Để tạo nấm men P. pastoris tái tổ hợp có khả năng biểu hiện gen chi,
chủng nấm men P. pastoris X33 (Mut+) đƣợc chọn làm tế bào biểu hiện và
pPICZαA::chi đã mở vòng đƣợc biến nạp vào trong tế bào nấm men bằng xung điện. Theo lý thuyết, sau khi biến nạp pPICZαA::chi đã mở vòng vào nấm men P. pastoris X33 sẽ xảy ra quá trình trao đổi chéo tích hợp vào vùng gen AOX1 trên hệ gen của nấm men.
Để tăng hiệu suất biến nạp, cũng nhƣ tăng hiệu suất trao đổi chéo plasmid pPICZαA::chi đƣợc mở vòng (linearized) để chuyển thành dạng DNA mạch thẳng. Theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất, vector pPICZαA có ba điểm mở vòng bởi ba enzyme giới hạn là SacI, PmeI và BstXI. Tuy nhiên,
trên trình tự gen chi chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn SacI và BstXI nên pPICZαA::chi đƣợc mở vòng bằng enzyme giới hạn PmeI. Sản phẩm sau phản ứng mở vòng plasmid pPICZαA::chi bằng enzyme PmeI đƣợc kiểm tra trên gel 1,0 % agarose (Hình 3.9).
Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm mở vòng pPICZαA::chi bằng enzyme giới hạn PmeI trên gel agarose 1,0%. (Đƣờng chạy M: Thang DNA chuẩn (0,25-
10kb) và Đƣờng chạy 1: Sản phẩm cắt plasmid pPICZαA::chi bằng enzyme giới hạn
PmeI).
Kết quả điện di đồ thể hiện trên hình 3.9 cho thấy, sản phẩm thu đƣợc là một băng DNA kích thƣớc 5,3 kb tƣơng ứng với kích thƣớc vector pPICZαA::chi bao gồm gen chi là 1,7 kb và vector pPICZαA là 3,6 kb. Quá
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trúc của plasmid pPICZαA::chi. Sản phẩm sau quá trình mở vòng đƣợc sử dụng biến nạp vào nấm men P. pastoris X33 và chọn lọc trên môi trƣờng
YPDS có bổ sung zeocin có nồng độ là 100; 500; 1000; 1500 và 2000 mg/l. Zeocin là một loại kháng sinh có chứa phân tử Cu2+ khi đi vào tế bào, ion Cu2+ chuyển thành Cu+ và sẽ thay thế các thành phần có trong liên kết sulfhydryl có trong tế bào. Do vậy, các tế bào nấm men P. pastoris X33
không mang plasmid pPICZαA sẽ không có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng có chứa zeocin. Tuy nhiên, với các tế bào có mang plasmid tái tổ hợp pPICZαA có khả năng sinh trƣởng và phát triển trên môi trƣờng có chứa zeocin do trong plasmid pPICZαA chứa gen Sh ble có nguồn gốc từ Streptoalloteichus hindustanus mã hóa enzyme có khả năng kháng zeocin.
Kết quả sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng thạch YPDS có bổ sung zeocin có nồng độ là 100; 500; 1000; 1500 và 2000 mg/l ở nhiệt độ 28C đã xuất hiện nhiều khuẩn lạc, chứng tỏ kết cấu biểu hiện (expression cassette) trên plasmid pPICZαA::chi đã đƣợc tích hợp vào genome của nấm men. Để tăng cƣờng quá trình biểu hiện rCHI, số bản sao của kết cấu biểu hiện cần đƣợc tích hợp nhiều vào P. pastoris. Khi số bản sao đƣợc tích hợp tăng lên thì các dòng nấm men tái tổ hợp có khả năng kháng lại zeocin ở nồng độ cao hơn. Trong nghiên cứu này, trên môi trƣờng YPDS chứa zeocin nồng độ 2000 mg/ml, đã sàng lọc đƣợc 5 dòng nấm men P. pastoris X33. Khi sàng
lọc sơ bộ dòng nấm men có kí hiệu Y2 (sau đây gọi là nấm men P. pastoris Y2) có khả năng sinh trƣởng nhanh trên môi trƣờng chọn lọc và sinh tổng hợp rCHI cao hơn các dòng còn lại. Do vậy, chủng nấm men P. pastoris Y2 đã đƣợc kiểm tra để xác định đoạn gen đƣợc chèn vào hệ gen bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi 5’ AOX1 và 3’ AOX1. Kết quả kiểm tra trên bản điện di agarose gel đƣợc thể hiện trên hình 3.10.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.10. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm PCR với khuôn DNA là bộ gen của nấm men P. pastoris tái tổ hợp trên gel agarose 1,0%. (Đƣờng chạy M: Thang DNA chuẩn (0,25-10kb); Đƣờng chạy 1: Sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA là bộ
gen của dòng nấm men tái tổ hợp P. pastoris Y2 và Đƣờng chạy 2: Sản phẩm PCR sử dụng
khuôn DNA là bộ gen của chủng P. pastoris X33/ pPICZαA).
Kiểm tra sự có mặt của gen chi trên hệ gen của dòng nấm men P. pastoris Y2 bằng PCR cho hai băng có kích thƣớc lần lƣợt là 2,3 kb và 2,2 kb
(Hình 3.10). Băng có kích thƣớc 2,3 kb bao gồm gen chi có kích thƣớc 1,7 kb và vùng đệm 5’ AOX1 và 3’ AOX1 ở hai đầu của gen chi có kích thƣớc 0,6
kb. Băng có kích thƣớc 2,2 kb thể hiện gen oxy hóa methanol (alcohol oxidase gene - AOX1) của chủng nấm men P. pastoris X33 khi không có
đoạn chèn. Các kết quả thu đƣợc cho thấy đã tích hợp thành công kết cấu biểu hiện chứa gen chi vào hệ gen của P. pastoris X33 tại vị trí gen AOX. Do đó, chủng nấm men P. pastoris Y2 đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu biểu hiện
rCHI.