3.1.1. Đặc điểm nuôi cấy
Để xác định khả năng sinh trƣởng phát triển và đặc điểm nuôi cấy của chủng KNUC213, các quan sát hình thái của vi khuẩn đƣợc xác định khi nuôi vi khuẩn trên các môi trƣờng thạch MS1; MS2; MS3 và LB trong 48 giờ ở nhiệt độ 37C. Kết quả quan sát đặc điểm nuôi cấy đƣợc thể hiện trong bảng 3.1 và trên hình 3.1.
Bảng 3.1. Đặc điểm nuôi cấy của chủng vi khuẩn KNUC213 trên môi các trƣờng thạch khác nhau
Đặc điểm Môi trƣờng nuôi cấy
LB MS1 MS2 MS3 Khả năng phát triển Tốt Tốt Tốt Kém Hình dạng khuẩn lạc Tròn không đều Tròn không đều Tròn không đều Tròn không đều
Mép khuẩn lạc Răng cƣa Răng cƣa Răng cƣa Răng cƣa Màu sắc khuẩn lạc Nâu nhạt Trắng đục Kem Kem Bề mặt khuẩn lạc Trơn, khô Lồi, khô Lồi, khô Lồi, khô Mặt dƣới khuẩn lạc Kem Trắng đục Trắng đục Trắng đục Sắc tố tiết ra môi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc chủng KNUC213 trên môi trƣờng LB sau
48 giở ở nhiệt độ 37C.
Hình 3.2. Hình dạng tế bào chủng KNUC213 (x 20.000 lần)
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, chủng KNUC213 phát triển tốt trên cả ba môi trƣờng LB, MS1 và MS2. Ngoài ra, chủng KNUC213 phát triển chậm trên môi trƣờng MS3, sau 48 giờ nuôi cấy tạo khuẩn lạc nhỏ (<5mm). Trên các môi trƣờng nuôi cấy mép khuẩn lạc hình răng cƣa; bề mặt khuẩn lạc lồi, khô, khuẩn lạc có màu nâu nhạt, mặt dƣới khuẩn lạc có màu trắng kem đến trắng và không tạo sắc tố tiết ra môi trƣờng.
3.1.2. Đặc điểm hình thái tế bào
Chủng KNUC213 đƣợc nuôi trên môi trƣờng LB lỏng trong thời gian 18 ÷ 20 giờ, nhiệt độ 37oC với tốc độ lắc 200 v/p, sau đó đƣợc cố định và quan sát hình thái tế bào dƣới kính hiển vi. Kết quả thể hiện trên hình 3.2 cho thấy tế bào chủng KNUC213 có dạng hình que ngắn, các tế bào đứng riêng rẽ với kích thƣớc 0,5-0,8x1,5-2,0 m. Ngoài ra khi nhuộm Gram cho thấy chủng KNUC213 là vi khuẩn Gram(+) và sinh bào tử (kết quả không công bố).
3.1.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa
Kết quả nghiên cứu khả năng sử dụng các nguồn carbon của chủng KNUC213 dựa trên kit API 50 CHB (BioMérieux, Pháp) đƣợc thể hiện trên bảng 3.2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa của chủng KNUC213 khi sử dụng kit API 50 CHB sau 48 giờ nuôi cấy ở 37C
STT Phép thử Khả năng sử dụng STT Phép thử Khả năng sử dụng 0 Đối chứng - 25 Esculin + 1 Glycerol + 26 Salixin + 2 Erythritol - 27 Xelobiose + 3 D-Arabinose - 28 Mantose + 4 L-Arabinose + 29 Lactose - 5 Ribose + 30 Melibiose - 6 D-Xylose + 31 Saccarose + 7 L-Xylose - 32 Trehalose + 8 Adonitol - 33 Inulin - 9 -Metyl-D-Glucozit - 34 Melezitose - 10 Galactose + 35 Rafinose - 11 Glucose + 36 Tinh bột + 12 Fructose + 37 Glycogen + 13 Manose + 38 Xylitol - 14 Sorbose - 39 Gentiobiose - 15 Rhamnose - 40 D-Turanose - 16 Dulxitol - 41 D-Lyxose - 17 Inozitol + 42 D-Tagatose + 18 Mannitol + 43 D-Fucose - 19 Sorbitol + 44 L-Fucose - 20 -Metyl-D-Manozit - 45 D-Arabitol - 21 -Metyl-D-Glucozit + 46 L-Arabitol - 22 N-Acetyl-Glucosamin + 47 D-Tagatose + 23 Amygdalin + 48 2-ketogluconat - 24 Arbutin + 49 5-ketogluconat - (+): Phản ứng dƣơng tính (-): Phản ứng âm tính
Kết quả trong bảng 3.2 cho thấy chủng KNUC213 có khả năng phát triển trong môi trƣờng có các nguồn đƣờng nhƣ glucose, galactose, fructose
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
nhƣng không phát triển trên môi trƣờng chỉ có erythritol, D-Arabinose, L- Xylose, adonitol, lactose, melibiose, inulin, melezitose, rafinose, -Metyl-D- Glucozit, xylitol, gentiobiose, sorbose, rhamnose, dulxitol, -Metyl-D- Manozit, D-Turanose, D-Lyxose, D-Fucose, L-Fucose, D-Arabitol, L- Arabitol, 2-ketogluconat, 5-ketogluconat là nguồn carbon. Từ kết quả so sánh đặc điểm sinh hóa của chủng KNUC213 với cơ sở dữ liệu API bằng phần mềm APILAB plus, đặc điểm hình thái theo khóa phân loại vi sinh vật Bergey’s và kết hợp phân tích trình tự gen 16S rDNA (kết quả không công bố) cho thấy chủng KNUC213 có đặc điểm tƣơng đồng với loài Bacillus licheniformis. Do vậy, chủng KNUC213 đƣợc định danh là B. licheniformis
KNUC213.
Hoạt động trao đổi chất của sinh vật có thể coi là kết quả của các phản ứng hoá học, các phản ứng phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ và pH. Đối với vi khuẩn, nhiệt độ có tác động trực tiếp đến các hoạt động sinh lý, phản ứng sinh hóa và quá trình sinh sản của vi khuẩn. Khả năng chịu nồng độ muối, pH và cũng là một trong những đặc điểm sinh lý - sinh hóa quan trọng của chủng vi sinh vật. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố đến khả năng phát triển của vi khuẩn B. licheniformis KNUC213 đƣợc thể hiện trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ, nồng độ muối, pH đến khả năng phát triển của chủng B. licheniformis KNUC213
Đặc điểm Điều kiện sinh trƣởng
Nhiệt độ (oC) 25 ÷ 40
Nồng độ muối (%) 2 ÷ 7
pH ban đầu 3 ÷10
Chủng B. licheniformis KNUC213 có khả năng sinh trƣởng và phát triển ở dải nhiệt độ 25 ÷ 40oC và phát triển tốt nhất ở 37o
C, đây thuộc nhóm vi khuẩn ƣa ấm. Ngoài ra, chủng cũng có thể sinh trƣởng trong dải pH rộng (pH
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3 ÷ 10), phát triển tốt nhất ở pH 5 ÷ 8 và dải nồng độ muối từ 2 ÷ 7%. Khi nuôi cấy chủng B. licheniformis KNUC213 trong môi trƣờng có nồng độ muối >7% không cho thấy sự phát triển, do nồng độ muối cao gây ra hiện tƣợng mất nƣớc trong tế bào, làm thay đổi áp suất thẩm thấu, dẫn tới giảm khả năng trao đổi chất ức chế sinh trƣởng của vi khuẩn.
3.2. TÁCH DÒNG GEN chi MÃ HÓA CHITINASE CỦA CHỦNG B.
licheniformis KNUC213 3.2.1. Tách DNA tổng số
Kết quả kiểm tra sản phẩm DNA tổng số tách từ chủng B. licheniformis KNUC213 trên bản điện di agarose gel 1,0 % đƣợc thể hiện trên hình 3.3.
Hình 3.3. Điện di đồ kiểm tra DNA tổng số của vi khuẩn B. licheniformis KNUC213 trên gel agarose 1,0%.
Kết quả trên hình 3.3 cho thấy, quá trình tách chiết DNA tổng số của chủng B. licheniformis KNUC213 tạo ra băng DNA gọn, sản phẩm DNA không bị cắt thành các đoạn nhỏ. Do vậy, quá trình tách chiết DNA tổng số đƣợc thực hiện thành công. DNA tổng số của chủng B. licheniformis
KNUC213 tiếp đó đƣợc xử lý với RNase nhằm loại bỏ RNA và bảo quản ở 4oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Khuếch đại gen chi bằng kỹ thuật PCR
Đoạn gen chi mã hóa endochitinase của B. licheniformis KNUC213 đƣợc khuếch đại từ DNA tổng số bằng cặp mồi ChiBF và ChiBR nhằm khuếch đại toàn bộ gen chi, đồng thời có gắn thêm vị trí cắt cho enzyme giới
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
hạn NotI và XbaI tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tạo vector biểu hiện. Kết quả kiểm tra quá trình khuếch đại gen chi bằng phản ứng PCR đƣợc thể hiện trên hình 3.4.
Hình 3.4. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm PCR bằng cặp mồi ChiBF và ChiBR trên gel agarose 1,0%. (Đƣờng chạy M: Thang DNA chuẩn (0,25-10kb);
Đƣờng chạy 1: Sản phẩm của phản ứng PCR khuếch đại gen chi từ DNA tổng số của B.
licheniformis KNU213)
Sản phẩm khuếch đại gen chi bằng kỹ thuật PCR cho một băng DNA
duy nhất có kích thƣớc 1,7 kb trên bản gel agarose 1,0% (Hình 3.4), tƣơng ứng với kích thƣớc mong đợi khi thiết kế mồi để khuếch đại gen chi. Sản
phẩm PCR đƣợc tinh sạch và sử dụng trong thí nghiệm tách dòng, giải giải trình gen chi.
3.2.3. Tách dòng gen chi trong vector pJET1.2/blunt
Sản phẩm PCR khuếch đại gen chi đã tinh sạch đƣợc gắn vào vector
tách dòng pJET1.2/blunt nhằm tạo plasmid pJET1.2/blunt::chi và biến nạp vào E. coli XL1-blue. Kết quả kiểm tra plasmid tách từ các dòng tế bào E. coli XL1-blue khi nuôi cấy trên môi trƣờng LB/ampicillin 100 µg/ml đƣợc thể
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.5. Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp tách từ tế bào E. coli XL1- blue. (Đƣờng chạy 1: sản phẩm plasmid pJET1.2/blunt::chi vàđƣờng chạy 2, 3: Sản phẩm
plasmid pJET1.2/blunt (đối chứng âm)).
Kết quả trên hình 3.5 cho thấy, sau quá trình biến nạp đã chọn đƣợc các dòng tế bào E. coli XL1-blue mang plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt::chi ở
đƣờng chạy số 1 do plasmid này có kích thƣớc lớn hơn các plasmid ở đƣờng chạy số 2 và 3 là các plasmid gốc pJET1.2/blunt không chƣa đoạn chèn (đƣợc sử dụng làm đối chứng âm). Plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt::chi tiếp tục kiểm tra bằng cách xử lý với hai enzyme giới hạn NotI và XbaI. Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt sau quá xử lý pJET1.2/blunt::chi với hai enzyme giới hạn trên bản điện di gel agarose 1,0 % đƣợc thể hiện trên hình 3.6.
Hình 3.6. Điện di đồ kiểm tra sự có mặt gen chi của chủng B. licheniformis KNU213 trong vector tách dòng pJET1.2/blunt::chi. (Đƣờng chạy
1: plamid pJET1.2/blunt::chi đƣợc xử lý bởi hai enzyme giới hạn NotI và XbaI và Đƣờng
chạy M: Thang DNA chuẩn (0,25-10kb)).
Kết quả điện di đồ thể hiện trên hình 3.6 cho thấy, sản phẩm sau quá trình cắt plasmid ở đƣờng chạy số 1 cho hai băng DNA có kích thƣớc tƣơng ứng là 1,7 kb và 3,0 kb. Băng DNA có kích thƣớc 3,0 kb tƣơng ứng với kích thƣớc vector pJET1.2/blunt khi chƣa mang đoạn gen chi, và đoạn DNA có
kích thƣớc 1,7 tƣơng ứng với kích thƣớc gen chi sử dụng gắn vào vector
pJET1.2/blunt. Kết quả trên cho thấy gen chi đã đƣợc gắn vào vector tách
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
giải trình tự hai chiều đối với gen chi nhờ sử dụng cặp mồi pJET1.2F và
pJET1.2R.
3.2.4. Giải và phân tích trình tự gen chi của B. licheniformis KNUC213
Từ kết quả giải trình tự nucleotide hai chiều của gen chi trong vector
tách dòng pJET1.2::chi, trình tự gen chi đƣợc xử lý, ghép nối thành đoạn gen hoàn chỉnh. Trình tự nucleotide của gen chi của chủng B. licheniformis
KNUC213 (Phụ lục 4) có độ dài 1731 nucleotide mã hóa cho protein gồm 576 amino acid, khối lƣợng phân tử theo tính toán là 63 kDa, điểm đẳng điện pI là 5,26. Trình tự gen chi trong nghiên cứu đã đƣợc đăng ký trên ngân hàng cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) dƣới mã số truy cập JN662350.
Khi so sánh trình tự gen chi của chủng B. licheniformis KNUC213
(JN662350) với các gen tƣơng ứng của các chủng B. licheniformis khác trên GenBank (NCBI) cho thấy độ tƣơng đồng trình tự cao (đạt 97 ÷ 98%). Khi dịch mã gen chi của chủng B. licheniformis KNUC213 sang trình tự amino
acid suy diễn, chúng tôi nhận thấy có 3 nucleotide mã hóa cho 1 amino acid ở vị trí 567 bị mất. Tuy nhiên việc thiếu vị trí amino acid này đã không ảnh hƣởng đến khung đọc mở (Open Reading Frame, ORF) và vị trí trung tâm hoạt động của chitinase ở vị trí 234 (Hình 3.7).
Hình 3.7. So sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen chi của chủng B.
licheniformis KNU213 với trình tự protein tƣơng ứng từ các chủng B. licheniformis khác đƣợc đăng ký trên GenBank (NCBI). (Dấu sao (*) thể hiện sự
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tƣơng đồng trong trình tự amino acid của các enzyme chi. Khung chữ nhật thể hiện vùng
trình tự amino acid của chủng gốc B. licheniformis KNUC213 sai khác hoặc bị xóa 1
amino acid).
Bên cạnh đó, so sánh độ tƣơng đồng trình tự amino acid suy diễn từ gen chi từ B. licheniformis KNUC213 (mã số AEQ55312, trình tự đƣợc gạch chân) với các trình tự amino acid của gen chi từ các chủng B. licheniformis
khác cho tỷ lệ tƣơng đồng đạt 95÷98% (Bảng 3.4). Ngoài ra, trình tự protein suy diễn trong nghiên cứu thể thể hiện độ tƣơng đồng cao nhất với trình tự protein tƣơng ứng từ B. licheniformis DSM 8785 (mã số truy cập
ACK44109).
Bảng 3.4. Kết quả so sánh độ tƣơng đồng trình tự amino acid của endochitinase từ B. licheniformis KNUC213 (AEQ55312) với các trình tự amino acid của chitinase tƣơng ứng từ các chủng B. licheniformis khác đƣợc đăng ký trên GenBank (NCBI).
Mã truy cập ACU43581 ACM46020 ACK44109 AEQ55312 ACW83016 ACU43581 100,0
ACM46020 99,5 100,0
ACK44109 95,6 96,5 100,0
AEQ55312 95,3 95,8 98,5 100,0
ACW83016 93,8 96,7 96,7 97,0 100,0
Ghi chú: ACU43581: Trình tự amino acid của chitinase của chủng B. licheniformis N1;
ACM46020: trình tự amino acid của chitinase của chủng B. licheniformis CBFOS-03;
ACK44109: trình tự amino acid của chitinase của chủng B. licheniformis DSM 8785;
AEQ55312: trình tự amino acid của chitinase của chủng B. licheniformis KNUC213;
ACW83016: trình tự amino acid củachitinase của chủng B. licheniformis DSM 13.
Các kết quả phân tích trình tự cho thấy đoạn gen đƣợc tách dòng từ chủng B. licheniformis KNUC213 là gen chi mã hóa cho endochitinase. Theo một số tác giả, endochitinase của các chủng B. licheniformis có ái lực mạnh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tạo thành các chitooligosaccharide. Gen chi do đó đƣợc sử dụng làm nguồn
gen nhằm biểu hiện rCHI trong nấm men P. pastoris.
3.3. BIỂU HIỆN GEN chi MÃ HÓA CHITINASE TỪ CHỦNG B.
licheniformis KNUC213 TRONG P. pastoris X33 3.3.1. Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA::chi
Gen chi đƣợc cắt khỏi vector tách dòng pJET1.2/blunt::chi bằng hai enzyme giới hạn NotI và XbaI và gắn vào vector pPICZαA nhằm tạo vector
biểu hiện pPICZαA::chi. Sản phẩm sau quá trình ghép nối đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli XL1- blue và sàng lọc trên môi trƣờng LB có bổ sung 100 µg/ml zeocin. Plasmid tách từ E. coli XL1- blue đƣợc kiểm tra trên bản điện di agarose gel 1% (đƣờng chạy 3 và 4 ở hình 3.8) và cắt kiểm tra bằng hai enzyme giới hạn NotI và XbaI (đƣờng chạy 1, hình 3.8).
Hình 3.8. Điện di đồ sản phẩm cắt vector biểu hiện pPICZαA::chi bằng hai enzyme giới hạn trên gel agarose 1,0%. (Đƣờng chạy 1: Vector biểu hiện
pPICZαA::chi đƣợc cắt bởi hai enzyme giới hạn NotI và XbaI; Đƣờng chạy 2: Thang DNA
chuẩn (0,25-10kb); Đƣờng chạy 3: pPICZαA; Đƣờng chạy 4: pPICZαA::chi).
Kết quả thể hiện trên hình 3.8 cho thấy, sản phẩm sau quá trình cắt vector pPICZαA::chi bằng hai enzyme giới hạn NotI và XbaI cho hai băng
DNA có kích thƣớc lần lƣợt là 1,7 kb và 3,6 kb. Trong đó băng DNA có kích thƣớc 1,7 kb tƣơng ứng với kích thƣớc của gen chi và băng DNA có kích
thƣớc 3,6 kb tƣơng ứng với kích thƣớc vector pPICZαA. Nhƣ vậy vector pPICZαA::chi đã đƣợc thiết kế thành công.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.2. Tạo chủng P. pastoris tái tổ hợp có khả năng biểu hiện rCHI
Để tạo nấm men P. pastoris tái tổ hợp có khả năng biểu hiện gen chi,
chủng nấm men P. pastoris X33 (Mut+) đƣợc chọn làm tế bào biểu hiện và
pPICZαA::chi đã mở vòng đƣợc biến nạp vào trong tế bào nấm men bằng xung điện. Theo lý thuyết, sau khi biến nạp pPICZαA::chi đã mở vòng vào nấm men P. pastoris X33 sẽ xảy ra quá trình trao đổi chéo tích hợp vào vùng gen AOX1 trên hệ gen của nấm men.
Để tăng hiệu suất biến nạp, cũng nhƣ tăng hiệu suất trao đổi chéo plasmid pPICZαA::chi đƣợc mở vòng (linearized) để chuyển thành dạng DNA mạch thẳng. Theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất, vector pPICZαA có ba điểm mở vòng bởi ba enzyme giới hạn là SacI, PmeI và BstXI. Tuy nhiên,
trên trình tự gen chi chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn SacI và BstXI nên pPICZαA::chi đƣợc mở vòng bằng enzyme giới hạn PmeI. Sản phẩm sau phản ứng mở vòng plasmid pPICZαA::chi bằng enzyme PmeI đƣợc kiểm tra