* Nguyên tắc:
Dƣới tác dụng của điện thế cao, thành tế bào dãn ra tạo thành các lỗ, nhờ đó DNA di chuyển theo điện trƣờng xâm nhập vào trong tế bào. Khi ngừng xung điện, cấu trúc của màng phục hồi và giữ DNA lại bên trong tế bào [23].
* Chuẩn bị tế bào P. pastoris khả biến:
Cấy chuyển chủng nấm men P. pastoris X33 vào 5 ml môi trƣờng YPD lỏng, lắc ở 30°C, 200 vòng/phút qua đêm. Hút 1 ml dịch nuôi cấy cho vào 200 ml môi trƣờng YPD lỏng, tiếp tục lắc qua đêm (khoảng 16-18 giờ) đến khi OD600nm đạt 1,6 đơn vị. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút để thu tế bào nấm men. Tủa tế bào đƣợc hòa tan vào 40 ml nƣớc lạnh deion vô trùng, để mẫu trên đá 10-15 phút. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút. Hòa lại tủa vào
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
20 ml nƣớc lạnh, để trên đá 10 phút, lắc nhẹ. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút để thu tủa tế bào nấm men, tủa đƣợc dồn lại và hòa vào 10 ml sorbitol 1M lạnh, lắc đều và để trên đá 5 phút. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút ở 4°C để thu tủa. Sau đó, tế bào đƣợc hòa vào 100 l sorbitol 1M lạnh, lắc và chia đều vào các eppendorf, mỗi ống eppendorf chứa 40 l dịch tế bào dùng cho xung điện. Tế bào đƣợc giữ trên đá và chỉ sử dụng trong ngày [15].
* Biến nạp bằng xung điện:
Hút 10 l DNA vector đã mở vòng và loại muối vào 40 l dịch tế bào và đảo nhẹ để DNA phân bố đồng đều. Ống còn lại làm đối chứng không bổ sung DNA thay vào đó là thêm 10l nƣớc deion vô trùng. Chuyển dịch tế bào chứa DNA vào trong curvet xung 1mm đã đƣợc đặt trong lạnh, đặt trên đá thêm 5 phút. Xung điện đƣợc tiến hành trên máy Bio-rad gen –pulsher với các thông số nhƣ sau: C = 25 F, V = 1,5 V, R = 200 trong 4-5 giây. Bổ sung 600 l dung dịch 1M sorbitol lạnh vào mẫu, dùng pipet đảo đều và chuyển sang ống effendorf vô trùng, ủ ở 30°C trong 1 giờ. Sau đó, trải 100 l tế bào nấm men biến nạp pPICZA bằng xung điện lên đĩa chứa môi trƣờng YPDS có bổ sung zeocine (100 mg/ml) với nồng độ khác nhau và ủ ở 30°C từ 3-5 ngày. Tế bào nấm men không qua xung điện đƣợc sử dụng làm đối chứng [15].
2.2.12. Biểu hiện rCHI
Để biểu hiện rCHI trong tế bào nấm men, dòng nấm men tái tổ hợp P.
pastoris X33/pPICZαA::chi đƣợc nuôi cấy ở nhiệt độ 28C trong thời gian 24
giờ trên môi trƣờng YPD ở 30°C khi OD600nm đạt 2-6 đơn vị. Sau đó, cấy chuyển với lƣợng giống 5% (v/v) sang môi trƣờng BMGY. Tiếp đó nuôi ở 28C và cứ sau 24 giờ nuôi cấy thì cảm ứng bằng cách bổ sung 0,5%(v/v) methanol vào môi trƣờng. Chủng nấm men P. pastoris X33/pPICZαA trong
môi trƣờng BMGY với chế độ cảm ứng tƣơng tự đƣợc sử dụng làm đối chứng âm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn