NGHIÊN cứu, PHÂN TÍCH sự BIỂU HIỆN PROTEIN được cảm ỨNG bởi KHÁNG SINH của CHỦNG MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI  PHẠM NGỌC THẠCH NGHIÊN CỨU, PHÂN TÍCH SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN ĐƢỢC CẢM ỨNG BỞI THUỐC KHÁNG SINH CỦA CHỦNG MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS TRƢƠNG QUỐC PHONG Hà Nội - 12/ 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Những số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa đƣợc tác giả khác công bố Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2013 Phạm Ngọc Thạch i LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Trƣơng Quốc Phong, Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình hƣớng dẫn dìu dắt cho suốt trình học tập nghiên cứu Tôi xin đƣợc gửi lời cám ơn chân thành tới thầy, cô công tác Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình giúp đỡ dạy bảo trình học tập nghiên cứu trƣờng Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Đỗ Thị Thu Hà – kỹ thuật viên phòng Công nghệ Proteomics – Trung tâm nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học – Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực Phẩm – Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội, NCS Nguyễn Việt Phƣơng học viện, sinh viên làm việc tai phòng Proteomics động viên, giúp đỡ bảo ân tình để hoàn thành luận văn Nhân đây, xin gửi lời biết ơn tới tất cán học viên Trung tâm nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội động viên, hƣớng dẫn tận tình tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, khích lệ tạo điều kiện tốt cho học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Hà nôi, ngày 30 tháng 12 năm 2013 Học viên Phạm Ngọc Thạch ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ NGỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I BỆNH LAO VÀ TÁC NHÂN GÂY BỆNH I.1 Bệnh lao I.1.1 Lịch sử bệnh lao I.1.2 Tình hình bệnh lao giới I.1.3 Tình hình bệnh lao Việ Nam I.1.4 Các dạng bệnh lao I Tác nhân gây bệnh lao I.2.1 Đặc điểm vi khuẩn lao Mycobacterium Tuberculosis I.2.1.1 Đặc điểm hình thái I.2.1.2 Đặc điểm hóa sinh 10 I.2.2 Cơ chế xâm nhập gây bệnh vi khuẩn lao Mycobacterium Tuberculosis 11 II VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN 12 II.1 Các dạng vi khuẩn lao kháng thuốc 12 II.2.Cơ chế kháng thuốc vi khuẩn lao 13 II.3 Các phƣơng pháp xác định vi khuẩn lao kháng thuốc 16 II.3.1 Phƣơng pháp kiểu hình 16 II.3.1.1 Các phương pháp nuôi cấy truyền thống 16 iii II.3.1.2 Các phương pháp nuôi cấy cải tiến 17 II.3.1.3 Một số phương pháp kiểu hình 17 II.3.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử phát vi khuẩn lao kháng thuốc 19 II.3.2.1 Kỹ thuật giải trình tự DNA 19 II.3.2.2 Các kỹ thuật dựa phản ứng PCR 19 II.4 Ứng dụng công cụ proteomic nghiên cứu hệ protein vi khuẩn lao 21 II.5 Ý nghĩa việc nghiên cứu hệ protein ngoại bào vi khuẩn lao 23 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 25 2.1.1 Các chủng vi khuẩn lao 25 2.1.2 Mẫu dịch nuôi 25 2.1.3 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu: 25 2.1.4 Các thiết bị chủ yếu 25 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.2.1 Tách chiết protein 26 2.2.1.1 Quy trình tách chiết protein từ sinh khối tế bào 26 2.2.1.2 Quy trình thu hồi protein ngoại bào từ dịch nuôi 28 2.2.2 Định lƣợng protein dung dịch phƣơng pháp Bradford 32 2.2.3 Phân tách protein kỹ thuật điện di 33 2.2.3.1 Phân tách protein kỹ thuật điện di biến tính gel polyacryamide(SDS-PAGE) 33 2.2.3.2 Phân tách protein kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE) 34 2.2.3.3 Điện di hai chiều (2DE – MS) kết hợp với khối phổ 36 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 TÁCH CHIẾT CÁC HỆ PROTEIN 38 3.1.1 Tách chiết hệ protein từ sinh khối vi khuẩn lao 38 3.1.1 Tách chiết hệ protein từ dịch nuôi 39 3.1.1.1 Kết tủa hệ protein dịch nuôi aceton 39 iv 3.1.1.2 Kết tủa phân đoạn protein từ dịch nuôi tế bào muối (NH4)2SO4 bão hòa kết hợp với cut-off 40 3.1.1.3 Tách chiết hệ protein dịch nuôi hỗn hợp dịch axít tricloacetic/ethanol (TCA/EtOH) 42 3.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2-DE) 44 3.2.1 Khảo sát dải pH khác strip 44 3.2.2 Khảo sát chiều dài khác strip với dải pH 46 3.3 KHẢO SÁT DẢI PI CỦA HỆ PROTEIN DỊCH NUÔI 47 3.4 PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH CÁC HỆ PROTEIN 48 3.4.1 Với hệ protein sinh khối tế bào lao nhạy lao kháng thuốc điện di hai chiều đánh dấu huỳnh quang 48 3.4.2 Với hệ protein ngoại bào vi khuẩn kháng thuốc có kháng sinh kháng sinh 52 KẾT LUẬN 54 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 v DANH MỤC CÁC TỪ NGỮ VIẾT TẮT 1-DE One-dimensional electrophoresis Điện di chiều 2-DE Two-dimensional electrophoresis Điện di hai chiều APS Ammonium persulfate Ammonium persulfate chiều Một chất tẩy rửa lƣỡng tính để hòa tan protein DTT 3-[(3Cholamidopropyl)dimethylammoni o]-1-propanesulfonate Dithiothreitol IAA Iodoacetamide Iodoacetamide IEF Isoelectric focusing Điện di đẳng điện IPG immobilized pH gradient Gradien pH cố định kDa Kilo Dalton Kilo Dalton MALDI Matrix-asststed laser deorption ionization Ion hóa tác động laze với hỗ trợ chất MS Mass spectrometry Khối phổ MS/MS Tandem mass spectrometry Khối phổ liên tục pI Isoelectric point Điểm đẳng điện SDSPAGE Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis Điện di biến tính gel polyacrylamide TEMED Tetramethylethylenediamine Tetramethylethylenediamine TCA Acid trichloacetic A xít tricloacetic w/v Weight/volumn Khối lƣợng/thể tích CHAPS vi Dithiothreitol DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tỷ lệ mắc lao khu vực năm 2007 Bảng 1.2 Ƣớc tính bệnh Lao kháng đa thuốc toàn giới Bảng 1.3 Tỷ lệ mắc lao tỷ lệ tử vong lao Việt Nam qua năm Bảng 1.4 Tỷ lệ mắc lao kháng thuốc Việt Nam năm 2006 Bảng 1.5 Bảng tóm tắt chế kháng thuốc lao mức độ phân tử 15 Bảng 2.1 Thành phần gel điện di SDS-PAGE 33 Bảng 3.1 Nồng độ protein sinh khối vi khuẩn lao xác định Bradford 39 Bảng 3.2 Nồng độ protein dịch nuôi vi khuẩn lao xác định Bradford 44 Bảng 3.3 Các protein sai khác chủng lao nhạy kháng 50 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình thái tế bào M tuberculosis dƣới kính hiển vi điện tử 10 Hình 1.2 Hình thái khuẩn lạc M tuberculosis môi trƣờng thạch 10 Hình 1.3 Sơ đồ truyền bệnh lao từ ngƣời lớn sang trẻ em đƣờng hô hấp 12 Hình 1.4 Cơ chế phát triển tính kháng thuốc vi khuẩn lao [195] 13 Hình 2.1 Quy trình điện di 2-DE đánh dấu huỳnh quang 35 Hình 2.2 Mô hình điện di hai chiều kết hợp khối phổ 36 Hình 3.1 Điện di SDS – PAGE kết tách chiết hệ protein từ sinh khối vi khuẩn lao 38 Hình 3.2 Kết điện di kết tủa hệ protein dịch nuôi ethanol 40 Hình 3.3 Kết tủa phân đoạn protein từ dịch nuôi vi khuẩn laobằng (NH4)2SO4bão hòa kết hợp màng cut-off 41 Hình 3.4 Kết loại albumin tủa các protein khác từ dịch nuôi 43 Hình 3.5 Kết loại albumin tủa protein khác dịch nuôi 15%TCA/EtOH 44 Hình 3.6 Điện di 2-DE protein tách chiết từ vi khuẩn lao với pH strip 3-10 (A) 45 Hình 3.7 Ảnh hƣởng chiều dài strip đến phân tách protein gel điện di 2-DE với chiều dài strip 11cm (A) 18cm (B) 46 Hình 3.8 Hệ protein dịch nuôi vi khuẩn lao dải pI khác 47 Hình 3.9 Kết điện di 2-DE đánh dấu huỳnh quanng với chủng lao nhạy (A), lao kháng (B), mẫu hỗn hợp(C) 49 Hình 3.10 Sự sai khác protein spots chủng vi khuẩn lao nhạy kháng 51 Hình 11 Các protein spots sai khác hai môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn lao kháng thuốc kháng sinh (A) có kháng sinh (B) Isoniazid 53 viii MỞ ĐẦU Bệnh lao bệnh truyền nhiễm, tỷ lệ tử vong cao có tính chất dễ lây lan cộng đồng Bệnh lao bệnh có lịch sử lâu đời, xuất từ thời trƣớc Công Nguyên Ấn Độ, Ai Cập, Hy Lạp nƣớc vùng Trung Á Nhƣng ngƣời ta không hiểu hết bệnh lao bệnh lao bị nhầm lẫn với số bệnh khác đặc biệt bệnh phổi, ngƣời ta quan niệm bệnh lao bệnh di truyền không chữa đƣợc Từ năm 1819 đến năm 1865 nhiều tác giả sâu vào nghiên cứu bệnh lao Nhƣng đến năm 1882 Robert Koch tìm nguyên nhân gây bệnh lao vi khuẩn lao gọi Bacillus Koch-BK Từ mở kỷ nguyên chẩn đoán, phòng điều trị bệnh lao [5] Việc áp dụng thuốc kháng sinh điều trị bệnh nhân lao cứu chữa cho hàng triệu bệnh nhân lao khỏi bệnh nguy hiểm Tuy nhiên, việc áp dụng rộng rãi chất kháng sinh chế độ hóa trị liệu cung cấp áp lực chọn lọc cho hình thành phát triển chủng vi khuẩn lao kháng thuốc Vi khuẩn lao kháng đa thuốc mối đe dọa cho chƣơng trình kiểm soát bệnh lao Sự gia tăng tính kháng thuốc vi khuẩn lao có nguyên nhân từ lạm dụng thuốc kháng sinh sƣ thiếu thuốc kháng sinh có hiệu Việt Nam đứng thứ 12 số 22 quốc gia có gánh nặng bệnh lao cao giới Theo thống kê tổ chức Y tế gới (WHO) năm 2008, tỷ lệ bệnh nhân mắc lao đa kháng thuốc (kháng với rifampicin isoniazid) nƣớc ta năm 2007 chiếm tỷ lệ 2,7% số bệnh nhân lao 19,3% số bệnh nhân lao điều trị trƣớc [28] Bệnh lao đa kháng thuốc mối đe dọa nghiêm trọng kiểm soát bệnh lao toàn cầu Sự phát kháng thuốc muộn dẫn đến làm chậm trình điều trị hiệu yếu tố góp phần vào bùng phát bệnh lao đa kháng thuốc Nghiên cứu toàn hệ protein chủng lao kháng nhạy cảm với thuốc nhƣ biểu mức độ protein chúng môi trƣờng có kháng sinh phƣơng pháp phân tích protein giúp đỡ việc hợp dải strip để phân phân tách tốt mẫu nghiên cứu, tiến hành phân tách protein sinh khối vi khuẩn lao strip với dải pH khác Trƣớc hết tiến hành với strip có dải pH rộng pH3-10, chiều dài 7cm để phân tách hệ protein Kết thu đƣợc cho thấy, hầu hết tất protein đƣợc phân bố vùng pH4-7 (Hình 3.6,A) có số đƣợc quan sát thấy vùng pH cao Để có nhìn tổng quan cho phân tách hệ protein, tiến hành điện di dải strip hẹp pH4-7, chiều dài 7cm (Hình 3.6,B) 3,0 pI 10,0 4,0 A pI B cm cm Hình 3.6 Điện di 2-DE protein tách chiết từ vi khuẩn lao với pH strip 3-10 (A) 4-7 (B) Chiều dài strip 7cm 45 7,0 Từ kết ta nhận thấy, có nhiều điểm protein xuất gel 2-D hình B Kết rằng, strip với pH 4-7 phù hợp để tách hỗn hợp protein nghiên cứu 3.2.2 Khảo sát chiều dài khác strip với dải pH Để khảo sát ảnh hƣởng chiều dài strip việc phân tách protein điện di 2-DE, hai strip với chiều dài 11cm 18cm đƣợc sử dụng để phân tách protein theo điện di chiều thứ Thanh strip sau đƣợc đặt gel polyacryamide để tách theo chiều thứ hai Kết đƣợc thể hình 3.7 dƣới : 4,0 A pI 7,0 4,0 B pI 7,0 B 11 cm 18 cm Hình 3.7 Ảnh hƣởng chiều dài strip đến phân tách protein gel điện di 2-DE với chiều dài strip 11cm (A) 18cm (B) Từ kết ta thấy, phân tách hệ protein strip với chiều dài 11cm 18 cm tốt so với strip có chiều dài 7cm ( Hình 3.6B 3.7A, 3.7B) Khi so sánh phân tách hệ protein chiều dài 11cm 18cm , ta nhận thấy strip với chiều dài 18cm phân tách hệ protein tốt Từ kết phân tích trên, định lựa chọn strip pH 4-7 với chiều dài 18 cm để phân tách hệ protein thí nghiêm 46 3.3 KHẢO SÁT DẢI PI CỦA HỆ PROTEIN DỊCH NUÔI Mỗi hệ protein có khoảng pI mà đó, số lƣợng protein tập trung lớn Hệ protein khoảng pI đại diện cho hệ protein cần nghiên cứu Vì vậy, phƣơng pháp điện di 2-DE, việc xác định khoảng pI hệ protein bƣớc quan trọng nhằm phục vụ cho việc nghiên cứu Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát hệ proten dịch nuôi vi khuẩn lao hai dải pI khác pI4 – pI 7-10 Kết sau tiến hành điện di 2-DE đƣợc thể hình 3.8 sau 4,0 pI 7,0 7,0 pI 10,0 cm cm Hình 3.8 Hệ protein dịch nuôi vi khuẩn lao dải pI khác Từ kết điện di hình 3.7 ta thấy, hệ protein dịch nuôi vi khuẩn lao chủ yếu phân bố vùng có pI 4,5 – 6,5, vùng pI 7,0 – 10,0 hầu nhƣ ta không thấy xuất Vì vậy, lựa chọn strip có pH4 – phù hợp cho việc nghiên cứu hệ protein dịch nuôi vi khuẩn lao 47 3.4 PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH CÁC HỆ PROTEIN 3.4.1 Với hệ protein sinh khối tế bào lao nhạy lao kháng thuốc điện di hai chiều đánh dấu huỳnh quang Thông thƣờng, phƣơng pháp điện di hai chiều phân thích so sánh hệ protein vi khuẩn lao thƣờng đƣợc tiến hành nhuộm hai phƣơng pháp nhuộm bạc nhuộm coomassie để hiển thị kết Hạn chế phƣơng pháp mẫu phải đƣợc phân tách gel nhất, phân tích so sánh phải đƣợc thực nhiều gel Để khắc phục hạn chế này, phƣơng pháp điện di hai chiều kết hợp đánh dấu huỳnh quang đƣợc áp dụng thành công để so sánh hệ proteein điều kiện khác Trong nghiên cứu này, hỗn hợp protein từ chủng vi khuẩn lao nhạy đa kháng thuốc đƣợc đánh dấu thuốc nhuộm Cy khác (mẫu protein chủng nhạy A đƣợc đánh dấu chất màu Cy3, mẫu protein chủng đa kháng thuốc B đƣợc đánh dấu chất màu Cy5, cồn hỗn hợp protein hai chủng C đƣợc đánh dấu chất màu Cy2) chúng đƣợc thấm vào strip 18cm, pH4-7 đƣợc phân tách gel phân tách gel Sau tiến hành điện di hai chiều, gel đƣợc quét huỳnh quang với bƣớc sóng tƣơng ứng với chất màu máy quét huỳnh quang Do đƣợc phân tách gel nên thay đổi kỹ thuật đƣợc giảm thiểu để có đƣợc kết xác Kết phân tách protein chủng vi khuẩn lao nhạy kháng thuốc gel điện di hai chiều đƣợc đánh dấu thuốc nhuộm huỳnh quang đƣợc thể hình 3.9 48 4,0 pI 7,0 A B C Hình 3.9 Kết điện di 2-DE đánh dấu huỳnh quanng với chủng lao nhạy (A), lao kháng (B), mẫu hỗn hợp(C) 49 Hình ảnh gel nhuộm huỳnh quang đƣợc nhập vào phần mềm PDQuest phiên 8.0.1 (Bio-rad, CA, USA) để phân tích Có tổng cộng 458 protein spots khác đƣợc xác định phần mềm So sánh thấy có 41 protein spots thay đổi chủng nhạy chủng kháng, 18 protein spots giảm đi, 23 protein spots tăng lên Những protein spots đƣợc cắt khỏi gel, sau đƣợc mang phân tích khối phổ xác định đƣợc 10 protein điển hình đƣợc thể bảng 3.3 hình 3.10 dƣới Bảng 3.3 Các protein sai khác chủng lao nhạy kháng Sự thay đổi Mã số Khối lƣợng( Da) pI Score Ion Trình tự Số peptid score đƣợc xác đƣợc xác định (%) định  L7N4G3_MYCTU Acetyl/propionylCoA carboxylase, alpha subunit 63783 5.51 590 375.5 58.83 26  L7N4G3_MYCTU Acetyl/propionylCoA carboxylase, alpha subunit 63783 5.51 504 327.5 49.83 23  Y2557_MYCTU Uncharacterized protein Rv2557/MT2634 24295 4.54 296 175 72.32 14  INHA_MYCTU Enoyl-[acyl-carrierprotein] reductase [NADH] 28528 6.02 157 123 33.09  L0T720_MYCTU Uncharacterized protein 24056 5.97 151 95.7 42.53  Y1636_MYCTU Universal stress protein Rv1636/MT1672 15312 5.62 225 152.2 80.14  L7N5J4_MYCTU Probable acetyl-CoA acyltransferase FadA2 (3-ketoacylCoA thiolase) (Betaketothiolase) 46107 6.64 659 576.9 43.18 11  O53665_MYCTU 3-oxoacyl-(Acylcarrier-protein) reductase 46830 6.38 656 441.6 63.00 23  DNAK_MYCTU Chaperone protein DnaK 66831 4.59 478 377.9 36.32 15 10  CH602_MYCTU 60 kDa chaperonin 56727 4.56 359 225.3 48.89 17 STT spot Các protein nhận diện 50 2 3 4 5 6 7 8 9 Hình 3.10 Sự sai khác protein spots chủng vi khuẩn lao nhạy kháng 51 3.4.2 Với hệ protein ngoại bào vi khuẩn kháng thuốc có kháng sinh kháng sinh Để đánh giá sai khác hệ protein hai môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn lao kháng có kháng sinh Isoniazid kháng sinh Isoniazid, tiến hành phân tích hệ hai protein gel điện di hai chiều 12,5% với strip sử dụng chạy chiều pH – có chiều dài 18cm Bản gel sau chạy chiều hai đƣợc nhuộm bạc có kết đƣợc nhập vào phần mềm PDQuest phiên 8.1.0 (Bio-Rad, CA, USA) để phân tích Có tổng cộng 90 protein spots đƣợc xác định tên hai gel Với so sánh đƣa sai khác dựa vào dƣới 0.66 lần 1,5 lần Theo kết phân tích phần mềm, có spot protein sai khác vị trí sau đây: 21, 23, 33, 47, 60, 88 Các điểm gel đƣợc thể hình 3.11 dƣới 52 Hình 11 Các protein spots sai khác hai môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn lao kháng thuốc kháng sinh (A) có kháng sinh (B) Isoniazid 53 KẾT LUẬN - Đã xây dựng đƣợc quy trình tách chiết đƣợc protein nội bào ngoại bào vi khuẩn lao Dịch protein thu đƣợc đủ hàm lƣợng chất lƣợng cho phân tách điện di hai chiều - Đã xây dựng đƣợc quy trình phân tách hệ protein nội bào ngoại bào phƣơng pháp điện di hai chiều - Đã phân tích so sánh đƣợc hệ protein chủng vi khuẩn lao nhạy đa kháng thuốc (Isoniazid Rifampicin) Nhận diện đƣợc 10 protein sai khác phƣơng pháp phân tích khối phổ - Phân tích so sánh đƣợc thay đổi hệ protein ngoại bào sau cảm ứng kháng sinh Isoniazid 54 KIẾN NGHỊ - Nhận diện protein chấm điểm protein sai khác hệ protein có không cảm ứng thuốc Isoniazid Phân tích vai trò protein nhận diện đƣợc 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Bộ Y tế, Trung tâm phòng chống lao quốc gia (2006), Báo cáo tổng kết Chương trình chống lao quốc gia 2005 Phan Thƣợng Đạt (2013), Lao kháng thuốc, NXB y học, chi nhánh Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thu Hà (2012), Nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng, đột biến gen rpoB, katG inh A vi khuẩn lao phổi tái phát, Luận án Tiến sỹ chuyên ngành lao Hà nội 2012, tr,17-19 Vũ Thị Kim Liên, Trần Thị Hải Âu, Nguyễn Thị Thu Thái, Nguyễn Thái Sơn (2010), Đặc điểm phân tử chủng vi khuẩn lao kháng rifampicin phân lập Việt Nam năm 2008 – 2009, Tạp trí Y học dự phòng, tập XX, số 6(114), tr 16-22 Trần Văn Sáng (2006), Bệnh học lao, NXB y học, tr45-58 Tiếng anh Angeby K A., Klintz L And Hoffner S E (2002) , “Rapid and inexpensive drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis with a nitrate reductase assay”, J Clin Microbiol.40(2), pp 553-555 Banaiee N., Bobadilla-del-Valle M., Riska P.F., Bardarov S., Small P M., Ponce-de-Leon A., Jacobs W.R., Hatfull G.F and Sifuentes-Osornio J (2003) “Rapid identification and susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis from MGIT cultures with luciferase reporter mycobacteriophages” J Med Microbiol.52 (7), pp.557-561 Betts J.C., Dodson P., Quan S., Lewis A.P., Thomas P.J., Duncan K and Ruth A McAdam (2000) “Comparison of the proteome of Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv with clinical isolate CDC 1551”, Microbiology, 146, pp 3205–3216 56 De Souza, G A., Fortuin, S., Aguilar, D., Pando, R H et al (2010), “Using a label-free proteomic method to identifydifferentially abundant proteins in closely related hypo-and hyper-virulent clinical Mycobacterium tuberculosis” Beijing isolates Mol Cell Proteomics 2010, 9,2414–2423 10 De Viedma D G (2003) “Rapid detection of resistance in Mycobacterium tuberculosis: a review discussing molecular approaches” Clin Microbiol Infect, 9(5), pp.349-359 11 Dye C (2006) “Global epidemio;ogy of tuberculosis” Lancet 367(9514), pp.938-940 12 Dye C, et al., 1999, “Global burden of tuberculosis: estimated incidence, prevalence, and mortality by country”, JAMA;282:677-86 13 Grange J M and Zumla A (2002), “The global emergency of tuberculosis: what is the cause?” JR Soc Health.122 (2), pp.78-81 14 Hazbón M.H (2004) “Recent advances in molecular methods for early diagnosis of tuberculosis and drug-resistant tuberculosis” Biomedica 24(1), pp 149-162 15 Heifets L (2000) “Conventional methods for antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis In: Multidrug-resistant Tuberculosis, Ed.” Bastian I, Portaels F Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands 2000 16 Jiang X., Zhang W., Gao F., Huang Y., Lv C., Wang H (2006), “Comparison of the proteome of isoniazid-resistant and -susceptible strains of Mycobacterium tuberculosis” Microb Drug Resist., 12(4), pp 231-238 17 Johnson R., Streicher E M., Louw E G., Warren R.M., van Helden P D and Victor T C (2006) “Drug resistance in Mycobacterium tuberculosis”, Curr Issues Mol Biol 8, pp 97-111 57 18 Mokrousov I., Otten T., Vyshnevskiy B.and Narvskaya O (2003) “Allelespecific rpoB PCR assays for detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis in sputum smears”, J Antimicrob Chemother 47(7), pp.2231-2235 19 Pai M., Kalantri S., Pascopella L., Riley L.W and Reingold A.L (2005) “Bacteriophage-based assays for the rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a metaanalysis” J Infect.51 (3), pp 175-187 20 Palomino J.C., Leão S.C., Ritacco V.etal (2007) “Tuberculosis 2007: From basis sience to patient care” 1st edition WWW.tuberculosisTextbook.com 21 Raman K and Chandra N., (2008), “Mycobacterium tuberculosis interactome analysis unravels potential pathways to drug resistance”, BMC Microbiology 2008, 8:234 22 Sambrook J, Maniatis T and Fritsch EF (2001), Molecular cloning-a Laboratory Manual, Third edition, Cold Spring Harbour Laboratary, Cold Spring Harbour, New York 23 Smith I (2004), “What is the health, social, and economic burden of tuberculosis p 233-7, In:Frieden T (ed) Toman’s tuberculosis case detection, treatment, and monitoring: questionsand answers 2nd ed Geneva”, WHO/HTM/TB/2004.334 24 Tat’kov S.I, Sivkov A., Boldyrev A N., Smirnova O., Tumanov I M., Medvedeva E V., Ivlev-Duntau A P., Strelis A K, Novitskii V.V., Urazova O.I and Voronkova O.V (2007) “Evaluation of biochips for the rifampin resistance detection of M.tuberculosis in strains isolated at the Novosibirsk and Tomsk regions” Mol Gen Mikrobiol Virusol.3,pp 9-15 25 World Health Organization (1997) “Anti-tuberculosis drug resistance in the world”, Report No.1 WHO/TB/97.229 26 World Health Organization (2004) “Anti-tuberculosis drug resistance in the world, Prevalence and trends”, Report No WHO/HTM/TB/2004.343 58 27 World Health Organization (2006) “Global tuberculosis control: surveillance, planning and finacing”, WHO report 2006 WHO/HTM/TB/2004.343 28 World Health Organization (2008) “Anti-tuberculosis drug resistance in the world”, Report No.4 WHO/HTML/TB/2008.394 29 World Health Organization (2009) “Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing”, WHO report 2009 WHO/HTM/TB/2009.41 30 World Health Organization (2007) “Global tuberculosis control: surveillance, planning, financing”, WHO report 2007 WHO/HTM/TB/2007.376 31 World Health Organization (2008) “Global tuberculosis control: surveillance, planning, financing”, WHO report 2008 WHO/HTM/TB/2008.393 32 Xiong Y., Chalmers M.J., Gao F.P., Cross T.A., Marshall A.G (2005), “Identification of Mycobacterium tuberculosis H37Rv integral membrane proteins by one-dimensional gel electrophoresis and liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry” J Proteome Res.4(3), pp.855-861 33 Yajko D.M., Madej J.J., Lancaster M.V., Sander C.A., Cawthon V.L., Gee B., Babst A and Hadley W.K (1995) “Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis” J Clin Microbiol.33 (9): 2324-2327 Trang wed 34 http://www.bvlaobp.org/default.asp?tabid=53&M_ID=45&N_ID=78 35 http://luanvan.net.vn/luan-van/luan-van-ap-dung-phuong-phap-vntr-miru-dinhkieu-gene-cac-chung-mycobacterium-tuberculosis-phan-lap-tai-viet-nam-19889/ 59 ... phân tích biểu protein cảm ứng kháng sinh chủng Mycobacterium tuberculosis Mục tiêu của đề tài: - Thiết lập quy trình điện di hai chiều ứng dụng cho phân tách protein vi khuẩn lao - Nghiên cứu... hệ protein chủng lao kháng nhạy cảm với thuốc nhƣ biểu mức độ protein chúng môi trƣờng có kháng sinh phƣơng pháp phân tích protein giúp đỡ việc làm sáng tỏ chế kháng thuốc xác định đƣợc dấu sinh. .. qua phân tích hệ protein mạng lƣới tƣơng tác chúng [21] Ngoài việc phân tích nhận diện hệ protein chủng vi khuẩn lao, nghiên cứu so sánh hệ protein chủng vi khuẩn lao điều kiện khác đƣợc nghiên