Chitinase đƣợc xác định theo phƣơng pháp so màu thông qua lƣợng N- acetyl D-glucosamine giải phóng ra từ cơ chất keo chitin (colloidal chitin). Lƣợng đƣờng khử giải phóng ra trong phản ứng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp DNS (3,5- dinitrosalicylic acid) ở bƣớc sóng 540nm. Một đơn vị hoạt tính chitinase đƣợc xác định là lƣợng enzyme cần thiết để giải phóng 1 µmol N-acetyl D - glucosamine trong thời gian một phút ở 60oC, pH 6,0. Colloidal chitin đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp của Roberts và Selitrennikoff (1988).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Cách tiến hành thí nghiệm:
- Mẫu thí nghiệm :
+ 0,5 ml dung dịch colloidal-chitin 1,0%, pH 6,0. + 0,5 ml dịch enzyme thô.
Thực hiện phản ứng enzyme ở 60oC trong 60 phút và dừng phản ứng bằng cách bổ sung 0,5 ml dịch axit 3,5-dinitrosalicylic 1 % và bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 100oC trong 5 phút.
-Mẫu đối chứng:
+ 0,5 ml dung dịch colloidal-chitin 1,0%, pH 6,0.
+ 0,5 ml dịch enzyme đã đƣợc bất hoạt bằng nhiệt ở 100oC trong 5 phút.
Sau khi phản ứng kết thúc, ly tâm dung dịch ở 12.000 v/p trong thời gian 5 phút. Loại kết tủa và lần lƣợt hút vào ống nghiệm mới:
+ 0,5 ml dịch phản ứng.
+ 0,5 ml dịch axit 3,5-dinitrosalicylic 1 %
Hỗn hợp đƣợc đun sôi trong thời gian 5 phút rồi để nguội đến nhiệt độ phòng. Đo mật độ quang của dung dịch phản ứng ở bƣớc sóng λ = 540 nm. Hoạt độ chitinase (CTN) đƣợc tính theo công thức:
Trong đó:
A: Nồng độ N-acetyl D- glucosamin tính theo đƣờng chuẩn (ηmol) V: Thể tích dung dịch enzyme thực hiện phản ứng (ml)
T: Thời gian phản ứng (giờ)
* Xây dựng đường chuẩn dựa trên nồng độ D-glucosamin:
Pha các mẫu dung dịch N-acetyl-D-glucosamine chuẩn có nồng độ xác định rồi thực hiện phản ứng với thuốc thử DNS theo tỷ lệ 1:1, đun sôi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trong 5 phút, làm nguội đến nhiệt độ phòng, rồi đo mật độ quang ở bƣớc sóng λ = 540 nm.
Hình 2.1. Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên độ hấp thụ mật độ quang của dung dịch N-acetyl D-glucosamin chuẩn có nồng độ khác nhau.
Trên đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ N-acetyl-D- glucosamine và mật độ quang tại bƣớc sóng 540 nm, xác định đƣợc phƣơng trình y = ax + b. Trong đó:
y: nồng độ N-acetyl-D-glucosamine trong mẫu (ηmol/ml) x: giá trị đo mật độ quang ở bƣớc sóng 540 nm
Nồng độ N-acetyl-D-glucosamine trong dung dịch phản ứng đƣợc xác định thông qua đƣờng chuẩn.