nghiên cứu chiết tách và phân lập một số chất từ cây giá (excoecaria agallocha l ) họ euphorbicaceae ở việt nam

nghiên cứu chiết tách và phân lập một số chất từ cây giá (excoecaria agallocha l ) họ euphorbicaceae ở việt nam

MÃ ĐỀ TÀI:

TÊN ĐỀ TÀI : NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ CÂY GIÁ

(EXCOECARIA AGALLOCHA L., EUPHOBIACEAE)

Sinh viên: Họ và tên – Lớp – Khóa Giáo viên hướng dẫn: Học hàm học vị Họ và tên

Khoa/Viện

Điện thoại nhóm SV :

Phần Tóm tắt nội dung đề tài:

Bối cảnh và mục tiêu : Cây Giá có tên khoa học là Excoecaria agallocha L., họ

Euphorbiaceae là một loài cây mọc ở các vùng đất bồi ven biển, ven sông ưa đất cát pha, có mùn,

nước lợ hoặc nước mặn, cây rất dễ tìm và có khả năng phát triển tốt Từ Cây Giá (Excoecaria agallocha L.) người ta chiết được một số chất có hoạt tính kháng virus HIV, nhiều hợp chất có

hoạt tính sinh học cao, có tác dụng ức chế mạnh đối với một số loài virus, có khả năng kháng

viêm, chống oxy hóa và ức chế một số tác nhân gây ung thư.[1] Vì vậy đề tài “ Nghiên cứu chiết

tách và phân lập một số chất từ cây giá (Excoecaria agallocha L.) họ Euphorbiaceae ở Việt Nam

” sẽ góp phần tìm hiểu tiềm năng khai thác và sử dụng loài cây hữu ích này

I Đặt vấn đề

Cây Giá (Excoecaria agallocha L.) có vùng phân bố tương đối rộng, có thể gặp ở các khu

vực ven biển từ miền Nam Ấn Độ, Sri Lanka, Myanmar đến Thái Lan, Việt Nam… Về phía Bắccòn gặp ở Trung Quốc, Nhật Bản Phía Nam, có thể gặp ở Bắc Austalia và khu vực Thái Bình

Dương Lá cây có thể sắc uống chữa động kinh; giã tươi đắp trị các vết loét Dịch lá nấu với dầudùng xoa đắp trị thấp khớp, phong và bại liệt Rễ cây ít độc hơn các phần của cây trên mặt đất.Giã ra lẫn với Gừng, dùng làm thuốc chườm trị sưng chân tay Hạt phơi nắng có thể chế dầu

dùng trị ghẻ.[2]

Theo thống kê, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) là một họ lớn của thực vật có hoa với 240chi và khoảng 6.000 loài Phần lớn là cây thân thảo, nhưng ở khu vực nhiệt đới cũng tồn tại cácloại cây bụi hoặc cây thân gỗ Một số loài cây chứa nhiều nước và tương tự như các loại xươngrồng

Các cây thuộc chi Excoecaria là một loài Cây gỗ cao 20m, đường kính 25cm Cànhnhánh nhiều, khúc khuỷu, vỏ màu xám tro Thân có nhựa mủ Lá đơn, mọc cách, thường tậptrung ở đầu cành, phiến lá dày cứng hình bầu dục hoặc hình trứng bầu dục, đầu có mũi lồi ngắn,hơi lệch và tù, gốc lá tù, dài 5 - 8cm, rộng 2,5 - 4,5cm, mép hơi gợn sóng, gân bên 8 - 9 đôi,cuống lá mảnh, dài 2cm, có một tuyến nhỏ ở gốc phiến lá Hoa đơn tình khác gốc hay cùng gốc.Cụm hoa đực bông, dài 2 - 8cm Hoa đực có 3 cánh đài, hình dải, 3 nhị, chỉ nhị phình ở gốc Hoacái, lá bắc giống hoa đực, hoa gần như không cuống, cánh đài 3, hình tam giác Bầu hình trứng 3

ô, 3 vòi nhụy; quả nang có cuống nhỏ, có 3 cạnh, đường kính 1cm Hạt hình cầu, đường kính

4mm, màu xám nhạt.[3]

Hình 1: Cây Giá (Excoecaria agallocha L.)

1.1 Tình hình nghiên cứu cây giá (Excoecaria agallocha L.)

Trên thế giới, Cây Giá đã được nghiên cứu rất nhiều về thành phần hóa học và hoạt tínhsinh học Các chất tách được chủ yếu thuộc vào 2 lớp chất diterpen và flavonoid

Năm 2000, Bằng các phương pháp phổ Ammanamanchi và đồng sự của ông đã phân lập

được 11 diterpen từ dịch chiết n-hexan của rễ của Cây Giá (Excoecaria agallocha L.) thu ở vùng

Godavari Ấn Độ Trong đó có 5 diterpen mới là:

3-oxo-ent-13epi-8(13)-epoxy-15-chloro-14-hydroxylabdan (1); ent-15-chloro-13,14

dihydroxylabd-8(9)-en-3-on (2); ent-15-chloro-labd-8(9)en-3α,13,14-triol (3); 8(14),15-isopimaradien-3-on (4); 8,13-epoxy-3-nor-2,3-seco-14-epilabden-2,4-olid (5) Và 6 diterpen đã biết là: ent-3-oxo-13-epi-manoyl oxid (6); ent- 3β-hydroxy-13-epi-manoyl oxid (7); (13R,14S)-ent-8α,13;14,15-diepoxy-13-epi-labdan-3-on (8); ent-16-hydroxy-3- oxo-13-epi- manoyl oxid (9); ent-15-hydroxylabda-8(17),13E-dien-3-on (10); labda- 8(17),13E-dien-3β,15- diol (11) Một số các Diterpen phân lập được có hoạt tính chống lại sự phát triển của khối u trong cơ thể chuột [4].

ent-11β-hydroxy-Năm 2000, Tenji Konishi và cộng sự đã phân lập được 2 diterpen mới được từ nhựa gỗ

của cây Giá (Excoecaria agallocha L.) thu ở Okinawa, Nhật Bản Cấu trúc của 2 diterpen mới

này này đã được xác định nhờ các phương pháp phổ NMR và X-Ray đơn tinh thể đó là

Excoecarin M (12) và Excoecarin N (13) [5].

12

13

Năm 2002, Ammanamanchi và cộng sự đã phân lập và nhận dạng được 3 diterpen mới

từ dịch chiết n-hexan của rễ cây Giá (Excoecaria agallocha L.) thu ở vùng cửa sông Godavary,

Ấn Độ đó là: 8,13-epoxy- 4,6α-dihydroxy-3,4-secolabd-14-en-3-oat (14); 8,13-epoxy-2,3-secolabd-14-en-2,11-olid-3-oat (15); ent-17-hydroxy-3,4-secokaura-4(19),15- dien-3-oat 3 (16) [6].

(Excoecaria agallocha L.), cấu trúc của các diterpen mới này được xây dựng dựa trên cơ sở dữ

liệu quang phổ 13C, 1H NMR và X-Ray đơn tinh thể đó là:

13-epi-12-hydroxy-2,3-secolabda-14-en (17), axit 13-epi-12-hydroxy-2,3-secolabda-14-ent-14S,15-epoxy-2,3-seco-13-epi-labdan-2,3-dioic (18) và axit 13-epi-12-hydroxy-2,3-secolabda-14- 2,3-seco-13-epi-labdan-2,3-dioic (19) Trong đó T1và T2 có cùng công thức là Và 3 diterpen đã biết là axit ent-12-oxo-2 ,3-secobeyer-15-en-2,3-dioic (20); agallochin H (21); và ent-15-epoxy- beyeran-3α-ol (22) [7].

ent-14R,15-epoxy-Gần đây, một phorbol este có tên là 12-deoxyphorbol-13-(3E, 5E-decadienoat), với đặc

tính chống HIV, đã được phân lập từ lá và thân của cây Giá (Excoecaria agallocha L.) nghiên

cứu ở Tây bắc Australia Trong quá trình nghiên cứu người ta thấy các thành phần diterpen có

khả năng ức chế hiệu quả với virus Epstein-Barr gây ung thư [1], [8].

H H

O

18

O

HOOC HOOC

Năm 2007, Ji-Dong Wang và các đồng sự của ông đã phân lập được 4 diterpen từ dịch

chiết etyl axetat từ thân cây và lá của cây Giá ( Excoecaria agallocha L.) sử dụng các phương

pháp sắc ký cột sử dụng trên silica gel, Sephadex LH-20 Bằng các phương pháp phổ như phổhồng ngoại (IR), 13C và 1H NMR đã xác định được cấu trúc của 4 loại diterpen mới được đặt tên

excoagallochaols A-D đó là: Excoagallochaol A (23), Excoagallochaol B (24), Excoagallochaol

C (25), Excoagallochaol D(26) .Trong đó Excoagallochaol D(26) là đồng phân của Excoagallochaol C (25) [8].

23 24

Năm 2009, Zhan Chang Wang và cộng sự đã phân lập từ dịch chiết etanol của vỏ cây Giá

(Excoecaria agallocha L.) được 4 diterpen trong đó một diterpen mới và ba diterpen đã biết Đó

là ent-16α-hydroxy-atisan-3,4-lacton (30); ent-16α-hydroxy-atisan-3-on (27); diol (28); axít ent-3,4-seco-16α-hydroxyatis- 4(19)-en -3-oic (29) [9].

ent-atisan-3β,16α-Một số diterpen phân lập từ gỗ của cây Giá (Excoecaria agallocha L.) cho thấy hoạt tính

chống khối u cũng như ngăn chặn sự chống gỉ của một số loài sinh vật như sò, giun ống, rong

biển [4], [9].

10 9 8

7 6

20 11

12

17 15 13

30

Năm 2010, Yongxin Li và cộng sự đã phân lập từ dịch chiết metanol của thân và cành

của cây Giá (Excoecaria agallocha L.) ở Trung Quốc Từ đó phân lập được sáu diterpen khung

ent-kauran có tên là agallochaol K-P đó là : Agallochaol K (axít

ent-17-hydroxy-3,4-secokaur-4(18),15-die-3-oic ) (31) ; Agallochaol L (axít oic ) (32); Agallochaol M (axít ent-17-coumaroyloxy-3,4-secokaur-4(18),15-die-3-oic ) (33); Agallochaol N (axít ent-3,4-secokaur-4(18),15-dien-3-oic ) (34); Agallochaol O (ent-17- caffeoyloxykaur-15-en-3-on) (35); Agallochaol P (ent-kaur-15-en-3b,17-diol-2-on) (36); Agallochaol M (axít ent-3,4-secoatisan-4(18),16-dien-3-oic) (37)

17-caffeoyloxy-3,4-secokaur-4(18),15-die-3-Và có 9 diterpen đã biết là: agallochin O (38); 17-hydroxykaur-15-en-3-on (39); kaur-15-en-3β,17-diol (40); 7-deoxogeayin (41); ent-15-hydroxylabd-8(17),13E-dien-3-on (42); ent-15,18-dihydroxylabd-8(17),13E-dien (43); ent-3β, 11α-dihydroxyisopimara-8(14),15-dien-2-

ent-on (44); và ent-3β-hydroxybeyer-15-en-2,12-dient-on (45).

Trong đó các diterpen Agallochaol K (axít

17-hydroxy-3,4-secokaur-4(18),15-die-3-oic ) (31), Agallochaol O (17-caffeoyloxykaur-15-en-3-on) (35), Agallochaol M (axít 3,4-secoatisan-4(18),16-dien-3-oic) (37), ent-17-hydroxykaur-15-en-3-on (39), ent-kaur-15-en- 3β,17-diol (40), và ent-15,18-dihydroxylabd-8(17),13E-dien (43) cho thấy tiềm năng chống viêm hiệu quả [10].

42 R1=O, R2=H

43 R1=H2, R2=OH

1.3 Các flavonoid

Flavonoid là các hợp chất polyphenol, đa dạng về cấu trúc hóa học và sinh học Chúng có

ở hầu hết các bộ phận của cây, đặc biệt là trong các tế bào thực vật quang hợp Các flavonoidkhông được tổng hợp ở người và động vật

Năm 2010, Yusnita Rifai và các đồng sự của ông đã phân lập được từ dịch chiết metanol,

n- hexan, etylaxetat và butanol từ lá của cây Giá (Excoecaria agallocha L.) 8 flavonoid Cấu trúc

của các chất được xây dựng nhờ sử dụng các phương pháp phổ, trong đó có 2 flavonoid mới

(45), (46) và 6 flavonoid glycosid đã biết: afzelin (47); quercitrin (48); rutin (49); O-(2-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosid (50); kaempferid 3 O-α-L-rhamnopyranosid (51) và kaempferol 3-Oa-Larabinofuranosid (52).

kaempferol-3-Ba glycoside flavonoid bao gồm 2 hợp chất mới (45 và 46) được phân lập từ cây Giá

(Excoecaria agallocha L.) là chất ức chế và chống lại tế bào ung thư ở tuyến tụy của người và tế

bào ung thư tuyến tiền liệt mang lại nhiều hiệu quả tích cực [11].

O

H 3 C HO

H 3 CO OH

OH OH O

46

H 3 C HO HO

OH 48

O OH

OH

OH HO

O O

H 3 C

HO AcO

Năm 2011, Yongxin Li và các đồng sự của ông đã phân lập được từ dịch chiết butanol

của cây Giá (Excoecaria agallocha L.) Bằng các phương pháp phân tích trên quang phổ IR, MS,

NMR đã xác định được cấy trúc của bốn flavonoid mới Bốn flavonoid mới được phân lập là:

Excoecariphenol A (53); Excoecariphenol B (54) ; Excoecariphenol C (55); Excoecariphenol D

(56) Những flavonoid mới này được thử nghiệm và cho kết quả tích cực trong phòng chống bệnh viêm gan HCV [12].

H OH H O S H HO H H

OH

OH

OH

OH R OH OH

53.R=H 54.R=OH

O

OH OH OH OH

OH OH

O

OH

H OH

HO

OH OHO

O

OH OH

OH O

O H

55

O

OH OH

H

OH OH

OH O

O 55 H

HO HOHO

OH

H OH OH

OH O

O O

56

2 Hoạt tính sinh học của cây giá (Excoecaria agallocha L.)

Cây Giá Excoecaria agallocha được hoạt động tốt nhờ chứa những thành phần hóa học,đặc biệt là:

Một số đặc tính trị liệu của cây Giá:

Được sử dụng theo truyền thống để chữa trị:

- Những vết thương

- Những vết chích của một số loài động vật biển

- Những bệnh gây lở loét

- Được xem như một thuốc tẩy xổ và làm nôn

Rễ cây Giá có thể chữa trị được đau rang và sung

Nước ép của lá cây Giá đun sôi trong dầu được áp dụng trong:

Mẫu lá khô 5.7kg

1 Chiết với MeOH 95%

2 Cất loại MeOH

Cặn MeOH 530g

Thêm 2lit H2O

Chiết với ethyl axetat cất loại dm

Cặn chiết EtOAc 54.5g

Dịch nước còn lại 310g

Chiết với n-hexan

cất loại dm

Cặn chiết

n-hexan 96.1g

II KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Thực nghiệm mẫu lá cây Giá:

Sơ đồ 1: Quy trình chiết mẫu thực vật

Sơ đồ 2: Quy trình phân lập chất từ cặn n-hexan của lá cây Giá

5.7kg bột lá khô của cây Giá được chiết siêu âm trong MeOH 95% 3lần (3 tiếng/lần).Dịch chiết tổng được cô quay áp suất giảm thu được 530g cặn tổng MeOH Đem pha loãng cặntổng MeOH với 2lit nước và chiết phân bố lần lượt với n-hexan và etyl axetat, cô quay giảm ápthu được 96.1g cặn n-hexan, 54.5g cặn etyl axetat và 310g cặn nước

50g cặn n-hexan

Sắc ký cột silicagel (10/1) n-hexan/EtOAc

PĐ2 12.4g PĐ1 6.6g

20%-50% EtOAc

PĐ3-PĐ7

EA2 (3) (taraxerol) EA3 (2)

(epitaraxerol) EA1 (1)

(taraxerone)

Tiến hành phân lập chất từ 50g cặn n-hexan của dịch chiết tổng MeOH từ lá của cây giábằng sắc ký cột silica gel (tỷ lệ chất/silica gel=10/1) với hệ dung môi n-hexan/etyl axetat, tăngdần tỷ lệ etylaxetat từ 0%-100% thu được 7 phân đoạn chính.

Phân đoạn 1(6.6g) thu được khi rửa gải bằng hệ n-hexan/etyl axetat với tỷ lệ etyl axetat5% Phân đoạn 1 được tinh chế bằng sắc ký cột (tỷ lệ chất/silica gel=1/25), với hệ dung môi rửagiải là n-hexan/etyl axetat = 65/1 thu được 3 phân đoạn chính I.1, I.2, I.3 Kết tinh phân đoạn I.1trong n-hexan, rửa lại bằng n-hexan lạnh thu được 0.15g chất EA1(taraxer-14-en-3-one) là tinhthể hình kim, màu trắng, Rf= 0.52 (n-hexan/etylaxetat = 20/1), to

nc= 241-243oC Phân đoạn I.3được kết tinh lại trong n-hexan thu được 96mg EA3 (epitaraxerol) là tinh thể hình kim, màutrắng, Rf=0.33 (n-hexan/etylaxetat = 20/1), to

nc= 268-269oC

Phân đoạn 2(12.4g) thu được khi rửa gải bằng hệ n-hexan/etyl axetat với tỷ lệ etyl axetat10% Sắc ký cột phân đoạn 2 (tỷ lệ chất/silica gel=30/1), dung môi rửa giải làn-hexan/etylaxetat=50/1 thu được 1phân đoạn chính Kết tinh trong CH2Cl2 và rửa lại bằng

CH2Cl2 lạnh thu được 0.60g chất EA2 (taraxerol), ở dạng tinh thể hình phiến màu trắng, Rf= 0.61(n-hexan/etylaxetat = 10/1), to

nc= 279-280oC

* Thảo luận kết quả

3

1 2

4 5

6 7 8

9 10

11 12

13 14 15 16

17 18

22 27

28

30 29

(3)

Hợp chất EA1 (1): 14-taraxerene-3-one

Hợp chất EA1 thu được từ cặn chiết n-hexan của dịch chiết tổng metanol của loài

Excoecaria agallocha L là chất kết tinh hình kim, màu trắng Phổ 1H-NMR có dạng phổ củamột hợp chất triterpen trong đó có sự xuất hiện của 8 nhóm metylbậc bốn trong phân tử thểhiện qua 8 tín hiệu singlet tại H 0.83 (3H), 0.91 (3H), 0.92 (3H), 0.95 (3H), 1.06 (3H),1.08 (3H), 1.09 (3H), và 1.14 (3H) Ngoài ra, trên phổ còn thấy xuất hiện tín hiệu mộtproton olefin tại H 5.55 (1H, dd, J = 8.0, 3.5 Hz) Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu của 30cacbon, dựa vào kết quả của các phổ DEPT cho thấy hợp chất này có 8 cacbon bậc bốn tại C

217.5, 157.6, 47.5, 38.8, 37.7, 37.5, 35.7, 28.7; 4 nhóm metin tại C 117.1, 55.7, 48.8, 48.7; 10nhóm metylen tại C 40.6, 38.3, 37.6, 36.6, 35.1, 34.1, 33.5, 33.1, 19.9, 17.4; và 8 nhóm metyltại C 33.3, 29.9, 29.8, 26.1, 25.5, 21.4, 21.3 và 14.8 Trong đó tín hiệu của nhóm cacbonylđược xác định tại C 217.5, một nối đôi bị thế 3 vị trí tại C 157.6 (C) và 117.1 (CH) Trên phổ

ESI-MS ion dương chất EA1 cho pic ion phân tử tại m/z = 425 [M + H]+ Công thức phân tử đượcxác định thông qua các dữ liệu phổ MS và 13C-NMR là C30H48O Phân tích các tín hiệu protoncủa các nhóm metyl trên phổ 1H-NMR và độ chuyển dịch hóa học của các nguyên tử cacbon trênphổ 13C-NMR khẳng định EA1 là một triterpen khung taraxeran So sánh dữ liệu phổ của EA1 với tài liệu [] cho phép kết luận EA1 chính là 14-taraxeren-3-one

Hợp chất EA3 (2): 14-taraxerene-3-ol (epitaraxerol)

Hợp chất EA3 thu được dưới dạng tinh thể màu trắng Trên phổ ESI-MS ion dương chất EA3

cho pic ion phân tử tại m/z = 427 [M + H]+ Công thức phân tử được xác định thông qua các dữliệu phổ MS và 13C-NMR là C30H50O Trên phổ 1H-NMR của EA3 xuất hiện tín hiệu của 8nhóm metyl bậc bốn tại H 0.82, 0.86, 0.91(6H), 0.94(9H), 1.09 dưới dạng các singlet,một tín hiệu proton nối đôi tại H 5.52 (dd, J = 8.0, 3.5Hz) và một tín hiệu proton tại H

3.40 (1H, br) Nhìn chung, phổ 1H-NMR của EA3 khá giống với hợp chất EA1, trên phổcủa EA3 có xuất hiện thêm tín hiệu proton tại H 3.40 đây là tín hiệu của nhómoximetin Điều này cho phép dự đoán EA3 là một dẫn xuất bị khử nhóm cacbonyl (>C=O)của EA1 Phổ 13C-NMR của EA3 xuất hiện tín hiệu của 30 cacbon khá giống với hợp chấtEA1 Tuy nhiên, trên phổ 13C-NMR của EA3 không thấy xuất hiện tín hiệu của nhóm