Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli bằng phƣơng pháp sốc nhiệt

* Nguyên tắc:

Dƣới tác dụng của CaCl2 lạnh, thành tế bào E. coli trở nên xốp và dãn ra tạo thành các lỗ, tạo điều kiện cho DNA plasmid có thể chui qua các lỗ trên màng vào tế bào chất khi nhiệt độ thay đổi đột ngột, các lỗ này khép lại không cho các plasmid đi ra [23].

* Quy trình tạo tế bào khả biến:

Cấy chuyển một khuẩn lạc E. coli DH5α vào 5 ml môi trƣờng LB lỏng, lắc 200 v/p ở 37C qua đêm. Chuyển 0,5 ml dịch tế bào sang 50 ml môi trƣờng LB, tiếp tục cấy và nuôi lắc 200 v/p ở 37C cho tới khi mật độ tế bào (OD600 nm) đạt từ 0,4-0,6 đơn vị. Sau đó lấy mẫu và ủ dịch nuôi ở 4C trong 1 giờ. Từ bƣớc này tất cả các thao tác đều đƣợc tiến hành ở 4C. Ly tâm 5.000 v/p trong 10 phút. Sinh khối tế bào đƣợc hoà vào trong 50 ml CaCl2 100 mM. Ủ mẫu 15 phút và ly tâm thu sinh khối tế bào ở 3.500 v/p trong 10 phút. Sinh khối tế bào đƣợc hoà lại lần 2 trong 25 ml CaCl2 100 mM, ủ mẫu 10 phút ở 4C. Ly tâm 4.000 v/p trong 10 phút ở 4C thu sinh khối, sau đó tiếp tục đƣợc hòa lại trong 5 ml CaCl2 100 mM, bổ sung glycerol 75% và bảo quản ở - 80C.

* Quy trình biến nạp:

Sinh khối tế bào khả biến đƣợc lấy ra từ tủ -80C, đƣợc rã đông trong đá với thời gian 30 phút. Sau đó bổ sung vào mỗi ống tế bào khả biến 1-10 μg DNA, đảo nhẹ nhàng để DNA phân bố đều trong dịch. Ủ mẫu ở 4C trong khoảng 30 phút. Mẫu đƣợc sốc nhiệt ở bể ổn nhiệt 42C trong 1 phút 30 giây. Sau đó ủ mẫu ở 4°C trong 2 phút. Bổ sung 0,6 ml LB, lắc nhẹ hỗn hợp tế bào ở 37°C trong 45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

phút. Hút 100 µl dịch tế bào cấy trải trên đĩa môi trƣờng LB có bổ sung Amp 100 μg/ml và X-Gal 40 μg/ml. Ủ đĩa ở 37C qua đêm.