Nuôi cấy và phân tích một số chất dinh dưỡng trong nấm ganoderma sessile murrill trên môi trường lỏng

664 TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC ===  === ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: NUÔI CẤY VÀ PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT DINH DƢỠNG TRONG NẤM LINH CHI (Ganoderma sessile Murrill) TRÊN MÔI TRƢỜNG LỎNG GVHD : PGS-TS Trần Đình Thắng SV thực : Trƣơng Thị Thanh Huyền Lớp : 50K - Công nghệ thực phẩm MSSV : 0952040388 VINH - 12/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự -Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Trương Thị Thanh Huyền Khóa : 50 MSSV : 0952040388 Ngành : Công nghệ thực phẩm 1.Tên đề tài: Ni cấy phân tích số chất dinh dƣỡng nấm Ganoderma sessile Murrill môi trƣờng lỏng Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cán hướng dẫn : PGS- TS Trần Đình Thắng Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày tháng năm 2013 Ngày hoàn thành đồ án Ngày tháng năm 2013 : Ngày tháng năm 2013 Chủ nhiệm môn Cán hƣớng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) (Ký, ghi rõ họ tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án vào ngày tháng năm 2013 Ngƣời duyệt (Ký ghi rõ họ tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Trƣơng Thị Thanh Huyền Msv:0952040388 Khóa Ngành: Cơng nghệ thực phẩm : 50 Cán hướng dẫn: PGS- TS Trần Đình Thắng Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Nhận xét cán hƣớng dẫn: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Ngày tháng năm 2013 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Trƣơng Thị Thanh Huyền Msv: Khóa: Ngành: Cơng nghệ thực phẩm 50 0952040388 Cán hướng dẫn: PGS- TS Trần Đình Thắng Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Nhận xét cán duyệt: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Ngày tháng năm 2013 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) LỜI CẢM ƠN Khóa luận thực phịng thí nghiệm Vi sinh, phịng Hóa thực phẩm, Trung tâm phân tích – Chuyển giao Cơng nghệ thực phẩm Môi trường, Trường Đại học Vinh Em xin chân thành cảm ơn PGS- TS Trần Đình Thắng, giảng viên khoa Hóa học, trường Đại học Vinh tận tình hướng dẫn em suốt trình nghiên cứu hoàn thành đồ án tốt nghiệp Đề tài hoàn thành nhờ hỗ trợ kinh phí từ đề tài Nghị định thư hợp tác Việt Nam - Đài Loan PGS.TS Trần Đình Thắng - khoa Hóa học, Trường Đại học Vinh làm chủ nhiệm Em xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới thầy khoa Hóa, cán hướng dẫn thí nghiệm Phịng hóa thực phẩm, Trung tâm phân tích – Chuyển giao Cơng nghệ thực phẩm Môi trường, Trường Đại học Vinh.đã tạo điều kiện tận tình giúp đỡ em suốt q trình nghiên cứu hồn thành đồ án tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới bạn phịng thí nghiệm thực phẩm tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành đồ án Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn vơ hạn tới gia đình, người thân bạn bè động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập làm đồ án tốt nghiệp Vinh, tháng năm SVTH: Trƣơng Thị Thanh Huyền DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT Asp : Aspptic Glu : Glutamin Ser : Serin His : Histidin Gly : Glysin Thr : Threonin Ala : Alanin Arg : Arginin Try : Trytophan Cys-ss-Cys : Val : Valin Met : Methionin Phe : Phenilalanin Ile : Isoleucin Leu : Leucin Lys : Lysin Pro : Prolin HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao(High Performance Liquid Chromatography) MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Đối tượng nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Nấm 1.1.1 Khái quát chung nấm 1.1.2 Hình thái học nấm 1.1.3 Các giai đoạn phát triển sợi nấm 1.1.4 Đặc điểm biến dưỡng sinh lý nấm 1.1.5 Giá trị nấm 1.2 Nấm linh chi 10 1.2.1 Phân loại nấm linh chi 10 1.2.2 Khái quát nấm linh chi 10 1.2.3 Đặc điểm sinh học 11 1.2.4 Thành phần hóa học hoạt chất có nấm linh chi 13 1.2.5 Giá trị dược liệu nấm linh chi .17 1.2.6 Thành phần dinh dưỡng 19 1.2.7 Phân tích axít amin vitamin C phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 22 Chƣơng 2: PHƢƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất .24 2.2.1 Thiết bị 24 2.2.2 Dụng cụ 25 2.2.3 Hóa chất .25 2.3 Kỹ thuật nuôi cấy 25 2.3.1 Môi trường sử dụng 25 2.3.2 Cách tiến hành .26 2.4 Kỹ thuật phân tích 32 2.4.1 Tìm hiểu hệ thống HPLC 32 2.4.1.2 Phân loại 35 2.4.2 Kỹ thuật phân tích 35 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Kết nuôi cấy .42 3.2 Kết phân tích 44 3.2.1 Phân tích axít amin 44 3.2.2 Kết phân tích vitamin C 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Điều kiện môi trường cần thiết cho phát triển nấm Linh chi [1] .13 Bảng 12: Các hoạt chất triterpenoit có tác dụng chữa bệnh nấm linh chi 14 (Ganoderma lucidum) 14 Bảng 1.3: So sánh thành phần hoá học nấm linh chi Trung Quốc Việt Nam 15 Bảng 1.4: Các hoạt chất sinh học dẫn xuất nấm Linh chi 15 (Ganoderma lucidum) 16 Bảng 3.1: Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ axits Aspitic 45 Bảng 3.2: Diện tích peak vitamin C tương ứng với nồng độ chuẩn .52 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 : Vịng đời nấm Hình 1.2 : Chu trình phát triển nấm linh chi 12 Hình Nấm Ganoderma sessile từ tự nhiên 24 Hình 2.2: Cắt khoai tây .26 Hình 2.3: Cho vào tủ hấp 28 Hình 2.4: Làm thạch nghiêng 28 Hình 2.5 Đổ đĩa .29 Hình 2.6: Cắt lấy giống từ đĩa petri 31 Hình 2.7: Cấy giống vào bình tam giác 31 Hình 2.8: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC .32 Hình 3.1 Hình ảnh sợi nấm Ganoderma sessile sau cấy ngày 42 Hình 3.2 Hình ảnh sợi nấm Ganoderma sessile sau cấy ngày 42 Hình 3.3 Hình ảnh sợi nấm Ganoderma sessile sau cấy 10 ngày 42 Hình 3.4 Hình ảnh sợi nấm Ganoderma sessile sau cấy 15 ngày 43 Hình 3.5.Hình ảnh nấm Ganoderma sessile sau 10 ngày ni mơi trường lỏng 43 Hình 3.6 Hình ảnh nấm Ganoderma sessile sau 25 ngày nuôi môi trường lỏng 43 Hình 3.7: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 10 pmol 44 Hình 3.8 Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 25 pmol 44 Hình 3.10: Sắc đồ hỗn hợp axít amin nấm Ganoderma sessile 45 Hình 3.11: Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 5ppm 51 Hình 3.12 : Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 10ppm 51 Hình 3.13 : Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 20ppm 52 Hình 3.14 : Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 50ppm 52 Hình 3.15: Phương trình đường chuẩn vitamin C 53 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết ni cấy Hình 3.1 Hình ảnh sợi nấm Ganoderma sessile sau cấy ngày Hình 3.2 Hình ảnh sợi nấm Ganoderma sessile sau cấy ngày Hình 3.3 Hình ảnh sợi nấm Ganoderma sessile sau cấy 10 ngày 42 Hình 3.4 Hình ảnh sợi nấm Ganoderma sessile sau cấy 15 ngày Hình 3.5.Hình ảnh nấm Ganoderma sessile sau 10 ngày nuôi môi trường lỏng Hình 3.6 Hình ảnh nấm Ganoderma sessile sau 25 ngày nuôi môi trường lỏng 43 3.2 Kết phân tích 3.2.1 Phân tích axít amin 3.2.1.1 Xây dựng đƣờng chuẩn biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Để xác định đường chuẩn ta chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn biết xác nồng độ gồm : Hình 3.7: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 10 pmol Hình 3.8 Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 25 pmol 44 Hình 3.9: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 100 pmol Hình 3.10: Sắc đồ hỗn hợp axít amin nấm Ganoderma sessile Bảng 3.1: Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ axits Aspitic Tên axit amin Nồng độ (pmol) Aspirin ( Asp ) Diện tích Nồng độ/ diện tích 10 838.81232 0.0134553 25 1810.64929 0.0139456 100 5037.59668 0.0186105 Để xây dựng đường chuẩn, ta có phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng axit Aspatic sau: Phương trình hồi qui đường chuẩn theo diện tích peak có dạng: 45 y = mx +b x nồng độ, y diện tích pic m = 50.9155 b = 264.1558 Hệ số hồi quy tuyến tính R2 = 0,9992 Ta có phương trình đường chuẩn Asp sau : Asp: y = 50.9155m + 264.1558 R2 = 0.9992 Tương tự ta có phương trình đường chuẩn 16 axit amin lại: Glu: y = 62.69125m + 263.33105 Ser: y = 84.49167m +193.64315 R2 = 0.99893 R2 = 0.99925 46 His: y = 61.99555m + 39.04232 Gly: y = 84.82661m + 137.90590 R2 = 0.99989 Thr: y = 88.61426m + 129.31682 R2 = 0.99957 Ala: y = 81.55369m + 153.46259 R2 = 0.99968 Arg: y = 90.39369m + 279.05025 R2 = 0.99949 Tyr: y = 82.72156m + 131.60838 R2 = 0.99951 R2 = 0.99961 47 Cys – SS – Cys: y = 33.76513m + 35.36127 R2 = 0.99951 Met: y = 98.27722m + 264.61287 Val: y = 87.66077m + 261.1288 R2 = 0.99945 Phe: y = 65.24065m + 649.86865 R2 = 0.99960 R2 = 0.99627 Ile: y = 87.61079m + 68.4958 Leu: y = 90.33318m + 261.08487 R2 = 0.99991 R2 = 0.99975 48 Pro: y =53.82445m – 1340806 Lys: y = 31.78382m + 66.57235 R2 = 0.99975 R2 = 0.99894 3.2.1.2 Xử lý kết Từ giá trị diện tích peak đo ta tính hàm lượng axit amin Hàm lượng axit amin ( /g) có mẫu tính theo cơng thức: C= Trong : xf C nồng độ axit amin có mẫu tính µg/g C0 hàm lượng axit amin đo tính đơn vị µg /l Vđm thể tích định mức (ml) f hệ số pha lỗng Dựa vào cơng thức ta thu hàm lượng axit amin 1g nấm linh chi (Ganoderma spongium) sau: ( Với Vđm= 50ml f = 1) TT Axit amin C0(pmol/ µl ) C0(µg /l) C(µg /l) Asp 41.54702 5525.75366 276.2877 Glu 54.24523 7974.04881 398.7024 Ser 21.83491 2292.66555 114.6333 His KPH KPH KPH Gly 56.94870 4271.1525 213.5576 Thr 20.76231 2470.71489 123.5347 Ala 50.98669 4537.81541 226.8908 Arg 21.84900 3807.96738 190.0863 Try 12.88487 2332.16147 116.6080 49 10 Cys-SS-Cys 48.95652 5923.73892 296.1869 11 Val KPH KHP KPH 12 Met 26.82462 3996.86838 119.8434 13 Phe 33.02235 5448.68775 272.4343 14 Ile 15.85418 2076.89758 103.8448 15 Leu 38.67747 5066.74857 253.3374 16 Lys 44.51431 6499.08926 324.9544 17 Pro 25.46510 2928.4865 146.4243 Ta quy đổi đơn vị theo bảng sau: Axit amin Axit asparatic (Asp) Đơn vị 1pmol/ µl = 133 x 10-12 g/10-6l = 133 µg /l Axit glutamic (Glu) 1pmol/ µl = 147 µg /l Serine (Ser) 1pmol/ µl = 105 µg /l Histidine (His) 1pmol/ µl = 155 µg /l Glycine (Gly) 1pmol/ µl = 75 µg /l Threonine (Thr) 1pmol/ µl = 119 µg /l Alanine (Ala) 1pmol/ µl = 89 µg /l Arginine (Arg) 1pmol/ µl = 174 µg /l Tyrosine (Tyr) 1pmol/ µl = 181 µg /l Cystine (Cys-SS-Cys) 1pmol/ µl = 121 µg /l Valine (Val) 1pmol/ µl = 117 µg /l Methionine (Met) 1pmol/ µl = 149 µg /l Phenylalanine (Phe) 1pmol/ µl = 165 µg /l Isoleucine (Ile) 1pmol/ µl = 131 µg /l Leucine (Leu) 1pmol/ µl = 131 µg /l Proline (Pro) 1pmol/ µl = 115 µg /l Lysine (Lys) 1pmol/ µl = 146 µg /l 50 3.2.2 Kết phân tích vitamin C 3.2.2.1 Phƣơng trình đƣờng chuẩn Dãy vitamin C khảo sát có nồng độ: 5ppm;10ppm, 20ppm; 50 ppm đo kết sau: Hình 3.11: Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 5ppm Hình 3.12 : Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 10ppm 51 Hình 3.13 : Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 20ppm Hình 3.14 : Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 50ppm Phân tích chuẩn nói xác định phương trình hồi quy tuyến tính dựa vào diện tích peak Bảng 3.2: Diện tích peak vitamin C tương ứng với nồng độ chuẩn Nồng độ Diện tích peak Lần Lần Lần 78,05327 78,14250 77,98865 10 160,60375 160,63390 160,64068 20 346,72051 346,86193 346,76569 50 898,75709 898,87325 898,91066 chuẩn 52 M B 18,325 - 18,319 R2 0,9999 Sử dụng chương trình Microsoft Excel để xây dựng đường chuẩn, ta có phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng vitamin C sau: Phương trình hồi qui đường chuẩn theo diện tích peak có dạng: y = mx +b x nồng độ, y diện tích peak m = 18,325, b = - 18,319 Hệ số hồi quy tuyến tính R2 =0,9999 Hình 3.15: Phương trình đường chuẩn vitamin C Sau q trình phân tích nấm Ganoderma sessile khơng phát vitamin C nấm 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Sau trình thực đề tài đạt kết sau : - Quan sát sinh trưởng phát triển nấm linh chi (Ganoderma sessile) qua thời gian khác suốt q trình ni cấy - Thu sinh khối nấm nuôi môi trường lỏng ( mơi trường PG +khống +pepton ) phân tích - Xây dựng đường chuẩn 17 loại axít amin - Phát thấy hàm lượng 15 loại axít amin có 7/8 axít amin thiết yếu - Loại axít amin có hàm lượng lớn - Xây dựng đường chuẩn vitamin C Đề tài số hạn chế là: - Chưa xây dựng biểu đồ phát triển nấm theo thời gian - Chưa khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phát triển lượng sinh khối nấm q trình ni cấy - Chưa phân tích hết chất dinh dưỡng vitamin A, vitamin E….trong nấm Tơi hy vọng quy trình phân tích ứng dụng phân tích kiểm nghiệm sản phẩm thực phẩm thị trường 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Đoàn Sáng (2003) Linh chi nguyên chất bệnh thời nay, Nhà xuất Y học, Hà nội, Việt Nam Lê Xuân Thám (1996) Nấm Linh chi - dược liệu quí việt nam, Nhà xuất Mũi Cà Mau Lê Duy Thắng, (2001), Kỹ thuật nuôi trồng nấm ăn, tập 1,Nhà xuất Nông nghiệp Nguyễn Hữu Đống (2003) Nuôi trồng chế biến nấm ăn nấm làm thuốc chữa bệnh,Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội Nguyễn Hữu Đống Đinh Xuân Linh (2000) Nấm ăn nấm dược liệu - công dụng công nghệ nuôi trồng, Nhà xuất Hà nội Nguyễn Đức Lượng (2003), Vi sinh học công nghiệp, tập 2,Nhà xuất Đại học Quốc Gia TP.HCM Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền Nuyễn Ánh Tuyết (2003) Thí nghiệm cơng nghệ sinh học, tập 2, thí nghiệm vi sinh vật học, Nhà xuất Đại học Quốc Gia TP.HCM Trần Văn Mão (2004) Nuôi trồng chế biến nấm ăn nấm làm thuốc chữa bệnh Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội Phạm Luân (1999), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu suất cao, Đại học quốc gia Hà Nội 10 Trịnh Tam Kiệt (1983) Nấm lớn Việt Nam, tập 1, Nhà xuất Khoa học tự nhiên công nghệ 11 Trịnh Tam Kiệt(1983) Nấm lớn Việt Nam, tập 2, Nhà xuất Khoa học tự nhiên công nghệ Tiếng Anh 12 Steyaert R.L (1972) Species of Ganoderma and related genera mainly of the boyor and leiden herbaria National de Beigique, Burxelle 13 Shufeng Zhou, A clinical Study of a Ganoderma lucidum extract in patients with type II diabetes mellitus Division of Pharmacology and Clinical Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Science, Auckland University, Auckland, NewZealand 55 14 Shufeng Zhou, Yihuai Gao, Gouliang Chen, Xihu Dai and Jingxian Ye A phaseI/II study of a Ganoderma lucidum extract in patients with coronary heart disease 15 Yihuai Gao, Guoliang Chen, Jin Lan, He Gao and Shufeng Zhou, (2001)Extractoin of Ganoderma polysaccharides at relatively low temperature Froc Int Symposium Ganoderma Sci, Auckland 16 Yihuai Gao, Jin Lan and Zhifang Liu, Extraction and determination of Ganoderma polysaccharides Int Med Complement Med Vol 1, Supplement 1,00-00 17 Zhaoji - Ding (1980) The Ganodermataceae in chine Berlin Shiffigart 18 Arora, Dilip K., Bridge P D., and Deepak B (2004) Fungal Biotechnology in Agricultural, Food, and Environmental CRC Press 19 Arya A., Albert S., and Nagadesi P.K (2008) New and Interesting Records of Basidiomycetous Fungi from Ratanmahal Wildlife Sanctuary, Gujarat, India J Mycol Pl Pathol, Vol 38, No 20 Lindequist U., Niedermeyer H.J., Julich W (2005) The pharmacological Potential of Mushrom eCAM; 2(3) 56 ... trồng nấm dược liệu (tháng 12/2001) [6] Dựa vào tình hình phát triển ngành nấm Việt Nam thực đề tài: “Ni cấy phân tích số chất dinh dƣỡng nấm linh chi (Ganoderma sessile Murrill) môi trƣờng lỏng? ??... rắn nuôi nấm phát triển mơi trường lỏng - Phân tích thành phần số thành phần dinh dưỡng có nấm linh chi (Ganoderma sessile) Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Nấm 1.1.1 Khái quát chung nấm Hiện tất sinh vật sống... : 0952040388 Ngành : Cơng nghệ thực phẩm 1.Tên đề tài: Ni cấy phân tích số chất dinh dƣỡng nấm Ganoderma sessile Murrill môi trƣờng lỏng Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: …………………………………………………………………………………………