ble, là gen kháng zeocin, thuận tiện cho việc sử dụng làm

yếu tố chọn chủng tái tổ hợp mang gen đích

- Có vùng đa nối với nhiều điểm nhận biết của các enzyme giới hạn, là trình tự nhận biết đặc hiệu của các enzyme giới hạn đƣợc đặt đúng khung đọc

để tiếp nối quá trình dịch mã với đoạn gen ngoại lai chèn vào

Trang 29

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Các chủng sinh vật và plasmid

Chủng vi khuẩn KNUC213 có hoạt tính endochitinase nhận từ bộ sưu

tập giống vi sinh vật phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học

Chủng Escherichia coli XL1-blue [∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173

endA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac] (Stratagene, Mỹ) được sử dụng để

nhân dòng gen Chủng nấm men Pichia pastoris X33 (Mut+) (Invitrogen, Mỹ)

được dùng làm chủng chủ để biểu hiện chitinase tái tổ hợp (rCHI)

Vector tách dòng pJET1.2/blunt (Invitrogen, Mỹ) được sử dụng để tách dòng gen (Phụ lục 1), vector pPICZA (Invitrogen, Mỹ) được sử dụng để

thiết kế vector biểu hiện gen chi trong P pastoris (Phụ lục 2)

2.1.2 Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu

Hóa chất: Sodium dodecyl sulfate (SDS), Tris-HCl, Ethylene diamine

tetra-acetic acid (EDTA) (BioLabs, Mỹ); Phenol, Methanol, Isoamylalcohol, EtBr, Glycerol, Ethanol, Chloroform, Ampicillin, Acrylamide, (Merck, Đức); agarose (Fluka, Đức); d-NTP (Fermentas, Mỹ), bộ kit tinh sạch DNA từ gel agarose và kit tinh sạch plasmid của Invitrogen (Mỹ)

Các loại enzyme XbaI, NotI, PmeI, T4 DNA ligase, RNAase, DNAase,

zymolyase, Taq DNA polymerase được mua của hãng Invitrogen, Mỹ

Thiết bị nghiên cứu: Máy PCR (GeneAmp® PCR System 9700,

Applied Biosystems, Mỹ), máy ly tâm lạnh (Biofuge fresco, Kendro, Đức); máy điện di, máy UV (PowerPac Basic, Bio-Rad, Mỹ); máy lắc ổn nhiệt (BSI-25R CPT, Mỹ) và một số thiết bị khác

2.1.3 Các dung dịch sử dụng và môi trường nghiên cứu

* Các dung dịch đệm sử dụng trong điện di protein trên gel polyacrylamide

có chứa sodium doecyl sulfate (SDS-PAGE)

Bis-Acrylamide 30%: cân 30 g acrylamide 99% và 0,8 g acrylamide, hòa tan trong 100 ml nước cất vô trùng, bảo quản ở 4oC Đệm

Trang 30

Tris 1,5 M (pH 8,8): Tris 0,75 M; 0,2% SDS và dùng HCl để chỉnh pH đến 8,8 Đệm Tris 0,5 M (pH 6,8): Tris 0,25 M; 0,2% SDS và dùng HCl để chỉnh

pH đến 6,8 SDS 10% (100 ml): cân 10 g SDS và bổ sung nước cất tới thể tích

100 ml

Đệm chạy điện di: Tris 0,05 M; glycine 0,192 M; 0,1% SDS

Dung dịch nhuộm gel: AgNO3 1%

APS 10%: cân 10 mg amonium persulfate hòa vào 900 mg nước cất Đệm xử lý mẫu 6X: 7 ml Tris-HCl 1M (pH 6,8); 3 ml glycerol 100%; 1

g SDS; 0,6 ml 2-Mercapto-ethanol; 1,2 mg Bromophenol

* Các dung dịch đệm sử dụng trong điện di DNA/RNA trên agarose gel

Dung dịch đệm TAE 50 lần (100 ml): 24,2% Tris-base; 5,71 ml acetic acid; 10 ml EDTA 0,5 M (pH 8)

Đệm tra mẫu (6X) (loading dye): 0,25% Bromophenol blue; 0,25% Xylen cyanol FF; 30% glycerol

Dung dịch nhuộm gel Ethidium bromide (EtBr) 0,5 µg/ml

* Môi trường

Môi trường MS1 (g.L-1

): Cao nấm men 5,0; K2HPO4.3H2O 2,0; KH2PO4 1,0; MgSO4 7H2O 0,7; NaCl 0,5; KCl 0,5; CaCl2 0,1; thạch 20,0; nước cất 1000 ml; pH 6,0

): Cao nấm men 5,0; K2HPO4.3H2O 2,0; KH2PO4 1,0; Glucose 2,0; MgSO4 7H2O 0,7; NaCl 0,5; KCl 0,5; CaCl2 0,1; thạch 20,0; nước cất 1000 ml; pH 6,0

): (NH4)2SO4 2,0; Glucose 5,0; K2HPO4.3H2O 2,0; KH2PO4 1,0; MgSO4 7H2O 0,7; NaCl 0,5; KCl 0,5; CaCl2 0,1; thạch 20,0; nước cất 1000 ml; pH 7,0

Môi trường Luria-Bertani (LB): 1% Tryptone, 0,5% cao nấm men, 0,5% NaCl, pH 7-7,2

Môi trường YPDS: 1% cao nấm men, 2% peptone, 2% glucose, 1M sorbitol, 100 g/ml zeocine

Trang 31

Môi trường BMGY: 1% cao nấm men, 1% peptone; 100mM potassium phosphate, pH 6,0; 1,34% YNB; 4x10-5% biotin; 1% glycerol

Môi trường BMMY: 1% cao nấm men, 1% peptone; 100mM potassium phosphate, pH 6,0; 1,34% YNB; 4x10-5% biotin; 0,5 % methanol

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn KNUC213

a) Đặc điểm nuôi cấy

Chủng vi khuẩn KNUC213 có hoạt tính chitinase cao được nuôi cấy trên các môi trường thạch LB, MS1, MS2, MS3 và nuôi trong 37o

C Hình thái khuẩn lạc và khả năng phát triển của vi khuẩn được quan sát sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy

b) Đặc điểm hình thái tế bào

Chủng vi khuẩn KNUC213 được nuôi trong môi trường lỏng MPA ở nhiệt độ 37oC trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 18  20 giờ

Tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy được cố định trên tiêu bản để quan sát hình dạng tế bào dưới kính hiển vi quét

c) Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

Để xác định khả năng phát triển của vi khuẩn ở các nồng độ muối khác nhau, vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường MPA bổ sung nồng độ NaCl tăng dần từ 1 ÷ 10 % ở 37oC Quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường sau 1 ÷ 3 ngày nuôi cấy

Để xác định dải nhiệt độ và pH thích hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn, chủng vi khuẩn KNUC213 được nuôi cấy trên môi trường MPA ở các nhiệt

độ khác nhau (22o

C; 30oC; 37oC và 45oC) và dải pH khác nhau (từ pH 3,0 ÷

pH 10,0) Quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường sau 1 ÷ 3 ngày nuôi cấy

d) Xác định đặc điểm sinh lý và sinh hóa bằng kit API 50CHB

Chủng vi khuẩn KNUC213 sau khi xác định đặc điểm hình thái cho kết quả là các chủng vi khuẩn Gram (+), tạo bào tử trên môi trường có bổ sung MnSO4 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn sử dụng bộ kit API 50CHB (bằng

Trang 32

phần mềm APILAB plus) Lấy 200 µl dịch huyền phù vi khuẩn bổ sung vào

10 ml môi trường API AUX Sau đó dịch môi trường khoáng có chứa vi khuẩn được bổ sung vào các giếng thử của bộ kit Dùng dầu parafin phủ kín lên bề mặt các giếng Đậy bộ kít và nuôi ở nhiệt độ 37C Đọc kết quả sau 24

và 48 giờ So sánh kết quả thu được với bảng chuẩn phân loại API bằng phần mềm APILAB plus

2.2.2 Tách DNA tổng số của vi khuẩn Bacillus licheniformis KNUC213

Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn theo phương pháp Sambrook và cộng sự [23] Lấy một khuẩn lạc vi khuẩn chuyển vào trong 10 ml môi trường

LB và nuôi cấy lắc với tốc độ 200 v/p ở 30C qua đêm Dịch nuôi cấy được ly tâm ở 5.000 v/p trong 5 phút Sinh khối tế bào được thu lại và hòa vào 1 ml đệm phá tế bào, lắc đều Hỗn hợp dịch được ly tâm ở 5.000 v/p trong 5 phút Sinh khối tế bào được hoà lại trong 0,4 ml TE và bổ sung lysozym (200

g/ml), trộn đều, ủ ở 37C trong 1 giờ Bổ sung 10 l proteinase K, ủ 80C trong 1 giờ Tiếp tục bổ sung 600 l phenol/chloroform, trộn đều Sau đó ly tâm hỗn dịch 13.000 v/p trong 5 phút để thu dịch nổi Thêm 600 l chloroform/isoamyl alcolhol (24:1 v/v) vào dịch nổi, trộn đều và ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút DNA ở pha trên được tủa lại bằng cách bổ sung 50

l Na2CO3 3 M và 1 ml cồn tuyệt đối rồi trộn đều Ủ hỗn hợp ở -20C trong 1 giờ Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút để thu DNA kết tủa ở đáy ống Rửa lại DNA bằng 0,5 ml cồn 70 % Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút thu lại DNA và làm khô bằng máy làm khô mẫu Bảo quản mẫu ở -20C

2.2.3 Khuếch đại gen chi mã hóa chitinase của B licheniformis

KNUC213

Dựa vào trình tự và các vị trí giới hạn của gen chi từ chủng B

licheniformis KNUC213, sử dụng phần mềm Clone Manager (Sci-Ed

Sorfware, Ver 8.0, NC, USA) để thiết kế cặp mồi có gắn thêm trình tự cắt

giới hạn XbaI và NotI Trình tự gen chi của vi khuẩn B licheniformis

Trang 33

KNUC213 đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ChiBF và ChiBR có trình tự nhƣ sau:

Phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo chu trình nhiệt:

Nhiệt độ Thời gian

so sánh với thang DNA chuẩn (Fermentas) Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification (Invitrogen)

Trang 34

2.2.4 Điện di DNA trên gel agarose

Agarose được hoà tan trong dung dịch đệm TAE đến nồng độ phù hợp Đun sôi dung dịch agarose cho đến khi tan hoàn toàn Để nguội dung dịch đến khoảng 50oC, đổ vào khuôn có cài răng lược để tạo các giếng nhỏ, độ dày của gel tuỳ thuộc từng mục đích sử dụng Sau 30 phút, rút lược ra khỏi khuôn, đặt gel vào bể điện di, đổ đệm TAE 1X tới khi ngập mặt gel Trộn mẫu với loading dye 6X rồi tra vào các giếng Chạy điện di bằng dòng một chiều với hiệu điện thế 100V trong khoảng 60 phút Dựa vào sự di chuyển của bromophenol để dừng điện di thích hợp Nhẹ nhàng lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 g/ml trong khoảng 15 phút rồi rửa lại bằng nước Quan sát bản gel đã nhuộm dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng  302 nm

2.2.5 Tinh sạch sản phẩm PCR

Các bước được tiến hành theo hướng dẫn của PureLink® PCR Purification Kit (Invitrogen, Mỹ) như sau: cắt phần agarose gel có băng DNA cho vào ống eppendorf sạch theo tỷ lệ cứ 100 mg agarose bổ sung 300 l dung dịch đệm Ủ hỗn hợp ở 60C cho đến khi agarose tan hết, dùng pipet hút hỗn dịch cho lên cột, ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút Bổ sung 500 l dung dịch rửa lên cột và ủ 30 giây ở nhiệt độ phòng Ly tâm ở 13.000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch dưới ống thu Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung

50 l nước khử ion, giữ ở nhiệt độ phòng 5 phút Ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút để thu DNA Sản phẩm tinh sạch được điện di trên gel agarose 0,8 %

2.2.6 Cắt và ghép nối gen

* Phản ứng cắt DNA plasmid bằng enzyme giới hạn:

Phản ứng cắt DNA với enzyme giới hạn gồm: 1 l dung dịch đệm, 2 l DNA (nồng độ 20 ng); 0,25 l enzyme giới hạn 2 U/l; 6,75 l H₂O khử ion

vô trùng Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ 37C trong 2 giờ

* Ghép nối các đoạn DNA:

Thành phần phản ứng gồm: 1 l đệm 10X, 1 l T4 DNA ligase, 1 l

Trang 35

ATP, 1 l vector đã mở vòng (nồng độ 50 ng), 4 l DNA tinh sạch (nồng độ 50ng), 2l H₂O khử ion vô trùng Hỗn hợp được trộn đều và ủ 3 giờ ở 16C

Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào E coli bằng sốc nhiệt và chọn

lọc trên đĩa thạch LB có chứa ampicilin 100g/ml

2.2.7 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli bằng phương pháp sốc nhiệt

* Nguyên tắc:

Dưới tác dụng của CaCl2 lạnh, thành tế bào E coli trở nên xốp và dãn ra tạo thành các lỗ, tạo điều kiện cho DNA plasmid có thể chui qua các lỗ trên màng vào tế bào chất khi nhiệt độ thay đổi đột ngột, các lỗ này khép lại không

cho các plasmid đi ra [23]

* Quy trình tạo tế bào khả biến:

Cấy chuyển một khuẩn lạc E coli DH5α vào 5 ml môi trường LB lỏng,

lắc 200 v/p ở 37C qua đêm Chuyển 0,5 ml dịch tế bào sang 50 ml môi trường LB, tiếp tục cấy và nuôi lắc 200 v/p ở 37C cho tới khi mật độ tế bào (OD600 nm) đạt từ 0,4-0,6 đơn vị Sau đó lấy mẫu và ủ dịch nuôi ở 4C trong

1 giờ Từ bước này tất cả các thao tác đều được tiến hành ở 4C Ly tâm 5.000 v/p trong 10 phút Sinh khối tế bào được hoà vào trong 50 ml CaCl2 100 mM

Ủ mẫu 15 phút và ly tâm thu sinh khối tế bào ở 3.500 v/p trong 10 phút Sinh khối tế bào được hoà lại lần 2 trong 25 ml CaCl2 100 mM, ủ mẫu 10 phút ở

4C Ly tâm 4.000 v/p trong 10 phút ở 4C thu sinh khối, sau đó tiếp tục được hòa lại trong 5 ml CaCl2 100 mM, bổ sung glycerol 75% và bảo quản ở -

80C

* Quy trình biến nạp:

Sinh khối tế bào khả biến được lấy ra từ tủ -80C, được rã đông trong đá với thời gian 30 phút Sau đó bổ sung vào mỗi ống tế bào khả biến 1-10 μg DNA, đảo nhẹ nhàng để DNA phân bố đều trong dịch Ủ mẫu ở 4C trong khoảng 30 phút Mẫu được sốc nhiệt ở bể ổn nhiệt 42C trong 1 phút 30 giây Sau đó ủ mẫu

ở 4°C trong 2 phút Bổ sung 0,6 ml LB, lắc nhẹ hỗn hợp tế bào ở 37°C trong 45

Trang 36

phút Hút 100 µl dịch tế bào cấy trải trên đĩa môi trường LB có bổ sung Amp 100 μg/ml và X-Gal 40 μg/ml Ủ đĩa ở 37C qua đêm

2.2.8 Tách chiết plasmid từ vi khuẩn

Một khuẩn lạc chủng vi khuẩn tái tổ hợp được cấy chuyển vào 5 ml môi trường LB có bổ sung ampicillin 100 g/ml Dịch nuôi cấy được lắc 200 v/p ở

37C qua đêm Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống eppendorf và ly tâm 6.000 v/p trong 5 phút Loại bỏ dịch nổi để thu sinh khối tế bào Sinh khối tế bào được hoà vào 100 l dung dịch I, trộn đều và để ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút Tiếp tục bổ sung 200 l dung dịch II, đảo nhẹ nhàng để tránh đứt gãy DNA, ủ hỗn dịch trên đá khoảng 10 phút Bổ sung tiếp 150 l dung dịch III

và đảo nhẹ, hỗn dịch bắt đầu xuất hiện kết tủa trắng, ủ hỗn dịch trong đá khoảng 15 phút Thêm 450 l dung dịch phenol/chloroform/isoamylalcohol

và trộn đều hỗn dịch Ly tâm 13.000 v/p trong 15 phút để loại protein và DNA tổng số Hút pha trên chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml DNA được kết tủa bằng cách bổ sung hai lần thể tích ethanol 100 % và ly tâm 13.000 v/p trong

10 phút DNA được rửa lại bằng 0,5 ml cồn 70 % và ly tâm 13.000 v/p trong

10 phút Phần dịch nổi phía trên được loại bỏ và làm khô DNA bằng máy làm khô mẫu DNA plasmid được hoà vào 40 l dung dịch TE và bảo quản ở -

20C DNA plasmid sau khi tách được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose0,8%

2.2.9 Giải trình tự gen chi

Trình tự nucleotide của gen chi trên vector tách dòng pJET1.2::chi

được xác định trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®

3100-Avant Gentic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) tại Viện Công nghệ

sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Kết quả giải trình tự gen hai chiều được kiểm tra bằng phần mềm phân tích DNA STAR (Lasergen Inc., Madison, WI, Mỹ), so sánh với các gen tương ứng đăng ký trên ngân hàng cơ sở dữ liệu GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI

Trang 37

(www.ncbi.nlm.nih.gov) Trình tự amino acid suy diễn của chi được phân tích

và so sánh với trình tự amino acid của các protein tương ứng lần lượt bằng công cụ trên website http://www.expasy.ch và chương trình phần mềm Clustal-X (ver 1.83, Mỹ)

2.2.10 Thiết kế vector biểu hiện gen chi trong P pastoris

Xử lý vector pJET1.2::chi và pPICZA đồng thời với hai enzyme giới

hạn NotI và XbaI Tách và tinh sạch gen chi, pPICZA và thực hiện phản ứng ghép nối DNA bằng enzyme DNA T4 ligase (Invitrogen, Mỹ) ở 22°C trong thời gian 1 giờ Biến nạp toàn bộ sản phẩm nhận được sau khi thực hiện phản

ứng ghép nối DNA vào E coli DH5α Tách plasmid pPICZA::chi từ E coli,

xử lý đồng thời với hai enzyme giới hạn NotI và XbaI để kiểm tra kích thước của gen chi được chèn vào vector biểu hiện pPICZA Mở vòng plasmid pPICZA::chi tại vùng AOX1 bằng enzyme giới hạn PmeI và biến nạp vào nấm men P pastoris X33 bằng xung điện Tách plasmid từ chủng tái tổ hợp

P pastoris X33/pPICZA::chi để thực hiện các phản ứng kiểm tra tính chính

xác của vector đã được biến nạp

2.2.11 Biến nạp vector tái tổ hợp vào P pastoris X33 bằng phương pháp xung điện

* Nguyên tắc:

Dưới tác dụng của điện thế cao, thành tế bào dãn ra tạo thành các lỗ, nhờ đó DNA di chuyển theo điện trường xâm nhập vào trong tế bào Khi ngừng xung điện, cấu trúc của màng phục hồi và giữ DNA lại bên trong tế bào [23]

* Chuẩn bị tế bào P pastoris khả biến:

Cấy chuyển chủng nấm men P pastoris X33 vào 5 ml môi trường YPD

lỏng, lắc ở 30°C, 200 vòng/phút qua đêm Hút 1 ml dịch nuôi cấy cho vào 200

ml môi trường YPD lỏng, tiếp tục lắc qua đêm (khoảng 16-18 giờ) đến khi

OD600nm đạt 1,6 đơn vị Ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút để thu tế bào nấm men Tủa tế bào được hòa tan vào 40 ml nước lạnh deion vô trùng, để mẫu trên đá 10-15 phút Ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút Hòa lại tủa vào