Nghiên cứu tách dòng và biểu hiện kháng nguyên virus PCV2 trong escherichia coli

Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN DANH MỤC ẢNH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 100 1.1 Bệnh PMWS .100 1.2 Tác nhân gây bệnh PMWS 10 1.2.1 Đặc điểm cấu tạo vi rút PCV2 12 1.2.2 Sức đề kháng vi rút PCV2 144 1.2.3 Cơ chế xâm nhiễm vi rút PCV2 14 1.2.4 Nguyên nhân lây nhiễm vi rút PCV2 17 1.3.Các vật chủ đƣợc sử dụng để nghiên cứu tách dòng biểu gen ORF2 virus PCV2 17 1.3.1 Hệ biểu baculovirus tế bào côn trùng 17 1.3.2 Hệ biểu Escherichia coli .18 1.4 Những nghiên cứu biểu gen ORF2 vi rút PCV2 giới Việt Nam .18 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nguyên vật liệu 200 2.1.1 Chủng vi sinh vật .200 2.1.2.mRNA, Vector tách dòng vector biểu hiện, gen ORF2 tối ƣu 20 2.1.3 Hóa chất 20 2.1.4 Thiết bị 21 2.1.5 Các dung dịch môi trƣờng sử dụng 22 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Phƣơng pháp vi sinh vật .24 2.2.2 Phƣơng pháp hóa sinh .26 -1- Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp 2.2.3 Phƣơng pháp sinh học phân tử .28 2.2.4 Phƣơng pháp tin sinh học .38 PHẦN III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Khuếch đại gen orf2 porcine circovirus kỹ thuật RT-PCR 40 3.2.Tách dòng gen orf2 vector pJET1.2/blunt 41 3.3 Xác định trình tự gen orf2 44 3.4 Tạo cấu trúc vector biểu tái tổ hợp mang gen orf2 .46 3.4.1 Tối ƣu hóa trình tự gen orf2 phù hợp chủng chủ E coli 47 3.4.2 Tạo cấu trúc biểu tái tổ hợp 50 3.4.3 Biểu protein orf2 E coli 54 3.5 Khảo sát điều kiện cảm ứng 55 3.5.1 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG 55 3.5.2 Khảo sát nhiệt độ cảm ứng 56 3.5.3 Khảo sát thời gian cảm ứng 57 3.6 Tinh protein 58 PHẦN IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 4.1 Kết Luận 60 4.2 Kiến Nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 65 Phụ lục 1: Cấu trúc vector tách dòng pJET1.2/blunt 65 Phụ lục : Cấu trúc vector biểu PET22b 66 -2- Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn tốt nghiệp “Nghiên cứu tách dòng biểu kháng nguyên PCV2 Escherichia coli” kết nghiên cứu tôi, đƣợc thực dƣới hƣớng dẫn khoa học TS Trƣơng Quốc Phong (Trƣởng phòng Proteomic-Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội) Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đƣợc đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web, tài liệu tham khảo luận văn Tác giả Thiều Thị Lan Anh -3- Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Trƣơng Quốc Phong ( Trƣởng phòng thí nghiệm Proteomics – Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học – Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội ), thầy tận tình hƣớng dẫn, chu đáo dìu dắt suốt trình nghiên cứu thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô cán công tác Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội góp ý kiến quý báu cho tôi, giúp đỡ trình thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè quan tâm, ủng hộ động viên suốt trình nghiên cứu, giúp hoàn thành tốt luận văn Do điều kiện, khả thời gian thực có giới hạn nên đề tài tránh khỏi sai sót Tôi mong nhận đƣợc đóng góp thầy cô bạn để đề tài đƣợc hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2015 Học viên thực Thiều Thị Lan Anh -4- Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN Amp Ampicillin a.a Axit amin APS Ammonium persulphate DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotid 5’-triphosphates EtBr Ethidium bromide EDTA Ethylen diamine tetraacetic acid ITPG Isopropyl β-D-1-thiogalatopyranoside Kb Kilo base kDa Kilo Dalton mRNA messenger RNA OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PMWS Post-weaning multisystemic wasting syndrome RE Enzyme cắt hạn chế RNA Ribonucleic Acid SDS – PAGE Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis TAE Tris-Acetate-EDTA TE Tris-EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine -5- Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp DANH MỤC ẢNH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM HÌNH TRANG Hình 1.1 Bộ gen virus PCV ISU-31 (A) PCV PK-15 (B) 12 Hình1.2 Cơ chế biểu bệnh 15 Hình1.3 Cơ chế gây bệnh virus PCV2 16 Hình 3.1 Phổ điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR 41 Hình 3.2 Sơ đồ tách dòng gen orf2 41 Hình 3.3 Phổ điện di plasmid sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu 43 gen orf2 khuôn plasmid từ khuẩn lạc lựa chọn Hình 3.4 Phổ điện di sản phẩm cắt plasmid enzyme hạn chế 44 Hình 3.5 Trình tự gen khung đọc gen orf2 tách dòng 45 Hình 3.6 Kết so sánh trình tự gen nhận diện loài sử dụng công 46 cụ Blastn trình tự gen orf2 ngân hàng NCBI Hình 3.7 Sơ đồ tạo cấu trúc vector biểu tái tổ hợp 46 Hình 3.8 Trình tự gen orf2 sau tối ưu 47 Hình 3.9 Sự phân bố tần số sử dụng ba mã hóa dọc theo chiều dài 48 gen gốc (A) sau tối ưu (B) Hình 3.10 Phân bố tỷ lệ phần trăm ba mã hóa tối ưu 49 Hình 3.11 Phân bố thành phần GC đoạn gen gốc (A) gen tối 50 ưu (B) -6- Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp Hình 3.12 Phổ điện di sản phẩm PCR 51 Hình 3.13 Phổ điện di plasmid tách chiết từ dòng tương ứng 52 Hình 3.14 Phổ điện di sản phẩm PCR sử dụng khuôn plasmid 53 Hình 3.15 Phổ điện di sản phẩm cắt plasmid enzyme giới hạn 53 NcoI/XhoI Hình 3.16 Phổ điện di protein gel SDS-PAGE 54 Hình 3.17 Phổ Western blot 55 Hình 3.18 Kết khảo sát nồng độ cảm ứng IPTG nồng độ 56 khác Hình 3.19 Kết khảo sát nhiệt đô cảm ứng IPTG 57 Hình 3.20: Kết khảo sát thời gian cảm ứng 58 Hình 3.21: Hình ảnh sắc ký đồ 59 Hình 3.22: Hình ảnh điện di sản phẩm protein sau tinh 59 -7- Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp MỞ ĐẦU Ngành chăn nuôi ngày phát triển giữ vai trò quan trọng kinh tế Đặc biệt, ngành chăn nuôi lợn có nhiều thay đổi đáng kể, trở thành nguồn thu nhập quan trọng ngành nghề góp phần dịch chuyển cấu kinh tế nông nghiệp, đáp ứng nhu cầu thực phẩm ngƣời dân Cùng với phát triển ngành chăn nuôi, kéo theo gia tăng tình hình dịch bệnh Vào nửa cuối thập niên 90, hội chứng còi cọc sau cai sữa (post-weaning multisystemic wasting syndrome - PMWS) tạo nên cú sốc mạnh cho ngành công nghiệp chăn nuôi lợn PMWS bệnh nguy hiểm lợn, gặp chủ yếu lợn từ 6-12 tuần, đặc biệt pha tăng trƣởng sớm, nhƣng thời gian gần đƣợc nhận thấy nhóm tuổi khác Bệnh PMWS đƣợc phát lần đầu Canada vào năm 1991, lan rộng khắp nƣớc có ngành chăn nuôi lợn ở: Châu Âu, Châu Mỹ, Châu Á Những mô tả triệu chứng lâm sàng điển hình PMWS còi cọc, bệnh đƣờng hô hấp, da vàng, viêm ruột, tiêu chảy kéo dài; hạch lympho tăng kích thƣớc, gầy ốm, khó thở hầu hết lợn bị nhiễm chết (Clark, 1996, 1997; Harding, 1996, 1997; Harding , 1998; Rosell et al., 1999) Những đặc điểm hoàn toàn không giống với bệnh khác lợn đƣợc biết vào thời điểm Những nghiên cứu xa sau mối liên hệ PMWS vi rút PCV chứng khoa học cho thấy vi rút PCV tham gia vào Hội chứng PMWS hoàn toàn khác với tạp nhiễm tế bào PK15 (Ellis cs, 1998; Larochelle cs., 1999; Morozov cs., 1998; Nayar cs., 1997; Ouardani cs., 1999) Tác nhân truyền nhiễm sau đƣợc đặt tên PCV2 (Meehan cs., 1998) Hiện nay, biện pháp ngăn chặn chữa trị nhiễm trùng PCV2 tập trung vào phƣơng pháp vệ sinh quản lý để kiểm soát bệnh phức tạp áp dụng thay đổi phƣơng thức quản lý nhằm giảm tối đa tác nhân gây stress đƣợc biết nhƣ nguyên nhân làm lan nhiễm PMWS Đã có báo cáo cho biện pháp ngăn chặn PMWS hiệu tiến hành tiêm ngừa vaccine PCV2 Đến nay, vaccine PCV2 vô hoạt vaccine vô hoạt tiểu phần PCV2 ORF2 đƣợc phát triển giới -8- Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp thiệu thị trƣờng Ở Việt Nam, vaccine phòng bệnh PCV2 hoàn toàn phải nhập ngoại với giá thành cao Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trên, thực đề tài: “Nghiên cứu tách dòng biểu kháng nguyên virus PCV2 Escherichia coli” Đề tài đƣợc thực Trung tâm nghiên cứu phát triển Công nghệ Sinh học – Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội Mục đích nghiên cứu đề tài:  Khuếch đại gen orf2 từ mRNA PCV2 phƣơng pháp RT-PCR sử dụng mồi đặc hiệu  Tách dòng thành công, xác định trình tự gen khung đọc mở gen orf2  Tạo thành công cấu trúc biểu pET::orf2 tái tổ hợp biểu protein orf2 tái tổ hợp E coli  Tối ƣu số điều kiện biểu  Bƣớc đầu tinh đƣợc protein tái tổ hợp orf2 -9- Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh PMWS Hội chứng còi cọc sau cai sữa PMWS hầu hết phổ biến lợn từ - tháng tuổi, vào thời gian lợn có biểu lâm sàng có lƣợng vi rút tập trung huyết cao nhất, thải vi rút mức độ cao chứng minh phản ứng kháng thể yếu so với vật mắc bệnh cận lâm sàng Tỷ lệ nhiễm trại thƣờng từ – 30% lên tới 50 – 60% Tỷ lệ tử vong phạm vi – 20% Ở lợn sau cai sữa - tuần bắt đầu xuất triệu chứng PMWS Các dấu hiệu lâm sàng ban đầu gồm giảm cân, chênh lệch trọng lƣợng lợn đàn, tỷ lệ tử vong đàn tăng John C.S.Harding cs (1998) cho biết biểu lâm sàng còi cọc, chậm lớn Hiện tƣợng rối loạn hô hấp mức độ khác từ nhẹ đến tử vong “không phân biệt đƣợc lâm sàng với bệnh hô hấp khác” Hạch bẹn sƣng kết hợp tiêu chảy mạnh, phân màu nâu, nƣớc mạnh Vàng da nhợt nhạt thiếu máu không phục hồi kết hợp với vi rút tác động đến tủy xƣơng suy dinh dƣỡng Các biểu lâm sàng khác có lợn trƣớc chết PMWS là: què quặt, suy tim, viêm khớp, chết đột ngột, co giật Nghiên cứu Welch J cs (2006); Yilmaz A cs (2004), đàn với triệu chứng PMWS mức nhẹ, dấu hiệu mức độ khác tùy thuộc vào trình quản lý chăm sóc, nhƣng dễ nhận thấy dũi mõm liên tục 1.2 Tác nhân gây bệnh PMWS Nhiều nghiên cứu rằng, gần nhƣ hầu hết lợn thƣơng phẩm bị nhiễm vi rút Porcine Circovirus type (PCV2) vào thời điểm thời kỳ sinh trƣởng phát triển chúng Tỷ lệ nhiễm PCV2 cao, chiếm 90 - 100%, nhƣng tỷ lệ lợn mắc bệnh PMWS điển hình lại thấp, khoảng - 15% Thực tế khiến nhiều nhà nghiên cứu PMWS phải suy nghĩ ý đến nhiều yếu tố quan trọng khác liên quan đến Hội chứng nhƣ triệu chứng cận lâm sàng, tử vong Những mô hình thực nghiệm đánh giá khả sinh sản lợn mắc PMWS đƣợc tiến hành việc gây nhiễm đồng thời vi rút PCV2 với porcine - 10 - Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp Hình 3.14 Phổ điện di sản phẩm PCR sử dụng khuôn plasmid từ dòng tương ứng (giếng 2-3) plasmid đối chứng pET22b (giếng 1); M, thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scientific) Hình 3.15 Phổ điện di sản phẩm cắt plasmid enzyme giới hạn NcoI/XhoI (giếng 1) PCR (giếng 2) M, thang DNA chuẩn - 53 - Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp 3.4.3 Biểu protein orf2 E coli Khuẩn lạc E coli BL21 (DE3) tái tổ hợp đối chứng chứa vector pET22 đƣợc nuôi lắc (150 vòng/phút) môi trƣờng LB lỏng chứa 100 ug/ml ampicilin qua đêm 37oC Chuyển dịch nuôi qua đêm sang môi trƣờng LB lỏng (100 ug/ml ampicilin) với tỷ lệ 10% nuôi lắc 37oC Bổ sung chất cảm ứng IPTG nồng mM tiếp tục nuôi điều kiện Sinh khối vi khuẩn đƣợc thu nhận sau cảm ứng đƣợc xử lý đệm chứa M urea Dịch chiết đƣợc thu nhận ly tâm 12 000 vòng/phút 15 phút Dịch chiết protein đƣợc phân tích điện di gel polyacrylamide 12% để kiểm tra khả biểu protein tái tổ hợp Kết đƣợc thể ( hình 3.16) Theo tính toán lý thuyết protein tái tổ hợp ORF2 đƣợc biểu E coli BL21 (DE3) có kích thƣớc khoảng 29 kDa Hình 3.16 Phổ điện di protein gel SDS-PAGE Đường chạy 1, dịch chiết protein mẫu đối chứng (chứa pET22 trắng) có cảm ứng; đường chạy 2, dịch chiết protein mẫu tái tổ hợp (pET::orf2) có cảm ứng IPTG không cảm ứng tương ứng Kết điện di phổ protein hình 3.17 cho thấy xuất băng protein đậm có kích thƣớc khoảng 29 kDa đƣờng chạy mẫu tái tổ hợp đƣợc cảm ứng hoàn toàn không thấy xuất băng tƣơng ứng mẫu đối chứng mẫu cảm - 54 - Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp ứng Kích thƣớc băng protein phù hợp với kích thƣớc lý thuyết protein ORF2 Do nói protein ORF2 đƣợc biểu E coli BL21 (DE3) Theo thiết kế protein đích ORF2 đƣợc biểu mang thêm đuôi His-tag đầu C nên để khẳng định biểu protein E coli tiến hành kiểm tra Western blot sử dụng kháng thể đặc hiệu đuôi His-tag Kết đƣợc thể hình 3.17 Kết cho thấy xuất băng đậm với kích thƣớc khoảng 29 kDa phù hợp với kích thƣớc protein ORF2 tái tổ hợp Do kết luận biểu thành công protei ORF2 porcine circovirus chủng E coli BL21 (DE3) Hình 3.17 Phổ Western blot Đường chạy 1, dịch chiết protein mẫu đối chứng (chứa pET22 trắng) có cảm ứng; đường chạy 2, dịch chiết protein mẫu tái tổ hợp (pET::orf2) có cảm ứng IPTG không cảm ứng tương ứng 3.5 Khảo sát điều kiện cảm ứng 3.5.1 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG Chất cảm ứng đƣợc sử dụng nồng độ thích hợp có khả cảm ứng biểu protein mục tiêu Trong trình khảo sát nhằm tối ƣu điều kiện - 55 - Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp nồng độ chất cảm ứng IPTG ta dựa tiêu chí, sử dụng nồng độ chất cảm ứng mà lƣợng protein biểu đƣợc lớn Để xác định nồng độ IPTG tối ƣu cho việc biểu protein gen orf2, ta tiến hành thử nghiệm lần lƣợt với nồng độ IPTG tƣơng ứng là: mM; 0,1mM; 0,3mM; 0,5mM; 0,7mM; 0,9 mM; 1,1 mM; 1,3mM Cùng với thay đổi nồng độ IPTG, điều kiện khác cần cho cảm ứng protein không thay đổi: nuôi lắc 370C; tốc độ lắc 115 vòng/phút; thời gian cảm ứng Hình 3.18 Kết khảo sát nồng độ cảm ứng IPTG nồng độ khác Kết khảo sát nồng độ chất cảm ứng cho thấy giếng số tƣơng ứng với nồng độ IPTG 0,05mM, băng protein biểu xuất đậm Nhƣ vậy, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,05mM thích hợp số nồng độ ta khảo sát cho việc biểu protein gen orf2 3.5.2 Khảo sát nhiệt độ cảm ứng Nhiệt độ yếu tố ảnh hƣởng trực tiếp đến khả biểu protein gen ORF2 Với điều kiện đƣợc khảo sát trên: Nồng độ chất cảm ứng 0,05mM; thời gian cảm ứng giờ; tốc độ lắc 115 vòng/phút Ta tiến - 56 - Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp hành nuôi lắc nhiệt độ khác 200C; 250C; 300C; 370C Ta tiến hành tách chiết protein dạng thể vùi dạng tan đƣợc kết điện di nhƣ sau: Hình 3.19 Kết khảo sát nhiệt đô cảm ứng IPTG Từ kết điện di, ta thấy nhiệt độ tốt để tổng hợp protein gen ORF2 370C 3.5.3 Khảo sát thời gian cảm ứng Thời gian cảm ứng yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến thu nhận protein Với nồng độ IPTG tối ƣu 0,05mM khảo sát ; nhiệt độ cảm ứng 370C ; ta tiến hành khảo sát với thời gian cảm ứng : ; ; ; ; ; Mẫu đƣợc nuôi lắc với tốc độ 115 vòng/ phút dịch nuôi cấy sau đƣợc thu thời điểm : ; ; ; ; ; Kết điện di cho thấy thời điểm thu đƣợc băng protein có kích thƣớc đậm Vậy ta chọn thời gian cảm ứng thời gian tối ƣu - 57 - Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp Hình 3.20: Kết khảo sát thời gian cảm ứng 3.6 Tinh protein Protein sau đƣợc chiết đƣợc đƣa vào cột sắc ký lực Những protein không liên kết với ion Niken đƣợc rửa khỏi cột đƣợc thu đỉnh đầu tiên; đỉnh sản phẩm tinh protein đích có đuôi His-tag (Hình 3.21) Mẫu protein thu đƣợc sau sắc ký đƣợc điện di gel polyacrylamide nhƣ hình 3.22: Hình 3.21: Hình ảnh sắc ký đồ - 58 - Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp Hình 3.22: Hình ảnh điện di sản phẩm protein sau tinh TS: sản phẩm protein tinh sạch; FT: protein không liên kết với ion Niken bị rửa giải; Thô: dịch protein ban đầu - 59 - Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp PHẦN IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết Luận  Khuếch đại thành công gen ORF2 từ mRNA PCV2 phƣơng pháp RTPCR  Tách dòng thành công, xác định trình tự gen khung đọc mở gen ORF2  Tạo đƣợc chủng E.coli BL21 DE3 tái tổ hợp mang cấu trúc biểu pET22::orf2  Tối ƣu đƣợc điều kiện biểu : nồng độ IPTG (0,05mM); thời gian cảm ứng (4h); nhiệt độ cảm ứng (37oC)  Bƣớc đầu tinh đƣợc protein tái tổ hợp ORF2 4.2 Kiến Nghị Nhƣ trình bày việc sử dụng E.coli ƣu tiên làm tế bào chủ sản xuất protein tái tổ hợp khả sinh sản nhanh, đạt mật độ cao môi trƣờng nuôi cấy rẻ tiền đồng thời gen E coli đơn giản đƣợc giải trình tự Thông thƣờng, sử dụng E coli làm tế bào chủ để sản xuất protein tái tổ hợp protein đƣợc định vị tế bào chất Đây môi trƣờng khử nên protein mục tiêu biểu vƣợt mức thƣờng có xu hƣớng kết tụ, hình thành dạng không tan (thể vùi) protein hoạt tính cấu hình không xác (Zhang Y ctv, 1998) Để phục hồi hoạt tính mong muốn protein mục tiêu, thể vùi (protein mục tiêu) phải đƣợc tách chiết từ tế bào chất, hòa tan thể vùi phải đƣợc tái gấp cuộn để có cấu hình xác Mỗi protein cần phƣơng pháp hòa tan khác thƣờng đƣợc xác định theo kinh nghiệm Các điều kiện khác (ví dụ: guanidine HCl [5-8 M], urea [6-8 M], SDS, alkaline pH, acetonitrile/propanol) đƣợc sử dụng để hòa tan thể vùi Ở đây, sử dụng Ure 8M để hòa tan protein đích - 60 - Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp Hƣớng đề tài sau hòa tan thành công, thử nghiệm phƣơng pháp tái cuộn xoắn khác bao gồm pha loãng thẩm tách Hiệu suất tạo protein hoạt động protein có liên kết disulfite giống nhƣ protein gốc phụ thuộc vào nồng độ, độ tinh kích thƣớc chuỗi polypeptide; độ pH cƣờng lực ion dung môi; tỷ lệ tái cuộn xoắn chúng Các nhân tố khác bao gồm số lƣợng liên kết disulfite chất protein tái huyền phù nƣớc Trong số trƣờng hợp, protein hòa tan khó tái cuộn xoắn ngƣời ta thấy việc bổ sung chaperonins giúp ích cho trình Chaperonins protein cần để đảm bảo cuộn xoắn xác in vivo protein, với khả thuận lợi chaperonin tái tổ hợp chúng đƣợc dùng để xúc tác cho trình tái cuộn xoắn xác in vitro protein Tiếp theo phải kiểm tra cấu hình protein tái tổ hợp có giống cấu hình protein gốc hay không; sau kiểm tra hoạt tính sinh học protein tái tổ hợp đƣợc tạo Sử dụng kháng nguyên ORF2 tái tổ hợp để phát triển kit chuẩn đoán que thử ELISA Phát triển vaccine tái tổ hợp - 61 - Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt : Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen, nguyên lý ứng dụng, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Văn Cách (2005), Tin Sinh học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen, Nhà xuất Đại học Huế Tài liệu Tiếng Anh : Allan GM, Kennedy S, McNeilly F, Foster JC, Ellis JA, Krakowka SJ, Meehan BM, Adair BM 1999 Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus 1999 Chae JS, Choi KS 2010 Genetic diversity of porcine circovirus type from pigs in Republic of Korea 2010 Ellis J, Hassard L , Clark E , Harding J , Allan G , P Willson , Strokappe J , K Martin , McNeilly F , Meehan B , Todd D , Haines D 1998 Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome 1998, Vol 39 Ellis JA, Allan G, Krakowka S 2008 Effect of coinfection with genogroup porcine torque teno virus on porcine circovirus type 2-associated postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic pigs 2008 Grasland B, Loizel C, Blanchard P, Oger A, Nignol AC, Bigarré L, Morvan H, Cariolet R, Jestin A 2005 Reproduction of PMWS in immunostimulated SPF piglets transfected with infectious cloned genomic DNA of type porcine circovirus 2005 - 62 - Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp Grau-Roma L, Crisci E, Sibila M, López-Soria S, M Nofrarias, Cortey M, L Fraile, Olvera A, Segalés J 2008 A proposal on porcine circovirus type (PCV2) genotype definition and their relation with postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) occurrence 2008 Guo L, Lu Y, Wei Y, Huang L, H Wu, Liu C 2011 Porcine circovirus genotype 2a (PCV2a) and genotype 2b (PCV2b) recombinant mutants showed significantly enhanced viral replication and altered antigenicity in vitro 2011 Harding JC 1, Ellis JA , McIntosh KA , Krakowka S 2010 Dual heterologous porcine circovirus genogroup 2a/2b infection induces severe disease in germfree pigs 2010 Harms PA, Sorden SD, Halbur PG, Bolin SR, Lager KM, Morozov I, Paul PS 2001 Experimental reproduction of severe disease in CD/CD pigs concurrently infected with type porcine circovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2001 10 Khaiseb S, Sydler T, Zimmermann D, Pospischil A, Sidler X, Brugnera E 2011 Coreplication of the major genotype group members of porcine circovirus type as a prerequisite to coevolution may explain the variable disease manifestations 2011 11 Long J Guo, Yue H Lu, Yan W Wei, Li P Huang and Chang M Liu 2010 Porcine circovirus type (PCV2): genetic variation and newly emerging genotypes in China 2010 12 Mankertz A, Domingo M, Folch JM, LeCann P, Jestin A, Segalés J, Chmielewicz B, Plana-Durán J, Soike D 2000 Characterization of PCV2 isolates from Spain, Germany and France 2000, Vol 66 13 Opriessnig T, Thacker EL, Yu S, Fenaux M, Meng XJ, Halbur PG 2004 Experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs by dual infection with Mycoplasma hyopneumoniae and porcine circovirus type 2004 - 63 - Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp 14 Paul G Blommel, Katie J Becker, Petar Duvnjak, and Brian G Fox 2007 Enhanced Bacterial Protein Expression During Auto-induction Obtained by Alteration of Lac Repressor Dosage and Medium Composition 2007 15 Rovira A, Balasch M, Segalés J, García L, Plana-Durán J, Rosell C, Ellerbrok H, Mankertz A, Domingo M 2002 Experimental inoculation of conventional pigs with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus 2002 16 Wellenberg GJ, Stockhofe-Zurwieden N, Boersma WJ, Jong MF, Elbers ARW 2004 The presence of co-infections in pigs with clinical signs of PMWS in the Netherlands:a case-control study 2004, Vol 77 17 William Studier, F 2005.Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures 2005 - 64 - Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục 1: Cấu trúc vector tách dòng pJET1.2/blunt - 65 - Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp Phụ lục : Cấu trúc vector biểu PET22b - 66 - Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp - 67 - ... để nghiên cứu tách dòng biểu gen ORF2 virus PCV2 1.3.1 Hệ biểu baculovirus tế bào côn trùng Việc nghiên cứu ứng dụng protein tái tổ hợp giới phát triển mạnh mẽ nhiều thập kỷ qua, nay, nghiên cứu. .. vector biểu PET22b 66 -2- Thiều Thị Lan Anh Luận văn tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn tốt nghiệp Nghiên cứu tách dòng biểu kháng nguyên PCV2 Escherichia coli” kết nghiên cứu. .. Nam, vaccine phòng bệnh PCV2 hoàn toàn phải nhập ngoại với giá thành cao Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trên, thực đề tài: Nghiên cứu tách dòng biểu kháng nguyên virus PCV2 Escherichia coli” Đề