BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN LAI GNRH-TBK Ở E. COLI" doc

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN LAI GNRH-TBK Ở E COLI Đặng Thành Nam & Phan Văn Chi* Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN & CNQG *Tác giả để liên hệ: Tel 7561903; Fax 8363144; E-mail: pvchi@ibt.ac.vn MỞ ĐẦU Trichobakin (TBK) protein bất hoạt ribosom lớp 1, tách chiết từ Trichosanthes sp Bac Kan 8-98 thuộc họ Cucurbitaceae [1,2] Trichobakin tái tổ hợp sau biểu E.coli, tinh chứng minh có hoạt tính N- glycosidase cao ARN ribosom có khả ức chế trình sinh tổng hợp lucierase mơ hình RRL (Rabbit Reticulocyte Lysate) Ngồi khả kháng vi khuẩn, virut, chúng cịn có khả gây ức chế dịng tế bào ung thư ni cấy in vitro [3] Để có ứng dụng hiệu hơn, Trichobakin gắn thêm thành phần hướng đích để tạo protein lai theo dạng “độc tố miễn dịch” (ITs) nhằm tiêu diệt cách chọn lọc quần thể tế bào mà có biểu thụ thể đặc hiệu thành phần hướng đích cơng nghệ ADN tái tổ hợp [ 4, 5] Hormon giải phóng kích dục tố (GnRH) hay hormon giải phóng thể vàng (luteinizing hormone-releasing hormone: LH-RH) neuro-decapeptide, không gây đáp ứng miễn dịch có lực cao (Kd khoảng 10-9 M) với thụ thể GnRH(GnRHR) [6, 11] GnRHR biểu nhiều bề mặt tế bào ung thư vú, tử cung, tuyến tiền liệt, tuyến tuỵ[7-10] Mặt khác tế bào ung thư mang GnRH receptor thường có biểu loại “death receptor” Fas[12] Sự liên kết GnRH (hoặc dẫn xuất ) với GnRH receptor kích hoạt biểu Fas ligand, gây trình appotosis cho tế bào[13] Do GnRH xem tác nhân hướng đích lý tưởng, GnRH sử dụng số độc tố miễn dịch tái tổ hợp khác recombinant GnRH-PAP fusion toxin Trong PAP protein bất hoạt ribosome tách chiết từ Phytolacca americana GnRH-PAP có khả ức chế đặc hiệu tế bào ung thư có biểu GnRH receptor bề mặt[6] Trong báo cáo này, chúng tơi trình bày kết nghiên cứu tạo protein lai GnRH-TBK thiết kế dựa liên kết đoạn gen mã hoá cho GnRH người trình tự gen mã hố cho TBK công nghệ ADN tái tổ hợp VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu hố chất Các hóa chất thông dụng dùng sinh học phân tử mua từ hãng Sigma, Bio-Rad, Pharmacia-Biotech Các enzym giới hạn BamHI, NcoI, enzym ghép nối T4 ADN ligase, Taq ADN polymerase mua từ hãng New England Biolabs (Anh) Vector biểu pET 21d(+), chủng vi khuẩn E.coli BL 21 (DE3) mua hãng Novagen (Mỹ) 2.2 Phương pháp 2.2.1 Nhân gen gnrh- tbk kỹ thuật PCR Việc thiết kế gen lai gnrh- tbk tiến hành sở gen tbk tách dòng pQV 20 [1] Gen mã hoá cho GnRH người nối với gen mã hố cho Trichobakin thơng qua polynucleotid trung gian mã hoá cho 13 axit amin (linker), có vai trị tạo nên mềm dẻo cấu trúc tính tan protein lai HSP1 Tổ hợp gen có kích thước 813 bp mã hố cho protein có kích thước khoảng 30 kDa Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu để tạo nhân lên tổ hợp gen mã hóa cho protein lai GnRH-TBK Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 94oC, 48 giây; 56oC, 48 giây; 72oC, 84 giây; lặp lại 32 chu kỳ; 72oC, phút 2.2.2 Thiết kế vector biểu protein tái tổ hợp Vector pET-21d(+) (Novagen) sản phẩm PCR xử lý hai enzym giới hạn NcoI, BamHI nối với nhờ T4 ADN ligase tạo thành plasmid tái tổ hợp pGnRH-TBK Việc xác định trình tự ADN tiến hành máy ALF express DNA Sequencer Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech) 2.2.3 Biểu protein tái tổ hợp tế bào vi khuẩn E.coli Plasmid tái tổ hợp mang gen gnrh-tbk biến nạp vào chủng tế bào khả biến E.coli BL21(DE3) nuôi môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin ( nồng độ cuối 100g/ml), lắc 200 vòng/ phút 37C, Khi giá trị OD600nm dịch nuôi cấy đạt tới 0.5-0.7, tiến hành cảm ứng IPTG (isopropyl - D- thiogalactoside) với nồng độ cuối 0.4 mM Các mẫu tế bào thu vào thời điểm h, 1h, 2h, 3h sau cảm ứng 3h không cảm ứng Sự biểu protein lai tái tổ hợp phân tích SDS-PAGE theo Laemmli [14] Western blot theo Towbin [15] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thiết kế vector biểu protein lai GnRH-TBK 3.1.1 Nhân gen mã hoá cho GnRH- TBK Dựa trình tự gen mã hố cho protein GnRH TBK cặp mồi phục vụ cho việc tạo nhân gen tái tổ hợp gnrh-tbk kỹ thuật PCR tổng hợp Mồi xi mang vị trí nhận biết enzym giới hạn NcoI, tồn trình tự gen gnrh, trình tự đoạn linker trình tự nucleotid mã hóa cho acid amin TBK Mồi ngược mang vị trí nhận biết enzym giới hạn BamHI trình tự nucleotidd mã hố cho acid amin cuối gen tbk Sản phẩm PCR phân tích điện di gel agarose 0.8 %(hình 1) cho thấy băng có kích thước khoảng 813 bp Kích thước phù hợp với tính tốn lý thuyết kích thước sản phẩm nối tạo thành gen gnrh, linker gen tbk 3.1.2 Vector biểu protein lai GnRH-TBK Sản phẩm PCR gnrh-tbk vector biểu pET 21d(+) xử lý hai enzym giới hạn NcoI BamHI, sau nối lại với enzym T4 ADN ligase nhằm tạo plasmid mang tổ hợp gen gnrh-tbk hệ biểu phù hợp, phục vụ cho việc biểu protein tái tổ hợp nghiên cứu Kết phân tích điện di gel agarose 0.8% (hình 1) Kết điện di hình cho thấy, plasmid tái tổ hợp pGnRH-TBK sau xử lý hai enzym giới hạn NcoI BamHI (đường chạy 3) tạo thành hai băng sản phẩm có kích thước 5400 bp 813 bp Trong đó, sản phẩm 5400 bp tương ứng với kích thước vector pET 21d(+) sau xử lý hai enzym giới hạn NcoI BamHI sản phẩm 813 bp tương ứng với tổ hợp gen gnrh-tbk (đường chạy 4) Các kết cho thấy tổ hợp gen gnrh-tbk gắn vào vector biểu pET 21d(+) Kết xác định trình tự pGnRH-TBK khẳng định có mặt tổ hợp gen gnrh-tbk vector biểu pET 21d(+) vị trí mong muốn khơng thấy có thay đổi, đột biến trình tự tổ hợp gen trình tự chức vector biểu Plasmid tái tổ hợp pGnRH-TBK tiếp tục biến nạp vào E.coli chủng Bl21(DE3) để biểu protein 3.2 Biểu GnRH-TBK vi khuẩn E.coli Chủng vi khuẩn E.coli BL21(DE3) mang plasmid pGnRHTBK nuôi cấy gây cảm ứng IPTG Các mẫu tế bào thu thời điểm 0, 1, 2, sau cảm ứng Dịch chiết protein tổng số mẫu tế bào phân tích SDS-PAGE (hình 2) Kết điện di SDS-PAGE cho thấy, dịch chiết protein tổng số mẫu tế bào thu thời điểm khác sau cảm ứng IPTG (các đường chạy từ 1-4), có xuất băng protein có trọng lượng phân tử khoảng 30 kDa so với mẫu tế bào không cảm ứng IPTG (đường chạy 5) Như vậy, hệ biểu vector pET 21d(+) mang tổ hợp gen gnrh-tbk hoạt động ổn định, dẫn đến biểu loại protein Protein có trọng lượng phân tử phù hợp với tính tốn lý thuyết trọng lượng phân tử protein tái tổ hợp GnRH-TBK Để khẳng định cách chắn tiến hành phản ứng Western blot với kháng thể huyết kháng TBK kết thu thể hình Hình Điện di SDS-PAGE sản phẩm protein tái tổ hợp GnRH-TBK biểu E.coli M: thang protein chuẩn; 1-4: protein tổng số vi khuẩn sau 0, 1, 2, 3h sau cảm ứng IPTG; 5: protein tổng số vi khuẩn sau h khơng cảm ứng IPTG Hình Phân tích GnRH-TBK Western blotting M: Thang protein chuẩn; 1-3: Biểu protein lai tái tổ hợp GnRH- TBK (mũi tên)ở thời điểm , 2, sau cảm ứng IPTG KẾT LUẬN Đã tạo được tổ hợp gen gnrh-tbk có kích thước 813 bp dựa sở gen mã hoá cho GnRH có nguồn gốc từ người gen mã hố cho Trichobakin kỹ thuật PCR Tổ hợp gen đưa vào vector biểu pET 21d(+) biểu chủng E.coli BL21(DE3) Kết điện di SDS-PAGE Western blot cho thấy, protein tái tổ hợp biểu ổn định có trọng lượng phân tử 30 kDa phù hợp với tính tốn lý thuyết protein lai GnRH-TBK Các nghiên cứu tính chất GnRH-TBK tiếp tục nghiên cứu làm rõ trình bày cơng bố TÀI LIỆU THAM KHẢO Phan Van Chi, Hoang Quoc Truong, Nguyen Thuy Ha, Won-II Chung and Le Tran Binh (2001) //Biotechnol Appl Biochem 34, 85-92 Phan Văn Chi, Hồng Quốc Trường, Ngyễn Th Hà, Phạm Cơng Hoạt, Lê Trần Bình, (2000)// Những vấn đề nghiên cứu sinh học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 23-28 Nguyễn Thuý Hà, Nguyễn Bích Nhi, Đỗ Khắc Hiếu & Phan Văn Chi (2002)// Tap chí Y học (đang in) Phan Văn Chi (2001) // Hội thảo Sinh học Quốc tế 2001, Hà nội, tr 66-68 Lê Thị Bích Thảo, Hà Văn Huân & Phan Văn Chi (2003)// Tap chí Y học (đang in) Schlick J.L., Dulieu P., Desvoyes B., Adami P., Radom J, Jouvenot M (2000) // FEBS Letters 472, 241246 Emos, G., Schroder, B., Ortmann, O., Westphalen, S., Schultz, K.D and Schally, A.V (1993) // J Clin Endocrinol Metab 77, 1458-1464 Eidne, K.A., Flanagan, C.A., Harris, N.S and Millar, R.P (1987)// J Clin Endocrinol Metab 64, 425-432 Quayum, A., Gullick, W., Clayton, R.C., Sikora, K and Waxman, J (1990)// Br J Cancer 62, 96-99 10 Imai, A., Ohono, T., Lida, K., Furui, T and Tamaya, T (1994) // Cancer 74, 2555-2561 11 Srkalovic, G., Bokser, L., Radulovic, S., Korkut, E and Chally, A.V (1990)// Endocrinology 127, 3052-3060 12 Imai, A., Horibe, S., Takagi, A., Tadaki, H., Ohno, T., and Tamaya, T., (1997) // Eur J Obstet, Gynecol Report Biol.74, 73-78 13 Imai, A., Takagi, A., Horibe, S., Tagaki, H., and Tamaya, T (1997) // Int J Oncol 13, 97-100 14 Laemmli, U.K (1970)// Nature (London) 227, 680- 685 15 Towbin, H., Staehelin, T and Gordon, J (1979) // Proc Natl Acad Sci USA 76, 4350-4354 SUMMARY Construction and expression of the fusion protein GnRH-TBK in E coli Đang Thanh Nam & Phan Van Chi Institute of Biotechnology (IBT), National Center for Natural Science & Technology (NCST) Immunotoxins and recombinant toxins are cytotoxic agents and designed to selectively kill populations of cells that display specific cell surface antigens These toxins usually composed of a targeting moiety linked to a protein toxin by chemical coupling or recombinant DNA technology The targeting domain controls the specificity and is usually derived from Fv fragment of an antibody, a growth factor, or a soluble receptor The protein toxins are obtained from bacteria (e.g., Pseudomonas endotoxin [PE] or diptheria toxin [DT]) or from plants (e.g., Ribosome-Inactivating Proteins [RIPs]) Trichobakin (TBK), a type I ribosomeinactivating protein isolated from the plant Trichosanthes sp Bac Kan 8-98 (family Cucurbitaceae) with specific rRNA N-glycosidase activity, was proved to have potent antiviral and anticancer activity once inside the cytoplasm Therefore, TBK is a good candidate to be used the construction of different fusion proteins as recombinant “immunotoxins” In this paper, the result of the construction of a bacterial expression plasmid encoding TBK as a fusion protein with gonadotropin-releasing hormone (GnRH), a neuro-decapeptide with receptor sites on several gynaecologic tumors is presented The fusion cDNA were amplified by PCR using specific primers designed from the DNA sequences of gnrh, linker and tbk genes As a result, the DNA sequence with the size of 813 bp encoding the fusion protein with 271 amino acids was obtained The target gene was cloned in pET-21d(+) plasmid where the cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase The resulting recombinant plasmid, designated as pGnRH-TBK was used for the expression of the protein in E.coli strain BL 21 (DE3) The extression was induced by the addition of IPTG The identity of recombinant protein has been confirmed on SDS-PAGE by its size with the molecular mass of about 30 kDa and Western blot using rabbit antiserum against Trichobakin The purification and biochemical characterization of the recombinant protein is now under study and will be reported in the next papers Người thẩm định nội dung khoa học: TS Đinh Duy Kháng  ... gen trình tự chức vector biểu Plasmid tái tổ hợp pGnRH-TBK tiếp tục biến nạp vào E.coli chủng Bl21(DE3) để biểu protein 3.2 Biểu GnRH-TBK vi khuẩn E.coli Chủng vi khuẩn E.coli BL21(DE3) mang plasmid... tổ hợp gen gnrh-tbk (đường chạy 4) Các kết cho thấy tổ hợp gen gnrh-tbk gắn vào vector biểu pET 21d(+) Kết xác định trình tự pGnRH-TBK khẳng định có mặt tổ hợp gen gnrh-tbk vector biểu pET 21d(+)... thu vào thời điểm h, 1h, 2h, 3h sau cảm ứng 3h không cảm ứng Sự biểu protein lai tái tổ hợp phân tích SDS-PAGE theo Laemmli [14] Western blot theo Towbin [15] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thiết kế