licheniformis KNUC213 3.2.1. Tách DNA tổng số
Kết quả kiểm tra sản phẩm DNA tổng số tách từ chủng B. licheniformis KNUC213 trên bản điện di agarose gel 1,0 % đƣợc thể hiện trên hình 3.3.
Hình 3.3. Điện di đồ kiểm tra DNA tổng số của vi khuẩn B. licheniformis KNUC213 trên gel agarose 1,0%.
Kết quả trên hình 3.3 cho thấy, quá trình tách chiết DNA tổng số của chủng B. licheniformis KNUC213 tạo ra băng DNA gọn, sản phẩm DNA không bị cắt thành các đoạn nhỏ. Do vậy, quá trình tách chiết DNA tổng số đƣợc thực hiện thành công. DNA tổng số của chủng B. licheniformis
KNUC213 tiếp đó đƣợc xử lý với RNase nhằm loại bỏ RNA và bảo quản ở 4oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Khuếch đại gen chi bằng kỹ thuật PCR
Đoạn gen chi mã hóa endochitinase của B. licheniformis KNUC213 đƣợc khuếch đại từ DNA tổng số bằng cặp mồi ChiBF và ChiBR nhằm khuếch đại toàn bộ gen chi, đồng thời có gắn thêm vị trí cắt cho enzyme giới
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
hạn NotI và XbaI tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tạo vector biểu hiện. Kết quả kiểm tra quá trình khuếch đại gen chi bằng phản ứng PCR đƣợc thể hiện trên hình 3.4.
Hình 3.4. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm PCR bằng cặp mồi ChiBF và ChiBR trên gel agarose 1,0%. (Đƣờng chạy M: Thang DNA chuẩn (0,25-10kb);
Đƣờng chạy 1: Sản phẩm của phản ứng PCR khuếch đại gen chi từ DNA tổng số của B.
licheniformis KNU213)
Sản phẩm khuếch đại gen chi bằng kỹ thuật PCR cho một băng DNA
duy nhất có kích thƣớc 1,7 kb trên bản gel agarose 1,0% (Hình 3.4), tƣơng ứng với kích thƣớc mong đợi khi thiết kế mồi để khuếch đại gen chi. Sản
phẩm PCR đƣợc tinh sạch và sử dụng trong thí nghiệm tách dòng, giải giải trình gen chi.
3.2.3. Tách dòng gen chi trong vector pJET1.2/blunt
Sản phẩm PCR khuếch đại gen chi đã tinh sạch đƣợc gắn vào vector
tách dòng pJET1.2/blunt nhằm tạo plasmid pJET1.2/blunt::chi và biến nạp vào E. coli XL1-blue. Kết quả kiểm tra plasmid tách từ các dòng tế bào E. coli XL1-blue khi nuôi cấy trên môi trƣờng LB/ampicillin 100 µg/ml đƣợc thể
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.5. Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp tách từ tế bào E. coli XL1- blue. (Đƣờng chạy 1: sản phẩm plasmid pJET1.2/blunt::chi vàđƣờng chạy 2, 3: Sản phẩm
plasmid pJET1.2/blunt (đối chứng âm)).
Kết quả trên hình 3.5 cho thấy, sau quá trình biến nạp đã chọn đƣợc các dòng tế bào E. coli XL1-blue mang plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt::chi ở
đƣờng chạy số 1 do plasmid này có kích thƣớc lớn hơn các plasmid ở đƣờng chạy số 2 và 3 là các plasmid gốc pJET1.2/blunt không chƣa đoạn chèn (đƣợc sử dụng làm đối chứng âm). Plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt::chi tiếp tục kiểm tra bằng cách xử lý với hai enzyme giới hạn NotI và XbaI. Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt sau quá xử lý pJET1.2/blunt::chi với hai enzyme giới hạn trên bản điện di gel agarose 1,0 % đƣợc thể hiện trên hình 3.6.
Hình 3.6. Điện di đồ kiểm tra sự có mặt gen chi của chủng B. licheniformis KNU213 trong vector tách dòng pJET1.2/blunt::chi. (Đƣờng chạy
1: plamid pJET1.2/blunt::chi đƣợc xử lý bởi hai enzyme giới hạn NotI và XbaI và Đƣờng
chạy M: Thang DNA chuẩn (0,25-10kb)).
Kết quả điện di đồ thể hiện trên hình 3.6 cho thấy, sản phẩm sau quá trình cắt plasmid ở đƣờng chạy số 1 cho hai băng DNA có kích thƣớc tƣơng ứng là 1,7 kb và 3,0 kb. Băng DNA có kích thƣớc 3,0 kb tƣơng ứng với kích thƣớc vector pJET1.2/blunt khi chƣa mang đoạn gen chi, và đoạn DNA có
kích thƣớc 1,7 tƣơng ứng với kích thƣớc gen chi sử dụng gắn vào vector
pJET1.2/blunt. Kết quả trên cho thấy gen chi đã đƣợc gắn vào vector tách
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
giải trình tự hai chiều đối với gen chi nhờ sử dụng cặp mồi pJET1.2F và
pJET1.2R.
3.2.4. Giải và phân tích trình tự gen chi của B. licheniformis KNUC213
Từ kết quả giải trình tự nucleotide hai chiều của gen chi trong vector
tách dòng pJET1.2::chi, trình tự gen chi đƣợc xử lý, ghép nối thành đoạn gen hoàn chỉnh. Trình tự nucleotide của gen chi của chủng B. licheniformis
KNUC213 (Phụ lục 4) có độ dài 1731 nucleotide mã hóa cho protein gồm 576 amino acid, khối lƣợng phân tử theo tính toán là 63 kDa, điểm đẳng điện pI là 5,26. Trình tự gen chi trong nghiên cứu đã đƣợc đăng ký trên ngân hàng cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) dƣới mã số truy cập JN662350.
Khi so sánh trình tự gen chi của chủng B. licheniformis KNUC213
(JN662350) với các gen tƣơng ứng của các chủng B. licheniformis khác trên GenBank (NCBI) cho thấy độ tƣơng đồng trình tự cao (đạt 97 ÷ 98%). Khi dịch mã gen chi của chủng B. licheniformis KNUC213 sang trình tự amino
acid suy diễn, chúng tôi nhận thấy có 3 nucleotide mã hóa cho 1 amino acid ở vị trí 567 bị mất. Tuy nhiên việc thiếu vị trí amino acid này đã không ảnh hƣởng đến khung đọc mở (Open Reading Frame, ORF) và vị trí trung tâm hoạt động của chitinase ở vị trí 234 (Hình 3.7).
Hình 3.7. So sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen chi của chủng B.
licheniformis KNU213 với trình tự protein tƣơng ứng từ các chủng B. licheniformis khác đƣợc đăng ký trên GenBank (NCBI). (Dấu sao (*) thể hiện sự
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tƣơng đồng trong trình tự amino acid của các enzyme chi. Khung chữ nhật thể hiện vùng
trình tự amino acid của chủng gốc B. licheniformis KNUC213 sai khác hoặc bị xóa 1
amino acid).
Bên cạnh đó, so sánh độ tƣơng đồng trình tự amino acid suy diễn từ gen chi từ B. licheniformis KNUC213 (mã số AEQ55312, trình tự đƣợc gạch chân) với các trình tự amino acid của gen chi từ các chủng B. licheniformis
khác cho tỷ lệ tƣơng đồng đạt 95÷98% (Bảng 3.4). Ngoài ra, trình tự protein suy diễn trong nghiên cứu thể thể hiện độ tƣơng đồng cao nhất với trình tự protein tƣơng ứng từ B. licheniformis DSM 8785 (mã số truy cập
ACK44109).
Bảng 3.4. Kết quả so sánh độ tƣơng đồng trình tự amino acid của endochitinase từ B. licheniformis KNUC213 (AEQ55312) với các trình tự amino acid của chitinase tƣơng ứng từ các chủng B. licheniformis khác đƣợc đăng ký trên GenBank (NCBI).
Mã truy cập ACU43581 ACM46020 ACK44109 AEQ55312 ACW83016 ACU43581 100,0
ACM46020 99,5 100,0
ACK44109 95,6 96,5 100,0
AEQ55312 95,3 95,8 98,5 100,0
ACW83016 93,8 96,7 96,7 97,0 100,0
Ghi chú: ACU43581: Trình tự amino acid của chitinase của chủng B. licheniformis N1;
ACM46020: trình tự amino acid của chitinase của chủng B. licheniformis CBFOS-03;
ACK44109: trình tự amino acid của chitinase của chủng B. licheniformis DSM 8785;
AEQ55312: trình tự amino acid của chitinase của chủng B. licheniformis KNUC213;
ACW83016: trình tự amino acid củachitinase của chủng B. licheniformis DSM 13.
Các kết quả phân tích trình tự cho thấy đoạn gen đƣợc tách dòng từ chủng B. licheniformis KNUC213 là gen chi mã hóa cho endochitinase. Theo một số tác giả, endochitinase của các chủng B. licheniformis có ái lực mạnh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tạo thành các chitooligosaccharide. Gen chi do đó đƣợc sử dụng làm nguồn
gen nhằm biểu hiện rCHI trong nấm men P. pastoris.
3.3. BIỂU HIỆN GEN chi MÃ HÓA CHITINASE TỪ CHỦNG B.
licheniformis KNUC213 TRONG P. pastoris X33 3.3.1. Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA::chi
Gen chi đƣợc cắt khỏi vector tách dòng pJET1.2/blunt::chi bằng hai enzyme giới hạn NotI và XbaI và gắn vào vector pPICZαA nhằm tạo vector
biểu hiện pPICZαA::chi. Sản phẩm sau quá trình ghép nối đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli XL1- blue và sàng lọc trên môi trƣờng LB có bổ sung 100 µg/ml zeocin. Plasmid tách từ E. coli XL1- blue đƣợc kiểm tra trên bản điện di agarose gel 1% (đƣờng chạy 3 và 4 ở hình 3.8) và cắt kiểm tra bằng hai enzyme giới hạn NotI và XbaI (đƣờng chạy 1, hình 3.8).
Hình 3.8. Điện di đồ sản phẩm cắt vector biểu hiện pPICZαA::chi bằng hai enzyme giới hạn trên gel agarose 1,0%. (Đƣờng chạy 1: Vector biểu hiện
pPICZαA::chi đƣợc cắt bởi hai enzyme giới hạn NotI và XbaI; Đƣờng chạy 2: Thang DNA
chuẩn (0,25-10kb); Đƣờng chạy 3: pPICZαA; Đƣờng chạy 4: pPICZαA::chi).
Kết quả thể hiện trên hình 3.8 cho thấy, sản phẩm sau quá trình cắt vector pPICZαA::chi bằng hai enzyme giới hạn NotI và XbaI cho hai băng
DNA có kích thƣớc lần lƣợt là 1,7 kb và 3,6 kb. Trong đó băng DNA có kích thƣớc 1,7 kb tƣơng ứng với kích thƣớc của gen chi và băng DNA có kích
thƣớc 3,6 kb tƣơng ứng với kích thƣớc vector pPICZαA. Nhƣ vậy vector pPICZαA::chi đã đƣợc thiết kế thành công.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.2. Tạo chủng P. pastoris tái tổ hợp có khả năng biểu hiện rCHI
Để tạo nấm men P. pastoris tái tổ hợp có khả năng biểu hiện gen chi,
chủng nấm men P. pastoris X33 (Mut+) đƣợc chọn làm tế bào biểu hiện và
pPICZαA::chi đã mở vòng đƣợc biến nạp vào trong tế bào nấm men bằng xung điện. Theo lý thuyết, sau khi biến nạp pPICZαA::chi đã mở vòng vào nấm men P. pastoris X33 sẽ xảy ra quá trình trao đổi chéo tích hợp vào vùng gen AOX1 trên hệ gen của nấm men.
Để tăng hiệu suất biến nạp, cũng nhƣ tăng hiệu suất trao đổi chéo plasmid pPICZαA::chi đƣợc mở vòng (linearized) để chuyển thành dạng DNA mạch thẳng. Theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất, vector pPICZαA có ba điểm mở vòng bởi ba enzyme giới hạn là SacI, PmeI và BstXI. Tuy nhiên,
trên trình tự gen chi chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn SacI và BstXI nên pPICZαA::chi đƣợc mở vòng bằng enzyme giới hạn PmeI. Sản phẩm sau phản ứng mở vòng plasmid pPICZαA::chi bằng enzyme PmeI đƣợc kiểm tra trên gel 1,0 % agarose (Hình 3.9).
Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm mở vòng pPICZαA::chi bằng enzyme giới hạn PmeI trên gel agarose 1,0%. (Đƣờng chạy M: Thang DNA chuẩn (0,25-
10kb) và Đƣờng chạy 1: Sản phẩm cắt plasmid pPICZαA::chi bằng enzyme giới hạn
PmeI).
Kết quả điện di đồ thể hiện trên hình 3.9 cho thấy, sản phẩm thu đƣợc là một băng DNA kích thƣớc 5,3 kb tƣơng ứng với kích thƣớc vector pPICZαA::chi bao gồm gen chi là 1,7 kb và vector pPICZαA là 3,6 kb. Quá
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trúc của plasmid pPICZαA::chi. Sản phẩm sau quá trình mở vòng đƣợc sử dụng biến nạp vào nấm men P. pastoris X33 và chọn lọc trên môi trƣờng
YPDS có bổ sung zeocin có nồng độ là 100; 500; 1000; 1500 và 2000 mg/l. Zeocin là một loại kháng sinh có chứa phân tử Cu2+ khi đi vào tế bào, ion Cu2+ chuyển thành Cu+ và sẽ thay thế các thành phần có trong liên kết sulfhydryl có trong tế bào. Do vậy, các tế bào nấm men P. pastoris X33
không mang plasmid pPICZαA sẽ không có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng có chứa zeocin. Tuy nhiên, với các tế bào có mang plasmid tái tổ hợp pPICZαA có khả năng sinh trƣởng và phát triển trên môi trƣờng có chứa zeocin do trong plasmid pPICZαA chứa gen Sh ble có nguồn gốc từ Streptoalloteichus hindustanus mã hóa enzyme có khả năng kháng zeocin.
Kết quả sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng thạch YPDS có bổ sung zeocin có nồng độ là 100; 500; 1000; 1500 và 2000 mg/l ở nhiệt độ 28C đã xuất hiện nhiều khuẩn lạc, chứng tỏ kết cấu biểu hiện (expression cassette) trên plasmid pPICZαA::chi đã đƣợc tích hợp vào genome của nấm men. Để tăng cƣờng quá trình biểu hiện rCHI, số bản sao của kết cấu biểu hiện cần đƣợc tích hợp nhiều vào P. pastoris. Khi số bản sao đƣợc tích hợp tăng lên thì các dòng nấm men tái tổ hợp có khả năng kháng lại zeocin ở nồng độ cao hơn. Trong nghiên cứu này, trên môi trƣờng YPDS chứa zeocin nồng độ 2000 mg/ml, đã sàng lọc đƣợc 5 dòng nấm men P. pastoris X33. Khi sàng
lọc sơ bộ dòng nấm men có kí hiệu Y2 (sau đây gọi là nấm men P. pastoris Y2) có khả năng sinh trƣởng nhanh trên môi trƣờng chọn lọc và sinh tổng hợp rCHI cao hơn các dòng còn lại. Do vậy, chủng nấm men P. pastoris Y2 đã đƣợc kiểm tra để xác định đoạn gen đƣợc chèn vào hệ gen bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi 5’ AOX1 và 3’ AOX1. Kết quả kiểm tra trên bản điện di agarose gel đƣợc thể hiện trên hình 3.10.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.10. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm PCR với khuôn DNA là bộ gen của nấm men P. pastoris tái tổ hợp trên gel agarose 1,0%. (Đƣờng chạy M: Thang DNA chuẩn (0,25-10kb); Đƣờng chạy 1: Sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA là bộ
gen của dòng nấm men tái tổ hợp P. pastoris Y2 và Đƣờng chạy 2: Sản phẩm PCR sử dụng
khuôn DNA là bộ gen của chủng P. pastoris X33/ pPICZαA).
Kiểm tra sự có mặt của gen chi trên hệ gen của dòng nấm men P. pastoris Y2 bằng PCR cho hai băng có kích thƣớc lần lƣợt là 2,3 kb và 2,2 kb
(Hình 3.10). Băng có kích thƣớc 2,3 kb bao gồm gen chi có kích thƣớc 1,7 kb và vùng đệm 5’ AOX1 và 3’ AOX1 ở hai đầu của gen chi có kích thƣớc 0,6
kb. Băng có kích thƣớc 2,2 kb thể hiện gen oxy hóa methanol (alcohol oxidase gene - AOX1) của chủng nấm men P. pastoris X33 khi không có
đoạn chèn. Các kết quả thu đƣợc cho thấy đã tích hợp thành công kết cấu biểu hiện chứa gen chi vào hệ gen của P. pastoris X33 tại vị trí gen AOX. Do đó, chủng nấm men P. pastoris Y2 đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu biểu hiện
rCHI.
3.3.3. Biểu hiện rCHI bởi chủng P. pastoris Y2
Dòng nấm men P. pastoris Y2 đƣợc nhân giống trên môi trƣờng
BMGY ở nhiệt độ 28C trong thời gian 18-72 giờ. Sau đó cấy chuyển sang môi trƣờng BMGY nuôi trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 28C. Khi mật độ tế bào (OD600nm) đạt 2-4 đơn vị, cảm ứng bằng 1,0%(v/v) methanol. Kết quả kiểm tra hoạt tính chitinase của chủng P. pastoris Y2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.5. So sánh hoạt tính enzyme chitinase của các chủng nghiên cứu tại các thời điểm khác nhau
Thời gian lên men
(giờ)
Hoạt độ chitinase (U/ml)
B. licheniformis KNUC213 (LB) P. pastoris Y2 BMMY BMGY 24 48 72 96 120 - 231,1 - - - 172,95 255,11 223,89 156,99 206,05 116,86 272,95 652,71 616,35 255,11
Hình 3.11. Điện di đồ kiểm tra protein ngoại bào của dòng nấm men tái tổ hợp P. pastoris Y2 theo thời gian khi cảm ứng bằng methanol. (Đƣờng chạy
1: Protein ngoại bào của chủng nấm men P. pastoris X33/pPICZαA (đối chứng âm);
Đƣờng chạy 2-6: Protein ngoại bào của chủng nấm men P. pastoris Y2 tại thời điểm 24,
36, 48; 60 và 72 giờ sau cảm ứng bởi 1% methanol và Đƣờng chạy M: Thang Protein chuẩn (Fermentas)).
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy hoạt tính chitinase thu nhận từ chủng nấm men P. pastorisY2tăng dần theo thời gian nuôi cấy và đạt cao nhất 652,3 U/ml sau 72 giờ nuôi cấy trong môi trƣờng BMGY, cao gấp 2,8 lần so với hoạt tính chitinase thu nhận từ chủng B. licheniformis KNUC213 (231,1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
U/ml). Trong khi đó, hoạt tính chitinase thu nhận từ chủng nấm men P. pastoris Y2 trên môi trƣờng BMMY đạt cao nhất là 255,11 U/ml sau 48 giờ
nuôi cấy và chủng nấm men gốc P. pastoris X33 đã tích hợp plasmid
pICZαA (đối chứng âm) không thể hiện hoạt tính chitinase. Theo các công bố trên thế giới, hoạt tính chitinase từ nấm men tái tổ hợp đƣợc công bố bởi một số tác giả nhƣ: hoạt tính chitinase đƣợc biểu hiện từ gen mã hóa chitinase của
Chaetomium sp. trong P. pastoris GS115 và Saccharomyces cerevisiae khá
thấp lần lƣợt 1,42 U/ml và 1,96 U/ml. Bên cạnh đó, gen chi58 mã hóa chitinase từ Chaetomium cupreum đƣợc Yan-Jun Wang biểu hiện trong P.