Dòng nấm men P. pastoris Y2 đƣợc nhân giống trên môi trƣờng
BMGY ở nhiệt độ 28C trong thời gian 18-72 giờ. Sau đó cấy chuyển sang môi trƣờng BMGY nuôi trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 28C. Khi mật độ tế bào (OD600nm) đạt 2-4 đơn vị, cảm ứng bằng 1,0%(v/v) methanol. Kết quả kiểm tra hoạt tính chitinase của chủng P. pastoris Y2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.5. So sánh hoạt tính enzyme chitinase của các chủng nghiên cứu tại các thời điểm khác nhau
Thời gian lên men
(giờ)
Hoạt độ chitinase (U/ml)
B. licheniformis KNUC213 (LB) P. pastoris Y2 BMMY BMGY 24 48 72 96 120 - 231,1 - - - 172,95 255,11 223,89 156,99 206,05 116,86 272,95 652,71 616,35 255,11
Hình 3.11. Điện di đồ kiểm tra protein ngoại bào của dòng nấm men tái tổ hợp P. pastoris Y2 theo thời gian khi cảm ứng bằng methanol. (Đƣờng chạy
1: Protein ngoại bào của chủng nấm men P. pastoris X33/pPICZαA (đối chứng âm);
Đƣờng chạy 2-6: Protein ngoại bào của chủng nấm men P. pastoris Y2 tại thời điểm 24,
36, 48; 60 và 72 giờ sau cảm ứng bởi 1% methanol và Đƣờng chạy M: Thang Protein chuẩn (Fermentas)).
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy hoạt tính chitinase thu nhận từ chủng nấm men P. pastorisY2tăng dần theo thời gian nuôi cấy và đạt cao nhất 652,3 U/ml sau 72 giờ nuôi cấy trong môi trƣờng BMGY, cao gấp 2,8 lần so với hoạt tính chitinase thu nhận từ chủng B. licheniformis KNUC213 (231,1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
U/ml). Trong khi đó, hoạt tính chitinase thu nhận từ chủng nấm men P. pastoris Y2 trên môi trƣờng BMMY đạt cao nhất là 255,11 U/ml sau 48 giờ
nuôi cấy và chủng nấm men gốc P. pastoris X33 đã tích hợp plasmid
pICZαA (đối chứng âm) không thể hiện hoạt tính chitinase. Theo các công bố trên thế giới, hoạt tính chitinase từ nấm men tái tổ hợp đƣợc công bố bởi một số tác giả nhƣ: hoạt tính chitinase đƣợc biểu hiện từ gen mã hóa chitinase của
Chaetomium sp. trong P. pastoris GS115 và Saccharomyces cerevisiae khá
thấp lần lƣợt 1,42 U/ml và 1,96 U/ml. Bên cạnh đó, gen chi58 mã hóa chitinase từ Chaetomium cupreum đƣợc Yan-Jun Wang biểu hiện trong P. pastoris sử dụng vector pPIC9K cho hoạt tính rCHI đạt 39 U/ml; rCHI mã hóa bởi gen chi từ chủng Beauveria bassiana khi biểu hiện trong P. pastoris
GS115 cho hoạt tính đạt 153 U/ml [32].
Phân tích sản phẩm protein có trong dịch lên men bằng trên gel SDS- PAGE trên hình 3.11 cho thấy, trong dịch lên men của chủng nấm men P. pastoris Y2 có xuất hiện một băng protein khác biệt có khối lƣợng phân tử 63
kDa ở đƣờng chạy 2, 3, 4, 5 và 6 khi so với dòng đối chứng là P. pastoris
X33/pPICZαA (đƣờng chạy 1) Băng protein 63 kDa này đƣợc biểu hiện rõ hơn sau khi cảm ứng methanol 1,0%(v/v) theo thời gian (rõ nhất ở đƣờng chạy số 6 sau 72 giờ cảm ứng). Kết quả thu đƣợc phù hợp với tính toán theo lý thuyết giải trình tự nucleotide gen chi của B. licheniformis KNUC213 và
trọng lƣợng phân tử của rCHI suy diễn mã hóa bởi gen chi. Theo một số
nghiên cứu về rCHI, chitinase từ Bacillus sp. DAU101 khi biểu hiện trong E.
coli cũng có khối lƣợng phân tử 66 kDa. Trong khi gen chi mã hóa chitinase từ Bacillus sp.13.26 và chitinase từ chủng Enterobacter sp. NRG4 đƣợc biểu hiện trong E. coli có khối lƣợng 60 kDa, điều này chứng tỏ chitinase từ các
chủng vi khuẩn khác nhau sẽ có khối lƣợng khác nhau, phụ thuộc vào nguồn gen và kích thƣớc gen sử dụng khi biểu hiện.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.4. MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘ CỦA CHITINASE TÁI TỔ HỢP
3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nhiệt độ phản ứng ảnh hƣởng mạnh tới tốc độ xúc tác thủy phân cơ chất của enzyme và mỗi enzyme có một nhiệt độ phản ứng thích hợp. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme tái tổ hợp đƣợc thực hiện ở các nhiệt độ 40oC, 45oC, 50oC, 55oC, 60oC, 65oC, 70oC, 75oC và 80oC với cơ chất colloidal chitin. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt tính của rCHI đƣợc thể hiện ở hình 3.12.
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính của rCHI của chủng nấm men P. pastoris Y2
Kết quả trên hình 3.12 cho thấy, nhiệt độ có ảnh hƣởng mạnh đến hoạt động của rCHI. Trong khoảng nhiệt độ từ 40-80C hoạt tính rCHI tăng dần, đạt cao nhất khi nhiệt độ phản ứng ở 60C và hoạt tính enzyme giảm dần khi nhiệt độ cao hơn 60C. Ở nhiệt độ 70C và 80C, hoạt tính chitinase giảm còn 40% và 20% so với hoạt tính enzyme tại nhiệt độ tối ƣu 60C. So sánh nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của chitinase của chủng hợp P. pastoris Y2 và chủng
B. licheniformis KNUC213 không cho sự khác biệt, nhiệt độ tối ƣu này tƣơng
đƣơng với nhiệt độ tối ƣu của chitinase từ Bacillus sp. Hu1 và cao hơn với
0 20 40 60 80 100 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Ho ạt tín h tƣơn g đố i ( %) Nhiệt độ (°C)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chitinase từ B. firmus SBPL-05 (ở 37C) [18] và chitinase từ các chủng vi khuẩn biển là 50C [9, 20, 29].
Dƣới tác động của nhiệt độ, protein enzyme đều bị biến tính và làm ảnh hƣởng tới hoạt tính. Do một số liên kết hydro tham gia vào giữ vững cấu trúc và trung tâm hoạt động của enzyme bị đứt gãy bởi nhiệt độ. Mức độ ảnh hƣởng tùy thuộc vào thời gian và nhiệt độ. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến độ bền của rCHI đƣợc thực hiện ở các nhiệt độ 30C, 40C, 50C, 60C và 70o
C đƣợc thể hiện trên hình 3. 13.
Hình 3.13. Độ bền nhiệt của rCHI của chủng nấm men P. pastoris Y2 Kết quả thể hiện trên hình 3.13 cho thấy, khi giữ enzyme ở 30oC hoạt tính rCHI đƣợc duy trì ổn định thời gian 3 giờ. Tuy nhiên, khi so sánh việc giữ enzyme ở nhiệt độ 30C và nhiệt độ 60C; 70C sau 60 phút, hoạt tính rCHI chỉ còn 34,5% và 43,4% so với ban đầu. Sau 120 phút giữ ở nhiệt độ 60C và 70C rCHI bị bất hoạt hoàn toàn. Khi giữ enzyme ở 40C và 50C hoạt tính rCHI giảm nhẹ sau 60 phút, còn 85,3% và 74,6% so với hoạt tính enzyme ban đầu.
3.4.2. Ảnh hƣởng của pH
pH có ảnh hƣởng lớn tới hoạt tính xúc tác của enzyme, do pH ảnh hƣởng tới mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hƣởng tới độ bền protein enzyme. Để đánh giá ảnh hƣởng của pH tới hoạt động của rCHI, phản ứng
0 20 40 60 80 100 0 60 120 180 Ho ạt tí nh tƣ ơn g đố i (%) Thời gian (phút)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
giữa enzyme với cơ chất chitin đƣợc thực hiện ở khoảng pH từ 4-8, ở nhiệt độ 60oC, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.14.
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính của rCHI của chủng nấm men P. pastoris Y2
Ảnh hƣởng của pH phản ứng tới hoạt động của rCHI thể hiện trên hình 3.14 cho thấy, rCHI hoạt động tốt trong khoảng pH 5,0-6.5 và hoạt tính đạt cực đại ở pH 6,0 tƣơng đƣơng với pH tối ƣu cho hoạt động của chitinase của chủng B. licheniformis KNUC213. Giá trị pH tối ƣu cho hoạt động rCHI
tƣơng đƣơng với chitinase của chủng Bacillus sp. Hu1, cao hơn chitinase của chủng Serratia plymuthica HRO-C48 (pH 5,4) thấp hơn giá trị pH tối ƣu cho chitinase thu nhận từ chủng B. firmus SBPL-05 (pH 10,0) [18], và chitinase thu từ một số chủng vi khuẩn biển (pH 8,0) [29].
pH ảnh hƣởng tới độ bền hoạt tính enzyme nên lựa chọn đƣợc khoảng pH thích hợp là rất quan trọng. Mỗi loại protein enzyme có độ bền trong một môi trƣờng pH nhất định. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của pH đến độ bền hoạt tính rCHI đƣợc khảo sát với các pH 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 và 7,0 trong các khoảng thời gian khác nhau đƣợc thể hiện trên hình 3. 15.
0 20 40 60 80 100 120 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 Ho ạt tín h tƣơn g đố i ( %) pH
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.15. Độ bền hoạt tính của rCHI của chủng nấm men P. pastoris Y2 tại pH khác nhau.
Kết quả thể hiện trên hình 3.15 cho thấy, hoạt tính rCHI khi giữ ổn định ở pH 6,0 trong thời gian 3 giờ, hoạt tính hầu nhƣ không thay đổi. Nếu giữ enzyme rCHI ở pH 3,0 và 4,0 trong thời gian 30 phút, hoạt tính rCHI còn là 38,5% và 51,4% và sau 90 phút giữ enzyme rCHI ở pH 3,0 và 4,0 hoạt tính rCHI bị bất hoạt hoàn toàn. Khi giữ enzyme rCHI ở pH 5,0 và 7,0 trong 60 phút, hoạt tính rCHI còn lại 75,3% và 64,6%, sau đó hoạt tính enzyme ổn định trong các khoảng thời gian nghiên cứu tiếp theo. Kết quả đánh giá độ bền hoạt tính rCHI trong pH 6,0-7,0 tƣơng tự nhƣ nhƣ nghiên cứu độ bền hoạt tính chitinase của chủng B. licheniformis A1 là 6,0-8,0 [6, 10].
3.4.3. Ảnh hƣởng của ion kim loại
Các ion kim loại đóng vai trò quan trọng trong việc tham gia cấu trúc không gian của phân tử chitinase bao gồm tham gia vào cấu trúc trung tâm hoạt động và xúc tác phản ứng giữa enzyme và cơ chất. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính rCHI đƣợc trình bày trong bảng 3.6.
0 20 40 60 80 100 0 30 60 90 120 150 180 210 Ho ạt tí nh tƣ ơn g đố i (% ) Thời gian (phút) pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của ion kim loại lên hoạt tính rCHI của chủng nấm men P. pastoris Y2
Ion kim loại Hoạt tính còn lại (%)
Nồng độ 1 mM Nồng độ 10 mM
Enzyme ban đầu 100 100
Cu2+ 107 43 Co2+ 132 83 NH4+ 56 63 Sn2+ 96 25 Fe3+ 91 70 Ba2+ 46 89 Ca2+ 95 114 Mn2+ 91 151
Kết quả thể hiện trên bảng 3.6 cho thấy, ion Cu2+ và Co2+ ở nồng độ 1mM có tác dụng làm tăng hoạt tính rCHI lên 107% và 132% so đối chứng. Tuy nhiên, khi ion Cu2+ và Co2+ ở nồng độ 10 mM đã làm giảm hoạt tính rCHI còn 43% và 83% so với đối chứng. Các ion Ca2+ và Mn2+ ở nồng độ 1 mM kìm hãm hoạt động của rCHI, nhƣng ở nồng độ 10 mM sự có mặt của các ion Ca2+, Mn2+ làm tăng họat tính rCHI lên 114% và 151% so với đối chứng. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của De và cộng sự (2011) khi nghiên cứu ảnh hƣởng của ion kim loại Ca2+ và Mn2+ đến hoạt tính chitinase của chủng Bacillus sp. Hu1 [10]. Trong số các ion nghiên cứu, ion Ba2+,NH4+
ức chế mạnh hoạt động rCHI ở cả hai nồng độ 1 mM (còn lần lƣợt 56% và 46%) và 10 mM (còn lần lƣợt 63% và 89%) khi so với đối chứng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Đã nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy, hình thái tế bào và đặc tính sinh lý và sinh hóa của chủng vi khuẩn KNUC213 có hoạt tính chitinase cao. Kết quả phân loại cho thấy chủng KNUC213 thuộc loài Bacillus licheniformis. Chủng B. licheniformis KNUC213 đƣợc sử dụng làm
nguồn cung cấp gen chi mã hóa chitinase.
2. Đã khuếch đại thành công gen chi mã hóa chitinase của chủng B.
licheniformis KNUC213. Trình tự gen chi có kích thƣớc 1731 bp (JN662350) mã hóa cho protein gồm 576 amino acid, có độ tƣơng đồng cao (đạt 96-99%) so với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank (NCBI). 3. Đã thiết kế vector biểu hiện pPICZαA::chi và tạo thành công chủng P.
pastoris Y2 có khả năng biểu hiện rCHI. Bƣớc đầu nghiên cứu biểu
hiện cho thấy chủng nấm men tái tổ hợp P. pastoris Y2 biểu hiện rCHI cao nhất (đạt 652,3 U/ml) trên môi trƣờng BMGY, cảm ứng bởi methanol 1,0% (v/v) sau 72 giờ nuôi cấy. Trọng lƣợng phân tử của rCHI khi kiểm tra trên bản điện di SDS-PAGE là khoảng 63 kDa.
4. Đã nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ của rCHI. Enzyme rCHI có nhiệt độ và pH phản ứng tối ƣu lần lƣợt là 60oC và pH 6,0; rCHI thể hiện hoạt tính ổn định khi giữ ở dải nhiệt độ 30-70°C và dải pH 5,0-7,0. Các ion kim loại Ca2+, Co2+, Cu2+ và Mn2+có tác dụng làm tăng hoạt tính rCHI và các ion Ba2+
,NH4 +
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
KIẾN NGHỊ
1. Nghiên cứu điều kiện lên men nâng cao sinh tổng hợp chitinase từ chủng P. pastoris X33/pPICZαA::chi.
2. Nghiên cứu tinh sạch, thu hồi chế phẩm rCHI kỹ thuật và thử nghiệm khả năng ứng dụng của chitinase trong chuyển hóa chitin thành chitooligosaccharide.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Đức Ý. (2006) Dinh dƣỡng với viêm khớp. Tạp chí sức khỏe đời sống 344: 9-10.
2. Phạm Lê Dũng, Trịnh Bình, Lại Thu Hiền. (1997) Vật liệu sinh học từ chitin. Nxb Trung tâm khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia.
3. Trần Đình Toại. (2008) Nghiên cứu chiết tách chitin từ đầu vỏ tôm bằng các phƣơng pháp sinh học. Nxb Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
4. Trần Thị Luyến, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và một số cộng sự. (2000) Hoàn thiện quy trình sản xuất Chitin-Chitosan và chế biến một số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu vỏ tôm, cua. Báo cáo khoa học, Đề tài cấp bộ, Nha Trang.
5. Vũ Thị Ngọc Thanh, Đoàn Trọng Phụ, Nguyễn Thị Ty. (2000) Nghiên cứu tác dụng tăng sinh collagen của chitosan trong điều trị bỏng nhiệt thực nghiệm. Tạp chí Dược học 9(9): 10-14.
Tài liệu tiếng Anh
6. Cemal S, Murat K, Sabrie C, Ali OB. (2008) Cloning, expression, purification and characterisation of a thermostable chitinase from
Bacillus licheniformis A1. Annual Review Microbiology 58(2): 245-
251.
7. Chien-JH, Tang KW, Shu CC, Chao YC. (2005) Identification of an Antifungal Chitinase from a Potential Biocontrol Agent Bacillus cereus 28-9. J Biochemistry Molecular Biology 38(1): 82-88.
8. Dahiya N, Tewari R, Hoondal GS. (2006) Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review. Applied Microbiology Biotechnology
71: 773–782.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
and thermo-toleran chitinase C of Salinivibrio costicola expressed in Escherichia coli. Annual Review Microbiology 57 (2): 249-257.
10. De HD, Hu WL, Huang GR, Li W. (2011) Purification and characterization of a novel extracellular chitinase from thermophilic
Bacillus sp. Hu1. African J Biotechnology 10(13): 2476-2485.
11. Fernandez JM, Hoeffler JP. (1999) Gene expression system. Academia
expression: 158-191.
12. Hirono I, Yamashita M, Aoki T. (1998) Molecular cloning of chitinase genes from Vibrio anguillarum and V. parahaemolyticus. J Applied Microbiology 84: 1175–1178.
13.Hou WC. (1998) Chitinase activity of sweet potato. Botanical Bulletin
Academia Sinica 39: 93-97.
14. Howard MB, Ekborg NA, Taylor LE, Weiner RM, Hutcheson SW. (2003) Genomic analysis and initial characterization of the chitinolytic system of Microbulbifer degradans strain 2–40. J Bacteriology 185: 3352–3360.
15. Invitrogen. (2005) A manual of methods for expression of recombinant proteins in P. passtoris, Pichia Expression Kit, Catalog N0 K1740-s01:
1-56.
16.Kim KJ, Yang YJ, Kim JG. (2003) Purification and Characterization
of Chitinase from Streptomyces sp. M-20. J Biochemistry Molecular
Biology 36( 2): 185-189.
17. Lamarque G, Cretenet M, Viton C, Domard A. (2005) New route of deacetylation of a- and b-chitins by means of freeze-pump out-thaw cycles. Biomacromolecules 6: 1380–1388.
18. Loni PP, Bajekal. (2011) Alkaline chitinase from Bacillus firmus
SBPL-05 isolated from Alkaline-Saline environment of Lonar Lake.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
19. Ouakfaoui SE, Asselin A. (1992) Multiple forms of chitinase activities.
Phytochemistry 31: 1513–1518.
20. Patcharaporn S, Mongkon A, Kunio O, Chanpen W. (2006) Purification and characterization of a Bacillus circulans No. 4.1
chitinase expressed in Escherichia coli. World J Microbiology Biotechnology 22: 331–335.
21. Peberdy JF. (1985) Mycolytic enzymes. Fungal protoplasts—