Công ty TNHH Thông Thuận thành lập theo giấy chứng nhận đăng ký kinh doanh số 004339/GP-TLDN sở kế hoạch đầu tư tỉnh Bình Thuận cấp ngày 11 tháng 08 năm 1999 Tiền thân Công ty TNHH Thông Thuận sở sản xuất tơm giống hình thành từ năm 1990, ơng Trương Hữu Thông gầy dựng nên xã Vĩnh Hảo, huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận Trong tiến trình lịch sử đầy thăng trầm, công ty phát triển ngày lớn mạnh vững hôm khẳng định mạnh dẫn đầu nước ngành sản xuất tôm giống; nuôi tôm thương phẩm, chế biến thủy sản xuất khẩu, sản xuất gạch tuynel sản xuất muối công nghiệp Hoạt động sản xuất Công ty bao gồm: 1) 2) 3) 4) 5) Sản xuất tôm giống Thông Thuận Sản xuất tôm thương phẩm Sản xuất gạch Tuynel Chế biến thủy sản xuất Ni bị giống thịt, bị sữa cơng nghệ cao Cơng ty phát triển ngày hôm phần lớn nhờ nổ lực không ngừng người sáng lập đầu tiên, Ơng Trương Hữu Thơng - Chủ tịch Hội Đồng Quản Trị kiêm Tổng Giám đốc công ty 5.000 tập thể cán bộ, công nhân viên đơn vị Tổng công ty Thông Thuận, cộng với đồng thuận lãnh đạo địa phương, khách hàng nước quan tâm ủng hộ Sản xuất tơm giống chất lượng: Cơng ty có khu sản xuất tôm giống, với 100 trại giống đại (đạt chứng nhận GlobalGAP, ACC châu Âu Mỹ) Hàng năm, Công ty sản xuất cung ứng tỷ giống đạt chất lượng cao, phù hợp với điều kiện khí hậu thổ nhưỡng Việt Nam, sau nhiều năm tìm tịi chọn lọc từ nguồn tôm bố mẹ tốt giới; Công tác sản xuất giống tuân thủ theo quy trình nghiêm ngặt thực đội ngũ công nhân lành nghề cán kỹ thuật trình độ cao, nhiều kinh nghiệm Ni tơm thương phẩm:
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT KHOA HÓA HỌC VIÊN ̣ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TÂY NGUYÊN BÁO CÁO THỰC TẬP NGHỀ NGHIỆP “THAM GIA TRONG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT NƯỚC CỦA CỦ ĐINH LĂNG” Sinh viên thực tập: MSSV: Lớp: Đà Lạt, tháng năm 2019 Lời cảm ơn Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo quý Công ty tiếp nhận em vào thực tập Nhà máy chế biến số – Chi nhánh Công ty TNHH Thông Thuận Tại Ninh Thuận Cảm ơn tất Chị phòng Kiểm nghiệm tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em trình thực tập Với vốn kiến thức tiếp thu trình học khơng tảng cho q trình viết báo cáo mà hành trang quý báu để em bước vào đời cách vững tự tin để thực cơng việc sau Em kính chúc Ban lãnh đạo Công ty Chị phòng Kiểm nghiệm dồi sức khỏe, đạt nhiều thành công tốt đẹp công việc Em xin chân thành cảm ơn! Phan Rang, tháng 12 năm 2017 Người thực Nguyễn Nghiêm MỤC LỤC Lời cảm ơn I GIỚI THIỆU VỀ CÔNG TY TNHH THÔNG THUẬN .2 II KHÁNG SINH 2.1.Khái niệm kháng sinh .4 2.2 Dư lượng kháng sinh, nguyên nhân tác hại .4 2.2.1 Dư lượng kháng sinh .4 2.2.2 Nguyên nhân bản gây nhiễm dư lượng kháng sinh .5 2.2.3 Tác hại dư lượng kháng sinh 2.3 PHƯƠNG PHÁP ELISA .6 2.3.1 Khái niệm: .6 2.3.2 Phân loại: 2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy phản ứng ELISA 2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết ELISA .7 2.3.5 Ứng dụng: 2.4 KIỂM NGHIỆM KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA 2.4.1.Kiểm Enrofloxacin phương pháp Elisa 2.4.2 Kiểm Doxycyline phương pháp Elisa 11 2.4.3.Kiểm Chloramphenicol phương pháp Elisa 13 2.4.4 Kiểm Sulfonamide phương pháp Elisa 16 2.4.5 Kiểm Nitrofuran AOZ phương pháp Elisa 19 LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU VỀ CÔNG TY TNHH THƠNG THUẬN 1.1 Thơng tin đơn vị thực tập Công ty TNHH Thông Thuận thành lập theo giấy chứng nhận đăng ký kinh doanh số 004339/GP-TLDN sở kế hoạch đầu tư tỉnh Bình Thuận cấp ngày 11 tháng 08 năm 1999 Tiền thân Công ty TNHH Thông Thuận sở sản xuất tơm giống hình thành từ năm 1990, ơng Trương Hữu Thông gầy dựng nên xã Vĩnh Hảo, huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận Trong tiến trình lịch sử đầy thăng trầm, công ty phát triển ngày lớn mạnh vững hôm khẳng định mạnh dẫn đầu nước ngành sản xuất tôm giống; nuôi tôm thương phẩm, chế biến thủy sản xuất khẩu, sản xuất gạch tuynel sản xuất muối công nghiệp Hoạt động sản xuất Công ty bao gồm: 1) 2) 3) 4) 5) Sản xuất tôm giống Thông Thuận Sản xuất tôm thương phẩm Sản xuất gạch Tuynel Chế biến thủy sản xuất Ni bị giống thịt, bị sữa cơng nghệ cao Cơng ty phát triển ngày hôm phần lớn nhờ nổ lực không ngừng người sáng lập đầu tiên, Ơng Trương Hữu Thơng - Chủ tịch Hội Đồng Quản Trị kiêm Tổng Giám đốc công ty 5.000 tập thể cán bộ, công nhân viên đơn vị Tổng công ty Thông Thuận, cộng với đồng thuận lãnh đạo địa phương, khách hàng nước quan tâm ủng hộ Sản xuất tơm giống chất lượng: Cơng ty có khu sản xuất tôm giống, với 100 trại giống đại (đạt chứng nhận GlobalGAP, ACC châu Âu Mỹ) Hàng năm, Công ty sản xuất cung ứng tỷ giống đạt chất lượng cao, phù hợp với điều kiện khí hậu thổ nhưỡng Việt Nam, sau nhiều năm tìm tịi chọn lọc từ nguồn tôm bố mẹ tốt giới; Công tác sản xuất giống tuân thủ theo quy trình nghiêm ngặt thực đội ngũ công nhân lành nghề cán kỹ thuật trình độ cao, nhiều kinh nghiệm Ni tơm thương phẩm: Ngồi ra, Thơng Thuận cịn có xí nghiệp tơm thương phẩm với số lượng farm ni lớn, đặt tỉnh Khánh Hịa, Ninh Thuận, Bình Thuận Kiên Giang Đạt chứng GlobalGAP, ACC với sản lượng 10.000 - 12.000 tấn/năm Tôm thương phẩm Công ty TNHH Thông Thuận ni cho ăn theo quy trình cơng nghệ vi sinh đại, tuân thủ nghiêm ngặt theo tiêu chuẩn chất lượng thực phẩm khắt khe Với số lượng farm nuôi lớn trải dài dọc khắp miền Trung Tây Nam bộ, năm, Công ty cung cấp nguyên liệu cho hệ thống nhà máy chế biến Công ty thị trường nước Tôm thương phẩm Thông Thuận thị trường đánh giá tốt chất lượng độ an tồn Với xí nghiệp tôm đầu tư đại, sản xuất hiệu quả: Xí nghiệp ni tơm Ninh Hịa: với 30 diện tích ni 30 ao ni Sản lượng 400 tấn/ năm; Xí nghiệp ni tơm Cam Ranh: với 75 diện tích ni 106 ao ni Sản lượng 1.400 tấn/năm; Xí ngiệp ni tơm Phan Rang: với 16 diện tích ni 16 ao ni Sản lượng 260 tấn/năm; Xí nghiệp ni tơm Núi Tào: với 160 diện tích ni 170 ao ni Sản lượng 2.500 tấn/năm; Xí nghiệp ni tơm Phước Thể: với 31 diện tích 50 ao ni Sản lượng 650 tấn/năm; Xí nghiệp ni tơm Kiên Giang: ni với 300 diện tích xí nghiệp ni sau : Xí nghiệp ni tơm số 1: 75 với 80 ao Sản lượng 1.000 tấn/năm Xí nghiệp ni tơm số 2: 90 với 137 ao Sản lượng 1.500 tấn/năm Xí nghiệp ni tôm số 3: 135 với 244 ao Sản lượng 2.500 tấn/năm Thơng Thuận - Kiên Giang có diện tích ni lên đến 1.200 với 1.000 nuôi tôm 200 nuôi cá rô phi Sản lượng tơm lúc Kiên Giang tăng lên 13.000 tôm thương phẩm/năm Chế biến, xuất sản phẩm thủy sản: Với mạnh lĩnh vực nuôi tôm giống, tôm thương phẩm nguồn nguyên liệu chủ động, chất lượng, Thông Thuận mạnh dạn đầu tư vào lĩnh vực chế biến xuất thủy sản Đến nay, Cơng ty có hai nhà máy hoạt động với sản phẩm đầu đạt tiêu chuẩn quốc tế, đáp ứng yêu cầu khắt khe nhiều thị trường khó tính giới EU, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Đông Chi nhánh Công ty TNHH MTV Thông Thuận - Kiên Giang: hoạt động mạnh lĩnh vực nuôi tôm thương phẩm Đạt chứng GlobalGAP sao, ACC với sản lượng 4.500 tấn/năm Hiện, Công ty đầu tư mở rộng farm nuôi nhà máy chế biến thủy sản Gồm phân xưởng: Phân xưởng chế biến tôm xuất với sản lượng tới 7.000 - 8.000 thành phẩm/năm hoạt động hiệu Phân xưởng cá với sản lượng 7.500 - 8.000 tấn/năm, vào hoạt động năm 2015 với lực chế biến tới 20 triệu USD/năm Khi vào hoạt động tạo việc làm ổn định cho 3.000 lao động địa phương, đảm bảo đầu cho sản phẩm farm nuôi Thông Thuận Chi nhánh Công ty TNHH Thông Thuận - Ninh Thuận: hoạt động lĩnh vực sản xuất, chế biến thủy sản xuất Đạt chứng GlobalGAP sao, ACC sao, HACCP, IFS, HALA… năm cung cấp thị trường sản lượng 3.000 thành phẩm Doanh số 20 triệu USD/năm, tạo việc làm ổn định cho 2.000 lao động địa phương Công ty CP Thủy sản Thông Thuận - Cam Ranh: hoạt động lĩnh vực sản xuất chế biến thủy sản xuất Nhờ mạnh chủ động nguồn nguyên liệu, quy trình chế biến tuân thủ theo chứng GlobalGAP, ACC sao, HACCP, IFS, HALA Doanh số 30 triệu USD/năm II KHÁNG SINH: 2.1.Khái niệm kháng sinh Kháng sinh còn gọi là Trụ sinh là chất chiết xuất từ vi sinh vật, nấm, tổng hợp bán tổng hợp, có khả tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm phát triển vi khuẩn cách đặc hiệu Nó có tác dụng lên vi khuẩn cấp độ phân tử, thường vị trí quan trọng vi khuẩn hay phản ứng trình phát triển vi khuẩn 2.2 Dư lượng kháng sinh, nguyên nhân tác hại 2.2.1 Dư lượng kháng sinh Dư lượng kháng sinh tình trạng kháng sinh cịn thực phẩm thịt,tơm, cá, trứng, sữa, v.v… dạng nguyên chất hay chuyển hóa, gây tác hại người sử dụng 2.2.2 Nguyên nhân bản gây nhiễm dư lượng kháng sinh. Mô ̣t là, số bô ̣ phâ ̣n nhỏ người dân chưa nắm danh mục hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng lợi nhuận kinh tế lạm dụng hóa chất, kháng sinh trong phòng chống dịch bệnh nuôi tôm thâm canh, bán thâm canh không tuân thủ thời gian ngưng sử dụng kháng sinh trước thu hoạch tôm Hai là, số sở thu mua, sơ chế, chế biến thực chưa tốt hệ thống quản lý chất lượng, chưa kiểm sốt mối nguy tới hạn cơng đoạn sản xuất, kiểm soát chưa đầy đủ loại hóa chất, kháng sinh khâu tiếp nhâ ̣n nguyên liê ̣u vơ ý gây nhiễm q trình sơ chế, chế biến 2.2.3 Tác hại dư lượng kháng sinh Tác hại môi trường nuôi trồng thủy sản Do mô ̣t số người dân còn lạm dụng hóa chất xử lý nước, cải tạo ao nuôi đã tiêu diệt cả vi khuẩn có hại và vi khuẩn có lợi, gây cân hệ sinh thái môi trường nuôi; sử dụng kháng sinh không cách nuôi tôm thâm canh, bán thâm canh, tạo dòng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh, gây nên tượng lờn thuốc, tơm có bệnh xảy khó điều trị Tác hại người tiêu dùng Khi người tiêu dùng ăn phải sản phẩm thủy sản gây ảnh hưởng đến sức khỏe, gây ngộ độc, suy tủy, suy gan, suy thận, tích tụ lâu ngày dẫn đến ung thư, đột biến gen Tác hại quá trình xuất Nếu thị trường giới không nhập tôm nuôi Việt Nam nhiễm dư lượng kháng sinh, thị trường nước khơng thể tiêu thụ hết sản phẩm tôm nuôi dân, dẫn đến giá thành tôm nguyên liệu giảm mạnh, ảnh hưởng nghiêm trọng đến kinh tế nước ta, đặc biệt lĩnh vực thủy 2.3 PHƯƠNG PHÁP ELISA 2.3.1 Khái niệm Elisa (Enzyme-linked immunoSorbent Assay): Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với Enzyme Dựa kết hợp giữ kháng nguyên kháng thể đặc hiệu.phản ứng tạo sản phẩm có màu hay phát sáng.trong tính chất hoạt hóa enzyme độ đặc hiệu kháng thể không đổi Ưu điểm: Ưu điểm quan trọng phương pháp Elisa độ nhạy cao phát phức hợp nhỏ,cho phép phát sớm tác nhân gây bệnh giai đoạn sớm mầm bệnh xâm nhiễm Nhanh, thao tác đơn giản Rẻ tiền Nhược điểm: Độ xác không cao 2.3.2 Phân loại ELISA dị pha (heterogeneous), hay gọi ELISA pha rắn (solid phase), gồm phương pháp: ELISA trực tiếp (direct ELISA) ELISA gián tiếp (indirect ELISA) ELISA sandwich ELISA cạnh tranh (competitive ELISA) 2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy phương pháp ELISA Số lượng kháng thể thứ gắn vào đáy giếng Ái lực kháng thể thứ kháng nguyên Ái lực kháng thể thứ hai kháng nguyên 2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết ELISA Giếng không lên màu không xuất chuẩn: Thao tác thiếu bước, không theo thứ tự, sử dụng sai hộp Conjugate HRP, TMB bị hỏng Mật độ quang thấp: thuốc thử hết hạn sử dụng chung với số lơ khác, pha nước rữa khơng xác, rữa nhầm Kit, rữa nhiều, thời gian ủ ngắn, nhiệt độ phòng thấp Mật độ quang cao: Nguồn nước cất pha đệm rữa không đảm bảo, nhiệt độ phòng cao 2.3.5 Ứng dụng Pháp chất kháng sinh chloramphenicol, Sulfonamide, Nitrofuran AOZ ( chất khơng phép có tơm,cá ,và thủy sản khác) Kiểm tra dư lượng kháng sinh thực phẩm, tàn dư thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu… 2.3.6 Dụng cụ,thiết bị: Micropipette Handstep Ống đựng mẫu ống eppendort Tủ hút Máy Vortex Máy ly tâm Máy đọc số Tủ ấm Bể điều nhiệt thổi khí Nito Bộ kit hóa chất tùy theo phương pháp 2.4 KIỂM NGHIỆM KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA Nguyên lý phương pháp Dựa chế cạnh tranh miễn dịch chất kháng sinh (Enrofloxacin, Chloramphenicol, Sulfonamide, Nitrofuran AOZ, Doxycycline) cộng hợp Conjugate đánh dấu lên kháng thể đặc hiệu Nồng độ (Enrofloxacin, Chloramphenicol, Sulfonamide, Nitrofuran AOZ, Doxycycline) hiển thị dựa mức độ phát quang Conjugate Do đó, cần vào cường độ màu giếng thử xác định mẫu thủy sản có nhiễm (Enrofloxacin, Chloramphenicol, Sulfonamide, Nitrofuran AOZ, Doxycycline) hay không nhiễm với nồng độ Tất quy trình từ đưa mẫu vào phân tích đến cho kết 3090 phút, nhanh nhiều so với phương pháp khác 2.4.1 Kiểm Enrofloxacin phương pháp ELISA Hóa chất cách pha chế: - Microtiter plate: (12 x well) 96 giếng - Enrofloxacin Antibody #1: (1 x 14ml) - 100X HRP Conjugate: (1 x 0.15ml) * 99 Enrofloxacin Antibody #1 : 100X HRP Conjugate - 10X Sample Extraction Buffer: (1 x 25ml) dạng cô đặc trước dùng phải pha với nước cất - 1ml 10X Sample Extraction Buffer : nước cất - TMB Substrate : (1 x 12ml) sẵn để dùng - Stop Buffer: (1 x 14ml) sẵn để dùng - 20X Wash Solution: (1 x 28ml) đệm pha lỗng/ rửa dạng đặc phải pha lỗng với nước cất • 1ml 20X Wash Solution : 19 nước cất Cách tiến hành: 10 Cân 1g mẫu cho vào 4ml methanol 70% (CH3OH) Vortex phút Ly tâm 15 phút 7000 vịng Hút 500 µl dịch bên cho 500 µl 1X sample Extration (tỉ lệ 1:9) vào ống eppendorf đánh dấu số thứ tự mẫu Lên giếng 50µl chuẩn cho vào giếng Hút 50 µl mẫu cho vào giếng Cho 100µl Conjugate cho vào tất giếng Ủ tối 30 phút nhiệt độ phòng (20 – 250C) Rửa lần dung dịch đệm WE Cho 100 µl One shot substrate Ủ 20 phút Cho 100 µl stop solution Đọc kết Thuyết minh qui trình: Lấy lượng mẫu thích hợp khoảng 200g đem nghiền ( đồng mẫu ) máy nghiền mẫu ( mẫu lấy phần thịt tôm, loại bỏ đầu, vỏ, tôm…) Ý nghĩa việc lấy mẫu: Là khâu phân tích kiểm nghiệm, có vai trò quan trọng, lấy mẫu nguyên tắc, đại diện cho lô hàng cần kiểm tra, làm cho kết phân tích kết luận lơ hàng xác ngược lại 11 Cân 1g mẫu đồng cho vào ống ly tâm 15ml, hút 4ml Methanol 70%, trộn mẫu máy vortex phút Ly tâm 7000 vòng/phút, ly tâm 15 phút nhiệt độ phịng 250C Hút 500µl lớp dịch bên 500 µl 1X Sample Extration vào ống eppendorf danhd dấu số thứ tự mẫu Phân tích: Mẫu sau pha lỗng cho lên giếng phân tích, tất hóa chất giếng có Kit phải để nhiệt độ phịng khoảng trước sử dụng Ghi nhãn hóa chất, thứ tự chuẩn, mẫu tránh nhầm lẫn Lấy đủ giếng cần thiết để lên giếng Cho 50µl dung dịch chuẩn (1, 2, 3, 4, 6) Enrofloxacin có nồng độ … vào giếng tương ứng, nên cho chuẩn vào giếng nồng độ thấp đến nồng độ cao Hút 50µl dung dịch mẫu phân tích cho vào giếng Hút 100µl dung dịch Conjugate cho vào tất giếng, trộn cách xoay nhẹ đĩa giếng vài giây Ủ 30 phút bóng tối nhiệt độ phịng (20-250C) Rửa giếng lần với 250µl dung dịch đệm rửa pha loãng ( Wash Buffer) Sau lần rửa cuối làm khô cách lật ngược đĩa giếng lên giấy thấm đập nhẹ, thực bước lập tức, tránh để giếng khô bước thực Thêm 100µl dung dịch One Shot Substrate vào tất giếng, lắt nhẹ vài giây Ủ 20 phút bóng tối, nhiệt độ phịng Thêm 100µl Stop solution vào lắt nhẹ vài giây Đọc kết 2.4.2 Kiểm Doxycyline phương pháp ELISA Hóa chất cách pha chế - Oxytetracyline Microtiter plate: (12 x well) 96 giếng chai Oxytetracyline Standards (6 x 1.2ml): sẵn để dùng chai Oxytetracyline Antibody (1 x 6ml): sẵn để dùng - chai 5X Oxytet Extraction Buffer (2 x 25ml): đậm đặc lần 12 * Pha thể tích 5X Oxytet Extraction Buffer : thể tích nước cất - chai 10X Tet Sample Diluent (1 x 28ml): đậm đặc 10 lần * Pha thể tích 10X Tet Sample Diluent : thể tích nước cất - chai 20X Wash Solution (1 x 28ml): pha khoảng 20 lần * Pha thể tích 100 20X Wash Solution : 19 thể tích nước cất - chai Stop Buffer (1 x 20ml): sẵn để dùng chai TMB Substrate (1 x 12ml): sẵn để dùng Cách tiến hành: Cân 1g mẫu cho vào 3ml 1X Oxy tet Extration Vortex 10 phút , ly tâm 10 phút 5000 vòng Hút 60µl mẫu 820µl 1X Sample Diluent, 20 µl Balance vào ống eppendorf đánh dấu số thứ tự mẫu, vortex phút Hút 75 µl chất chuẩn cho vào giếng, 75µl mẫu vào giếng giếng cịn lại Cho 100 µl Antibody vào giếng mẫu chuẩn Ủ 30 phút, Nhiệt độ phòng (20 – 250C) Rửa lần, 250 µl 1X Wash Solution Cho 100 µl TMB Substrate Ủ tối 20 phút Cho 100 µl Stop Buffer Đọc kết Thuyết minh qui trình: Cân 1g mẫu đồng cho vào ống ly tâm 15ml, trộn 3ml 1X OXYTET Extraction Buffer máy vortex phút 13 Ly tâm 5000 vòng/phút, ly tâm 10 phút nhiệt độ phịng Hút 60µl dịch bên cho vào eppendorf cho vào 820µl 1X Sample Diluen 20 µl Balance trộn máy vortex phút Phân tích: Mẫu sau pha lỗng cho lên giếng phân tích Lấy đủ giếng cần lên giếng Cho 75µl dung dịch chuẩn ( 1, 2, 3, 4, 6) Doxycycline có nồng độ … vào giếng tương ứng, nên cho chuẩn vào giếng nồng độ thấp đến nồng độ cao Cho 75µl dung dịch mẫu phân tích vào giếng Thêm 100µl Antibody vào tất giếng, trộn cách xoay nhẹ đĩa giếng vài giây Ủ bóng tối 30 phút nhiệt độ phòng (20-250C) Rửa giếng lần với 250µl dung dịch đệm rửa pha lỗng ( Wash Buffer) Sau lần rửa cuối làm khô cách lật ngược đĩa giếng lên giấy thấm đập nhẹ, thực bước lập tức, tránh để giếng khơ bước thực Trình tự rửa: Đổ dung dịch rửa khỏi giếng, cho 250µl dung dịch rửa vào giếng đổ ngoài, lập lại lần, giũ giọt dung dịch cịn sót lại giếng cách úp ngược đĩa microplate lên giấy thấm Thêm 100µl chất tạo màu TMB Substrate vào lắt nhẹ vài giây Ủ bóng tối 20 phút nhiệt độ phịng Cho 100µl Stop Buffer vào giếng, lắt nhẹ vài giây Đọc kết 2.4.3.Kiểm Chloramphenicol phương pháp Elisa Hóa chất cách pha chế - Microtiter plate (12 x well) 96 giếng - Chloramphenicol chuẩn (6 x 1.8ml): gồm lọ, lọ chứa 1.8ml dung dịch CAP chuẩn, đánh dấu theo số thứ tự từ đến 6: ng/ml, 0.05 ng/ml, 0.15 ng/ml, 0.5 ng/ml, 1.5 ng/ml, 4.5 ng/ml, sẵn để dùng - 20X Wash Solution (28ml): đệm pha lỗng/ rửa dạng đặc, phải pha loãng với nước cất * 1ml 20X Wash Solution : 19 nước cất 14 - CAP-HRP Conjugate (8ml): sẵn để dùng -10X Sample Extraction Buffer (25ml): dạng cô đặc, phải pha trước dùng với nước cất * 1ml 10X Sample Extraction Buffer : nước cất - TMB Substrate (12ml): sẵn để dùng - Stop Buffer (14ml): sẵn để dùng Tiến hành: Cân 3g mẫu cho vào 6ml ethyl axetat Vortex 10 phút , ly tâm 15 phút 2000 vịng Hút 4000µl lớp dịch bên cho vào ống ly tâm 15ml, thổi khí 600C 15 phút Hút 2000µl n- hexan 500 µl Tissue ( tỉ lệ 1:400) vào ống vừa thổi khí Vortex phút, ly tâm 15 phút 2000 vòng Hút 100 µl lớp dịch vào eppendorf (bỏ giọt đầu giọt cuối) Thêm 25 µl chất chuẩn cho vào giếng, 25µl mẫu vào giếng cịn lại Cho 100 µl Conjugate vào tất giếng chuẩn mẫu Ủ 30 phút, nhiệt độ phòng Rửa lần, 250 µl 1X Wash Solution Cho 125 µl One shot substrate, ủ 20 ± phút Cho 100 µl Stop solution Đọc kết Thuyết minh qui trình: 15 Cân 3g mẫu đồng cho vào ống ly tâm 15ml, trộn 6ml ethyl axetat máy vortex phút Ly tâm 10 phút 6000 vòng nhiệt độ phịng Hút 4000µl lớp dịch bên cho vào ống ly tâm 15ml đem thổi khí đến khơ 600C 15 phút Hút 2000µl n- hexan 500 µl Tissue vào ống vừa thổi khơ vortex phút Ly tâm 15 phút 2000 vịng Hút 100µl dịch cho vao eppendorf Phân tích: Mẫu sau pha lỗng cho lên giếng phân tích Lấy đủ giếng cần lên giếng Hút 25µl dung dịch chuẩn (1, 2, 3, 4, 6) Chloramphenicol có nồng độ … vào giếng tương ứng, nên cho chuẩn vào giếng nồng độ thấp đến nồng độ cao Hút 25µl dung dịch mẫu phân tích vào giếng Sau cho 100µl Conjugate vào tất giếng, trộn cách xoay nhẹ đĩa giếng vài giây Ủ bóng tối 30 phút nhiệt độ phòng (20-250C) Rửa giếng lần với 250µl dung dịch vào giếng đổ ngồi, giũ giọt dung dịch cịn sót lại giếng cách úp ngược đĩa microplate lên giấy thấm Sau lần rửa cuối làm khô cách lật ngược đĩa giếng lên giấy thấm đập nhẹ, tránh để giếng khô bước thực Thêm 125µl One shot substrate vào tất giếng, lắt nhẹ vài giây Ủ bóng tối 20 ± phút nhiệt độ phịng Cho 100µl Stop Buffer vào giếng, lắt nhẹ vài giây Đọc kết 2.4.4 Kiểm Sulfonamide phương pháp Elisa Hóa chất cách pha chế - Microtiter plate (12 x well) 96 giếng - Sulfonamide Antibody #1 (1 x 12ml): sẵn để dùng - 100X HRP Conjugate Antibody #2 (1 x 0.25ml) 16 - Sulfonamide Antibody #2 (1 x 20ml) * 99 Sulfonamide Antibody #2 : 100X HRP Conjugate Antibody #2 - 10X Sulfonamide Extraction Buffer (1 x 25ml): dạng cô đặc trước dùng phải pha với nước cất * 1ml 10X Sulfonamide Extraction Buffer : nước cất - TMB Substrate (1 x 12ml): sẵn để dùng - Stop Buffer (1 x 14ml): sẵn để dùng - 20X Wash Solution (1 x 28ml): đệm pha lỗng/ rửa dạng đặc phải pha lỗng với nước cất * 1ml 20X Wash Solution : 19 nước cất Tiến hành Cân 2g mẫu cho vào 5ml ethyl axetat Vortex phút, ly tâm phút 5000 vịng Hút 3000µl lớp dịch bên cho vào ống ly tâm 15ml, thổi khí 600C 15 phút Hút 600µl n- hexan 600 µl 1X sample (tỉ lệ 1:9) Vortex phút , ly tâm phút 5000 vịng Hút 100 µl lớp dịch bên cho vào eppendorf Cho 50 µl chất chuẩn cho vào giếng, 50µl mẫu vào giếng cịn lại Cho 100 µl Antibody # vào giếng mẫu chuẩn Ủ 30 phút, nhiệt độ phòng Rửa lần, 250 µl 1X Wash Solution Cho 125 µl Antibody # 2, ủ 30 phút, nhiệt độ phòng Rửa lần, 250 µl 1X Wash Solution Cho 100 µl TMB substrate, ủ 30 phút, nhiệt độ phịng 17 Cho 100 µl Stop solution Đọc kết Thuyết minh qui trình: Cân 2g mẫu đồng cho vào ống ly tâm 15ml, trộn 5ml ethyl axetat máy vortex phút Ly tâm 10 phút 6000 vòng nhiệt độ phòng Hút 3000µl lớp dịch bên cho vào ống ly tâm 15ml đem thổi khí đến khơ 600C 15 phút Hút 600µl n- hexan 600 µl 1X sample vào ống vừa thổi khô vortex phút Ly tâm phút 5000 vòng Hút 100 µl lớp dịch bên cho vào eppendorf Phân tích: Mẫu sau pha lỗng cho lên giếng phân tích Lấy đủ giếng cần lên giếng Hút 50µl dung dịch chuẩn Sulfonamide có nồng độ … vào giếng tương ứng, nên cho chuẩn vào giếng nồng độ thấp đến nồng độ cao Hút 50µl dung dịch mẫu phân tích vào giếng Sau cho 100µl Atibody # vào tất giếng, trộn cách xoay nhẹ đĩa giếng vài giây Ủ bóng tối 30 phút nhiệt độ phòng (20-250C) Rửa giếng lần với 250µl dung dịch vào giếng đổ ngồi, giũ giọt dung dịch cịn sót lại giếng cách úp ngược đĩa microplate lên giấy thấm Sau lần rửa cuối làm khô cách lật ngược đĩa giếng lên giấy thấm đập nhẹ, tránh để giếng khô bước thực Sau cho 150µl Atibody # vào tất giếng, trộn cách xoay nhẹ đĩa giếng vài giây Ủ bóng tối 30 phút nhiệt độ phòng (20-250C) Rửa giếng lần với 250µl dung dịch vào giếng đổ ngồi, giũ giọt dung dịch cịn sót lại giếng cách úp ngược đĩa microplate lên 18 giấy thấm Sau lần rửa cuối làm khô cách lật ngược đĩa giếng lên giấy thấm đập nhẹ, tránh để giếng khô bước thực Thêm 100µl TMB substrate vào tất giếng, lắt nhẹ vài giây Ủ bóng tối 15 phút nhiệt độ phịng Cho 100µl Stop Buffer vào giếng, lắt nhẹ vài giây Đọc kết 2.4.5 Kiểm Nitrofuran AOZ phương pháp ELISA Hóa chất cách pha chế - Microtiter plate (12 x well) 96 giếng - Dung dịch K2HPO4 1M: Hòa tan 11.4g K2HPO4.3H2O 500ml nước - Dung dịch HCl 1M: Pha loãng 8.6ml HCl đậm đặc : 91.4ml nước cất - Dung dịch NaOH 1M: Hòa tan 4g NaOH 100ml nước cất - Reconstitution Buffer: Pha loãng 2X Reconstitution Buffer với nước cất theo tỷ lệ 1:1 Bảo quản 4oC vịng tháng - Wash buffer: Pha lỗng 20X Concentrated Wash Buffer với nước cất, theo tỷ lệ 1:19 Tiến hành Cân 1g mẫu cho vào 4ml nước cất, 500 µl HCL, 75 µl 4- Nitrobenzendehyde 19 Cân 1g mẫu cho vào 4ml nước cất, 500 µl HCL, 75 µl 4- Nitrobenzendehyde Vortex phút, ủ 500C 500 µl K2HPO4 , 400 µl NaOH, 6ml ethyl axetat Vortex phút, ly tâm 10 phút 6000 vòng Hút 3ml dịch bên trên, thổi khí 600C 10 phút 1ml n- hexan, 1ml đệm pha loãng (WA), vortex phút Ly tâm 10 phút 6000 vòng Hút 100 µl lớp dịch bên cho vào eppendorf Hút 50µl chuẩn cho vào 5giếng, 50 µl mẫu cho vào giếng Cho 75µl Conjugate cho vào giếng Ủ tối 30 phút nhiệt độ phòng (20 – 250C) Rửa lần đệm pha loãng (WA) Cho 125 µl One shot substrate, ủ 20 ± phút Cho 100 µl stop solution Đọc kết 20 Phân tích: Mẫu sau pha lỗng cho lên giếng phân tích Lấy đủ giếng cần len giếng Cho 50µl dung dịch chuẩn (1, 2, 3, 4, 6) AOZ có nồng độ … vào giếng tương ứng, nên cho chuẩn vào giếng nồng độ thấp đến nồng độ cao Hút 50µl dung dịch mẫu phân tích cho vào giếng Hút 75µl dung dịch Conjugate cho vào tất giếng, trộn cách xoay nhẹ đĩa giếng vài giây Ủ 30 phút bóng tối nhiệt độ phịng (20-250C) Rửa giếng lần với 250µl dung dịch đệm rửa pha loãng ( Wash Buffer) Sau lần rửa cuối làm khô cách lật ngược đĩa giếng lên giấy thấm đập nhẹ, thực bước lập tức, tránh để giếng khơ bước thực Thêm 125µl dung dịch One Shot Substrate vào tất giếng, lắt nhẹ vài giây Ủ 20 ±2 phút bóng tối, nhiệt độ phịng Thêm 100µl Stop solution vào lắt nhẹ vài giây Đọc kết Lưu ý Không để hoá chất tiếp xúc với ánh nắng Thao tác phải cẩn thận, mang găng tay, áo blouse Dụng cụ sau dùng phải làm vệ sinh sẽ, rửa nước Javen 5% Không dùng Kit hạn, Kit từ hộp dùng cho hộp khác. Điều chỉnh pipette xác lượng cần sử dụng Khi cho Conjugate vào giếng phải cho thật nhanh để thời gian Conjugate giếng là gần giếng, không kết sai lệch 21 22 ... HACCP, IFS, HALA Doanh số 30 triệu USD/năm II KHÁNG SINH: 2.1.Khái niệm kháng sinh Kháng sinh còn gọi là Trụ sinh là chất chiết xuất từ vi sinh vật, nấm, tổng hợp bán tổng hợp, có khả tiêu diệt vi... phịng 250C Hút 500µl lớp dịch bên 500 µl 1X Sample Extration vào ống eppendorf danhd dấu số thứ tự mẫu Phân tích: Mẫu sau pha lỗng cho lên giếng phân tích, tất hóa chất giếng có Kit phải để... đập nhẹ, thực bước lập tức, tránh để giếng khơ bước thực Trình tự rửa: Đổ dung dịch rửa khỏi giếng, cho 250µl dung dịch rửa vào giếng đổ ngoài, lập lại lần, giũ giọt dung dịch cịn sót lại giếng