Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương Nghiên cứu chiết tách và các đặc tính của urase từ hạt đậu tương
Trang 1
PHUNG THI HONG NHAM
NGHIEN CUU CHIET TACH VA CAC DAC TINH CUA UREASE
TU HAT DAU TUONG
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2011
Trang 2PHÙNG THỊ HỎNG NHÂM NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ CÁC ĐẶC TÍNH CỦA UREASE TỪ HẠT ĐẬU TƯƠNG KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS.Nguyễn Văn Rư Nơi thực hiện:
1 Bộ môn Hóa sinh
2 Bộ môn Công nghiệp Dược
HÀ NỘI - 2011
Trang 3Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến thầy giáo, TS
Nguyễn Văn Rư, người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong quá
trình thực hiện luận văn này, cho em những lời khuyên quí báu để em có thể hoàn thành tôt nhât khóa luận của mình
Em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè, những người đã luôn bên cạnh, khuyến khích động viên em trong quá trình nghiên cứu học tập
Em xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên trong
bộ môn Hóa sinh đã luôn giúp đỡ, dìu dắt, tạo điều kiện để em có thể hoàn thành luận
văn này
Xin được cảm ơn các thầy cô và anh chị trong bộ môn Công nghiệp Dược đã giúp đỡ em trong quả trình hoàn thành khóa luận của mình
Mặc dù có nhiêu cô găng nhưng luận văn của em không tránh khỏi nhiêu sai sot, mong được sự thông cảm và góp ý từ thầy cô và các bạn
Tháng 5-2011 Sinh viên
Trang 41.1 TOng quan VỀ IIF.€ - - 2 - 2E ® SE SE E£EE+EEEEE£EEEEESEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErkrrererrke 10
1.1.1 Khái niệm, cầu tạo, HguỖn 8ỐC - - + 5à TH HH rưệu 10
1.1.2 Tinh L lrïnố 10
1.1.3 Vai trò của ure trong công-nông nghiệp, sinh lý cơ thể và trong y học 10
JJNJNN 0, 006 16 ee 13
1.2 Tổng quan VỀ IIF€8§€ 2-2 ©6952 SE£Et+xỆEEEEEEEEEEEEEEEEEEkEExrkerkrrerrerkrrrrkrrerree 13 1.2.1 Khải niệm, nguỖn Ốc HF€đ1S6 - + - Sàn EEEETTE1E1111 11111111 ckrrrei 13 1.2.2 Đặc điễm về cầu trúc CA WF€(S6 - - + 5à kEEEEEEEEEEEEEkHE gi trrệu 14 1.2.3 Tính ChẤt CA HF€đS€ .- S2 SS+ ThS TT TH 1711711111111 rk 17
1.2.4 Đặc tính xúc túc CỦ( HFC(IS€ Ỏ Ặ QG 17
1.2.5 Ứng dung ctia urease trong y-durde c.ccccccccccccssvessesssvssessssessssssesssssssssssessssssseesees 18 1.3 Phương pháp chiét tach va tinh ché enZyM u c.ccccsccscscssesescsssscssessesseessesesseseens 19 1.3.1 Đặc điểm của enzym thực vật vận dụng trong chiết tách và tỉnh chế 19
1.3.2 ChiẾt tdch €ILXJHH - 5 ST TH TH HH TH TH HH1 rệt 19
1.3.3 Một số phương pháp tỉnh CHẾ €H4HN SG St TT grrrkerrei 20
CHƯƠNG 2: ĐÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị - ¿- ¿2 2113 SE EE E111 1111011113111 23
2.1.1 NgHyÊH lÏỆM TH nu Ti h 23
" (71771 1ã nố.ố ố 23
2.1.3 Dụng CỤ HHÁÿ HHỨC- Q H h 23
Dụng cụ máy móc tại bộ môn Hóa sinh và bộ môn công nghiệp Dược trường đại học
Dược Hà Nội, bao gồm: cọ 00 7770 077e 23
2.2 Nội dung nghiền cứỨu - - s11 1.1 gọn 24
2.3 Phương pháp nghiên CỨU - - - c2 S339 9 0 ng ng ng ng và 24
2.3.1 Phương pháp Gi€t ẤÍCH Ặ Gì HH HT ve 24
Trang 52.3.6 Phương pháp xác định một số đặc điểm của chế phẩm wrease 32
Chương 3: THỰC NGHIỆM, KÉT QUÁ VÀ BÀN LUẬN
K5) 2 1 34
3.1.1 Phương pháp thu dịch chiết hạt đậu tW0ng - các cecscererkererkrrrrerree 34 3.1.2 Phương pháp diêm tích tạo chế phẩm thô AAl 5-5555 cccesrerkersrerree 34 3.1.3 Phương pháp đông khô A1 tạo sản phẩm đông khô A2 - 34 3.1.4 Phương pháp tỉnh chế tiếp chế phẩm A2 tạo được chế phẩm BT 35 3.1.5 Phương pháp đông khô B1 tạo sản phẩm đông khô B2 36
3.1.6 Phuong phap xdc dinh hoqf Hộ HF€(S€ QQ Hn ngn nnrr, 37
3.1.7 Định lượng DFOf€ÏTI-LFC([S€ .Ỏ HH ni ng 38
3.2 IKẾT (uẩ - G- SE T219 9711101110191 HT cưng gu 39
3.2.1 Xây dựng đường chuẩn nông độ protein-mật độ quang -. 39 3.2.2 Xây dựng đường chuẩn nông độ ure-mật độ quang, o5ccccsccccee 40 3.2.3 Kết quả xác định hàm lượng protein và HđE của các chế phẩm 42 3.2.4 Xác định một số đặc điểm của chế phẩm wurease ( B2) cccsce+eeesrse 53 6N 0 na 54 3.3.1 VỀ chiết tách, tinh chế urease từ hạt đậu fØ0ïig: . 5-55 ccscccesrsreecee 54 3.3.2 Về lựa chọn phương pháp xác định hoạt độ của ureas€: c5: 55 3.3.3 Vé dic tinh cia ché phém urease tinh chế (B22) -5-sccsrsrerersrereeesree 55
3.4 Kết luận và đề Xuấtt - -¿- Sẻ SE EkS S1 T11 chư 56
E1 (CT1 nh hố 56
2 mm nẽố ố ố 56
Trang 6GMO (Genetically modified organism): sinh vật biến đối di truyền
SNCR (Selective Non Catalytic Reduction): sy khu khéng xtc tac chon loc SCR (Selective Catalytic Reduction): sự khử xúc tác chon loc
BUN (Blood Ure Nitrogen): Nitro ure mau DAM : Diacetyl monoxime
Trang 7Bảng 3.1 Hàm lượng protein và HđE của dịch chiết hạt đậu tương tươi
Bảng 3.2 Hàm lượng protein và HđE qua phan đoạn (NH¿)zSO¿ 25% bão hòa Bảng 3.3 Hàm lượng protein và HđE qua phan đoạn (NH¿)zSO¿ 55% bão hòa Bảng 3.4 Hàm lượng protein và HđE qua phân đoạn đông khô sau (NH¿);SO¿ 55%
bão hòa
Bảng 3.5 Hàm lượng protein và HđE sau phân đoạn lọc gel
Bảng 3.6.Hàm lượng protein và HđE qua phan đoạn đông khô sau lọc gel Bảng 3.7 Kết quả các giai đoạn tạo chế phẩm A1
Trang 8Hinh 1.1 Hinh 1.2 Hinh 1.3 Hinh 1.4 Hinh 1.5 Hinh 3.1 Hinh 3.2 Hinh 3.3 Hinh 3.4 Hinh 3.5 Hinh 3.6 Hinh 3.7 Hinh 3.8 Hinh 3.9
C4u tric ciia Ure Chu trinh Ure
Hình ảnh của cây đậu tương và hạt đậu tương Cấu trúc của urease
Câu trúc trung tâm hoạt động của urease Nguyên lý của sắc ký rây phân tử
Câu tạo của phân tử Sephadex Cột lọc gel
Đường chuẩn sự phụ thuộc mật độ quang vào nông độ protein Đường chuẩn sự phụ thuộc mật độ quang vào nông độ ure Các giai đoạn tạo chế phẩm A1
Trang 9vực khác nhau Trong y học, các enzym được nghiên cứu và tinh chế không chỉ để làm thuốc mà một số enzym còn có vai trò quan trọng trong các xét nghiệm chân đoán
Urease, enzym thuỷ phân ure, được ứng dụng trong các kit phân tích để xác định ure trong các mẫu bệnh phẩm va dung dịch đạm thủy phân vì có tính đặc hiệu rất cao
véi co chat ure Enzym nay co trong nhiều loại thực vật bậc cao như đậu, lúa
mạch, và nhiều loại vi khuẩn như Helicobacter Pylori, Proteus mirabilis Do có giá
trị trong các xét nghiệm định tính và định lượng ure trong mẫu thử, urease sớm được
các nhà khoa học quan tâm tìm hiểu và nghiên cứu cách chiết tách, tinh chế Tại Việt
Nam, với nguồn nguyên liệu đậu tương phong phi, van dé tinh sach urease tir hat dau tương đã được một số nhà khoa học quan tâm đến nhưng chưa có công trình nào đưa ra được quy trình tinh sạch hiệu quả có thể ứng dụng trong sản xuất chế phẩm urease Nước ta hiện nay vẫn phải nhập chế phẩm urease và kit urease từ nước ngoài với giá
thành rất cao Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu chiết tách và các đặc
tính của urease từ hạt đậu tương” nhằm xây dựng quy trình tỉnh sạch urease hat đậu tương hiệu quả nhất, với những mục tiêu cụ thể như sau:
1 Nghiên cứu chiết tách, tỉnh chế urease hạt đậu tương tạo ra các chế phẩm có độ tỉnh sạch khác nhau
Trang 10Chuong I: TONG QUAN
1.1 Tổng quan vé ure
1.1.1 Khái niệm, cấu tạo, nguồn gốc
Ure (hay carbamide) là một hợp chất hữu cơ có công thức hóa học là (NH;);CO
Ưre có vai trò quan trọng trong sự trao đôi chất của các hợp chất chứa nitro ở động vật
và là chất chứa nitro chính trong nước tiêu của động vật có vú
Ure được tìm thấy trong nước tiểu của động vật có vú và động vật lưỡng cư, cũng như một sơ lồi cá Ngoài ra ure còn có trong đât, nước 1 C H»N~ ~NH> Hình 1.1 Cấu trúc của Ure 1.1.2 Tính chất của ure
+ Công thức phân tử: CHaN;O + Khối lượng phân tử: 60,06 g.mol 1
+ Điểm nóng chảy: 133-135°C
+ Độ hòa tan trong nước: 51,8g/100ml (20°C), 71,7g/100ml (60°C), 95,0g/100ml (120°C)
+ Ure la chat ran, khong mau, khéng mui, dé tan trong nước và không độc Khi hòa tan trong nước cho pH trung tính
1.1.3 Vai trò của ure trong công-nông nghiệp, sinh lý co thé va trong y hoc
Trang 11Ure được sử dụng làm phân bón cung cấp Nitơ cho cây trồng, ure có hàm lượng nitơ cao nhất trong các phân đạm rắn được sử dụng phố biến trong nông nghiệp Nhiều vi khuẩn trong đất có các enzym urease xúc tác chuyến ure thành hai phân tử amoniac và một phân tử carbon đioxide, do đó ure trong phân bón rất nhanh chóng được chuyên đổi sang dạng amoni trong đất Sau đó amoni được chuyển thành dang nitrat mà cây trồng có thê hấp thu được
b Tronơ công nghiệp
Ure là một nguyên liệu để sản xuất các hợp chất hoá học quan trong, chang han như:
- Các sản phẩm nhựa, đặc biệt là nhựa ure-formaldehyde
- Các chất kết dính, chẳng hạn nhu formaldehyde, ure hoặc ure melamine-
formaldehyde được sử dụng trong ván ép - Xyanat kali , một nguyên liệu công nghiệp - Chất nỗ ure nitrat
- Ure được sử dung trongphảin tng SNCRvaSCR để giảmNO,gây Ơơ
nhiễm trong khí thải từ quá trình đốt cháy từ động cơ diesel, nhiên liệu kép và khí đốt
động cơ
c Trong sinh lý cơ thể
Ure tham gia nhiều chu trình quan trọng trong cơ thể, đặc biệt là bài tiết Nitro Ure được tông hợp trong cơ thể của nhiều sinh vật như một phần của chu trình urea, hoặc từ quá trình oxy hóa của các acid amin hoặc từ amoniac Ure được sản xuất
trong gan và vận chuyển trong máu (2,5-7,5 mmol/lít) và được bài tiết qua thận như một thành phần của nước tiểu Ngoài ra, một lượng nhỏ được bài tiết cùng với nafr1
Trang 12The Urea Cycle
NH4 + CO2 +2ATP NAGS Cystoine + ATP
oa tr N-acotylglutamato —_—_ Glutamate OXIDANT Cc (necessary co-factors GCLC/GCLM INJURY Carbamyl Phosphate gamma-glutamyicysteine Citrulline otc as Glutathione Nitrosothiols Ornithine Citruiline Dinitrated Metabolites UREA NO Argininosuccinate Ornithine CY le L E NO Guanylate Cyclaso Urea Arginine NADPH BH4 Care Hinh 1.2 Chu trinh Ure d Trong y hoc
Ure được sử dụng trong các sản phẩm về da để thúc đây bù nước cho da Chế phẩm ure 40% cũng có thể được sử dụng đề làm sạch móng tay Thuốc này cũng được sử dụng để trợ giúp loại bỏ ráy tai
Một số loại túi lạnh nhanh (hoặc nước đá gói) có chứa ure tinh thế và nước Các
túi nước bên trong gây ra một phản ứng thu nhiệt và được sử dụng để làm giảm sưng
Tương tự như nước muối, tiêm ure được sử dụng để thực hiện phá thai
Các test ure máu (BUN) dùng để định lượng nitơ trong máu đến từ ure Nó được sử dụng như là một dấu hiệu đánh giá chức năng thận
Ure c6 carbon-14 hay carbon-13 được sử dụng trong các test hơi thở ure, được sử dụng dé phát hiện sự hiện diện cua vi khuan Helicobacter pylori (H pylori) trong da
dày và tá tràng của con người, để chân đoán viêm loét dạ dày tá tràng Xét nghiệm này có tác dụng phát hiện enzym urease, sản xuất bởi HH pylori, gây ra phản ứng thủy phân
Trang 13Urease test dùng để xác định sự có mặt của H.pylori: H.pylori có khả năng tiết ra urease thủy phân ure, phương pháp này dựa trên nguyên tắc là đưa mảnh sinh thiết vào
một lượng nhỏ dung dịch ure có chỉ thị màu Hoạt tính urease của vi khuẩn (nếu có) sẽ
nhanh chóng phân hủy ure thành amoniac làm môi trường trở thành kiềm hóa và chỉ thị màu sẽ thay đồi
1.1.4 Phương pháp định lượng
- Phan img Berthelot (chuyén ure thành amoniac bằng urease), sau đó định lượng CO; hay NH; tao thành
- Phuong phap do mau diacetyl monoxime: ure phan ứng với Diacetyl monoxime (DAM) với sự có mặt của chất oxy hóa (FeCl;) và ở môi trường acid nóng sẽ cho sản phẩm ngưng tụ màu hồng Màu của phản ứng được tăng cường nếu cho
Thiosemicarbazide (TSC).[1]
1.2 Téng quan vé urease
1.2.1 Khái niệm, nguôn gốc urease
Các loại enzym được khoa học biết đến cho đến nay được chia làm sáu nhóm, được kí hiệu theo thứ tự từ EC 1 đến EC 6, trong đó urease thuộc nhóm EC 3.5, nhóm
các enzym tác động lên liên kết Carbon-Nitrogen (bao gồm cả liên kết peptide), phân nhóm EC 3.5.1 là phân nhóm enzym thủy phân liên kết C-N của amid mạch thăng
Khái niệm : Urease (EC 3.5.1.5) là enzym xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết carbon-mtrogen trong nhóm amid cua ure thanh carbon dioxide va amoniac
urease
(NH,).CO + H,O — CO, + 2NH;
Urease còn gọi là ure amidohydrolase có bản chất là một nickel protein Phản ứng thuỷ phân ure có xúc tác của urease không cần cung cấp năng lượng từ bên ngoài [14]
Enzym urease đã sớm được các nhà khoa học nghiên cứu và tính chế Năm 1926, James Sumner lân đâu tiên đã kết tính và chứng minh được urease có bản chât là một
Trang 14Nguồn gốc : Urease được tìm thấy trong nhiều loại vi khuẩn (Helicobacter Pylori),
nắm men và một số thực vật bậc cao như đậu (đậu tương, đậu đen ), lúa mạch
Trong các nguồn nguyên liệu sản xuất urease kế trên, đáng chú ý nhất là hạt đậu tương, nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm và có hàm lượng urease cao Cây đậu
tương (còn gọi là đỗ tương, đậu nành, Glycine max L Merr, Fabaceae) 1a mot loai cay
trồng phô biến, phân bố ở rất nhiều nơi và đã có nhiều giống được cải biến di truyền
(GMO) nhằm tăng năng suất
Trong hạt đậu tương có các thành phần hoá học phong phú như:
Protein (40%), lipid (12-25%), glucid (10-15%); cac muỗi khoáng, vitamin, enzym, sắp, nhựa, cellulose và các acid amin co ban [2]
1.3a) 1.3b)
Hình 1.3 Hình ảnh của cây đậu tương và hạt đậu tương (Glycine max L Merr, Fabaceae)
1.3.a) Cay dau tuong 1.3.b) Hạt đậu tuong gia
Trang 15Trọng lượng phân tử của urease là 440kDa, chúng có thể polymer hóa để tạo thành đại phân tử polymer với 6 tiểu đơn vị có trọng lượng khoảng 3.000.000 Dalton
[8]
Urease bao gôm hai nửa liên kết với nhau bằng liên kết không đồng hóa trị mà
khi tách ra enzym vẫn giữ được hoạt tính Mỗi nửa phân tử urease được cấu tạo bởi ba
monome giống nhau, mỗi monome có trọng lượng phân tử khoảng 83 kDa, bao gồm 3
tiểu phân ơ = 60,3 kDa, B = 11,7 kDa, y = 11,1 kDa (Hinh 1.4) [7]
Khi tồn tai nhu mot dimer, enzym có hai trung tâm hoạt động Mỗi trung tâm hoạt
động có tính đặc hiệu cao và chỉ liên kết với ure hoặc hydroxyure Mỗi trung tâm hoạt
động của urease đều chứa một nguyên tử nickel, được sắp xếp theo hình kim tự tháp vuông liên kết với năm phối tử khác Mỗi nguyên tử nickel liên kết với hai nguyên tử nitơ của imidazol, một carboxylate và một phân tử nước Hai tiểu đơn vị này liên kết với nhau bởi một phân tử carbamate Các enzym urease có tính đối xứng, mặc dù có những vị trí không đối xứng mà chỉ tồn tại như là một thành phần sinh học của enzym (Hinh 1.5) [8]
Urease có thể được xác định bằng cách sử dụng phố học hồng ngoại vì nó hấp thụ
Trang 16Hinh 1.4 Cau tric ctia urease
` Carbam ate
H20
Hinh1.5 Cau tric trung tam hoạt động của urease
Trang 171.2.3 Tinh chat cia urease - Trọng lượng phân tur: 440 kDa [4]
- D6 6n dinh: 6n dinh trong EDTA 10°M hoac 50% glycerol trong vai thang & 4°C
- Kha bén với nhiệt (< 80°C) - Bền vững trong khoảng pH rộng - Điểm đắng điện: pI = 4,9 [10] - Hang s6 lang S20,w: 18,3 [8] - Ey = 2,84x10° litremol!.cm™ [12] - Mat d6 quang: Eog9 (1%, 1cm) = 18,4 — 18,7 [12] 1.2.4 Đặc tính xúc tác của urease
se Khả năng xúc tác phản ứng thủy phân ure
Urease hoạt động trong khoảng pH rộng từ 4-9, pH tối ưu là 7,4, nhiệt độ tối ưu là
60°C, cơ chất đặc hiệu là ure và hydroxyure [17]
Hằng số Michaelis: Km = 5,3 mM trong đệm phosphate 1/15M, pH 7 [4]
Tốc độ phan tng Vmax = 6,77 mM/phut/10UI Summer (Don vi hoat lực UI Summer được định nghĩa là lượng enzym có khả năng thuỷ phân ure tạo thành lmg
NH; trong 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn) [4]
© Ảnh hưởng của chất ức chế đối với hoạt động xúc tác của enzym
Urease bị ức chế bởi các kim loại nặng như các phức hợp chỉ (như Pb & Pb”) Trình tự của các ion kim loại nặng đối với ảnh hưởng đến hoạt tính urease là: Hg” >
Cu” > Cd”” > Co” > Pb* > Sr’* Các nghiên cứu cho thấy rằng urease bị ức chế bởi các kim loại nặng có thể được hoạt hóa lại nhờ EDTA
Ngoai ra, hydroxamic acid, Phosphoramide, Boric acid, boronic acid da duoc chứng minh là các chất ức chế cạnh tranh của urease
Trang 18Hoạt tính của urease tăng lên theo sự tăng nhiệt độ, tuy nhiên khi vượt quá 80°C, urease sẽ bị biến đôi và mat dan hoat tinh O 84°C, urease bi mat hoat tinh sau 15’ [9]
1.2.5 Ứng dụng của urease trong y-dược
Kừ xác định nhanh ure:
Kit thử này hoạt động trên nguyên lý: giẫy thử có gắn urease khi ngâm vào dung dịch cần thử có chứa ure, urease sẽ thủy phân ure thành amoniac và carbonic Amoniac sinh ra làm thay đối pH môi trường làm đôi màu chất chỉ thị gắn trên giấy - dung dịch chứa càng nhiều ure thì màu càng đậm hơn
Ngoài ra, có thể xác định hàm lượng ure bằng cách dùng một dụng cụ cảm biến ure Cảm biến này được chế tạo trên cơ sở máy đo pH được gắn cô định enzym urease Khi tiến hành thử, nếu dung dịch thử có chứa ure thì sẽ phản ứng với enzym làm tăng pH Dựa vào khoảng pH biến đổi có thể biết được có ure hay không và lượng ure là bao nhiêu Cách sử dụng rất đơn giản, chỉ việc nhúng điện cực của dụng cụ cảm biến vào dung dịch, để khoảng 10 phút và dựa vào đường chuẩn để biết được néng dé ure
Enzym có định:
Ngày nay người ta đã tìm ra hơn 120 bệnh về rối loạn chuyên hóa ở người, đa số
các bệnh này là do thiếu một loại enzym đặc biệt nào đó
Một enzym có chức năng tương tự không có nguồn gốc từ cơ thể người không
thể đưa một cách trực tiếp vào cơ thể bởi vì nó sẽ gây ra một đáp ứng miễn nhiễm có
hại cho cơ thê Để giải quyết vấn đề này người ta cô lập enzym trong các vi hạt, sợi hay gel Khi đó, enzym có thê không gây ra đáp ứng miễn nhiễm có hại nào trong khi cơ chất của nó có kích thước nhỏ có thể đi xuyên qua gel, các lỗ trên sợi hay màng của các
vi hat
Cũng theo nguyên tắc này người ta có ý tưởng làm thận nhân tạo Trong thiết bị
nhân tạo này, urease và hạt resin hấp thụ hay than chì được kết thành nang với nhau
Trang 19urease
URE > URE > HCO; + NHạ”
khuếch tán vào vỉ nang hấp thụ lên serin hay than chì 1.3 Phương pháp chiết tách và tinh chế enzym
1.3.1 Đặc điểm của enzym thực vật vận dụng trong chiết tách và tỉnh chế + Lượng enzym nhỏ hơn rất nhiều so với các thành phần khác trong tế bào
+ Enzym không bên, đễ bị biến tính khi bị tác động của các yếu tố bên ngoài
+ Ngoài protein enzym còn có nhiều protein khác, gây khó khăn cho quá trình chiết
tách và tinh chế
Vì vậy trong chiết tách enzym từ tế bào thực vật cần lựa chọn phương pháp chiết tách phù hợp để thu được enzym mong muốn
1.3.2 Chiết tách enzym
° Nguyên tắc:
+ Lựa chọn vi tri giau enzym
+ Nguyên liệu trước khi chiết tách phải bảo quản và sơ chế + Phá vỡ tế bào (phương pháp cơ học, vật lý, hóa học)
+ Loại tạp và chiết tách bằng các dung dịch đệm, dùng các muối, dung môi hữu cơ dé kết tủa enzym từ đó tách enzym ra khỏi tế bào thực vật
© Phương pháp chiết tách:
+ Phương pháp gây biến tính chọn lọc: Dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH
+ Phương pháp kết tủa phân đoạn: Dựa trên khả năng kết tủa của các enzym ở các nồng
độ muối khác nhau (các muối v6 co NaCl, (NH¿);SŠO¿ K;SO¿ ) hoặc dùng một số
dung môi hữu cơ (alcohol, aceton )
Trang 20Sử dụng phối hợp các biện pháp trong chiết tách enzym cơ bản có thể loại được
các tạp cơ học, mảnh vụn tế bảo, pectid, lipid, phospholipid, protein khác ra khỏi dịch
chiết trong giai đoạn này [14]
1.3.3 Một số phương pháp tỉnh chế enzym
Enzym thường chiếm một tỷ lệ rất nhỏ trong tế bào hoặc các cơ quan và có lẫn nhiều tạp chất, do đó việc tinh chế là rất cần thiết Trong những trường hợp nhất định cần phải tỉnh chế enzym để sử dụng cho những mục đích riêng như papain tỉnh khiết để tách mô tế bào; tinh chế chymotrypsin để điều chế thuốc tiêm (chống viêm, giảm phù
nề), chymopapain tỉnh khiết để điều chế thuốc tiêm (chữa thoát vị đĩa đệm cột sống),
hoặc dùng trong nghiên cứu
Urease có bản chất là protein do đó các phương pháp tinh chế enzym cũng là các phương pháp tỉnh chế protein Nguyên lý tỉnh chế dựa vào tính chất lý hóa của enzym: e Tỉnh chế enzym dựa vào tính chất hòa tan kết túa
Bằng cách thay đôi mật độ điện tích, pH Protein thường được tủa ở điểm dang
điện (pI) đặc trưng của mỗi enzym hoặc kết hợp dùng muối, dùng dung môi hữu cơ để kết tủa, tỉnh chế enzym Thay đổi sự hydrat hóa cũng có thể dẫn tới tủa enzym do làm thay đổi độ tan của protein, thường dùng các muối vô cơ hay còn gọi là điêm tích.[6] e Tỉnh chế enzym dựa vào kích thước phân tử protein (phương pháp sắc ký rây phân tử) Nguyên tắc:
Sử dụng một nguyên liệu có tính chất hạt, đưa các hạt gel vào cột Chuyển dung
dịch protein cần phân tích qua cột gel, sau một thời gian nhất định, mở van ở đáy cột, ta thu nhận các phân đoạn khác nhau Quá trình này gọi là quá trình rây phân tử
Trang 21là tiện lợi, nhanh, không đòi hỏi lượng lớn và cé thé tinh ché enzym truc tiép tir ché
phẩm thô [6]
* Phương pháp siêu ly tam
Dùng để xác định trọng lượng phân tử và tính đồng nhất của chế phẩm hơn là
tỉnh chế Nguyên tắc là đựa vào tỷ trọng, kích thước và hình dạng của phân tử [6]
* Phương pháp điện di
Thường dùng để xác định độ tinh khiết của protein hơn là để tinh chế Dựa vào
sự khác nhau của mật độ điện, sự phân bố điện tích, hình dạng và kích thước của các
phân tử nên các protein khác nhau có độ di chuyên khác nhau Phương pháp này cũng dùng để tách một protein ra khỏi protein khác [6]
© Phương pháp sắc kí ai luc
Tinh chế enzym dựa vào sự tạo phức hợp hấp phụ lập thể Đây là phương pháp đặc hiệu đề phân biệt các enzym Mỗi enzym tạo phức hợp hấp phụ với chất có tính đặc hiệu lập thể, phù hợp với trung tâm hoạt động Chất giá không tan gắn với nhóm đặc hiệu của enzym Khi di chuyên qua chất giá, vì tương tác của các nhóm đặc hiệu đó nên enzym di chuyển chậm hơn các protein khác Sau đó enzym được rửa giải khỏi cột bằng cách thay đôi nông độ ion, pH hoặc hằng số điện môi của dung môi rửa giải [6]
© Phương pháp sắc kí trao đổi ion
Tinh chế enzym dựa vào trao đổi ion Sử đụng các chất có khả năng trao đổi ion
(cation hoặc anion) làm chất giá Cần lựa chọn chất giá ưa nước có điện tích ngược với
điện tích trên protein Rửa giải bằng cách thay đối hàm lượng muối hoặc pH của dung dịch Ưu điểm của phương pháp này là có thể dùng phâm tách riêng enzym trong một hỗn hợp protein Có thể tái sắc kí để tăng độ tinh khiết cho enzym [6]
Trang 23CHUONG 2: DOI TUQNG VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU
2.1 Nguyén vat liéu, thiét bi
2.1.1 Nguyên liệu
Hạt đậu tương được lẫy từ quả già của cây đậu tương Giycine max L Merr,
Fabaceae được thu hải sau 50-80 ngày sau khi ra hoa tại Phú Thọ
2.1.2 Hóa chất thuốc thử
Các hóa chất, thuốc thử đạt tiêu chuẩn tỉnh khiết có tại bộ môn Hóa sinh trường Đại học Dược Hà Nội, bao gom:
+ Dung dich dém phosphat pH=7 + Dung dịch đệm phosphat pH=7,6
+ Dung dịch FeClạ gốc + Dung dich clurua feric
+ Dung địch thuốc thử DAM — TSC
+ Dung dich dém phosphat pH=7, 1/15M + Thuốc thử Gornal
+ Dung dich ure 1% + Dung dich ure 0,1%
+ (NH¿);SO¿, HNO+, Ethanol tuyệt đối, nước cất, aceton, Sephadex G-75
2.1.3 Dung cu may moc:
Dung cụ máy móc tại bộ môn Hóa sinh và bộ môn công nghiệp Dược trường đại
học Dược Hà Nội, bao gồm:
1.Máy đo quang phố hấp thụ U-1800 2.Máy ly tâm lạnh Heraus 15R 3.Máy ly tâm thường
4.Máy điều nhiệt
5.May dong khô Christ alpha 1-LD
Trang 247.Dụng cụ thủy tinh khô và sạch 2.2 Nội dung nghiên cứu
v' Tách riêng urease từ hỗn hợp protein trong hạt đậu nành băng phương
pháp diêm tích với (NH¿);SO¿ Y Tinh ché tiép urease
wx Định lượng protein — urease và xác định hoạt độ urease dựa trên nguyên
tắc xác định lượng ure còn dư sau phản ứng thủy phân bằng phương pháp do mau diacetyl monoxime
vx Nghiên cứu một số đặc tính của urease
2.3 Phương pháp nghiên cứu
Trong nghiên cứu này để loại các tạp proten và các phân tử có trọng lượng phân tử cao khác ra khỏi urease trong dịch chiết hạt đậu tương chúng tôi đã dùng phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính là (NH¿)zSO¿ ở các nồng độ khác nhau
Chúng tôi tiến hành trên các mẫu dịch chiết hạt đậu tương để tạo chế phẩm thô:
Diêm tích dùng (NH¿);SO¿ ở 2 phân đoạn 25% và 55% tạo chế phẩm A1, đông khô chế
phẩm AI tạo chế phẩm A2 Sau đó dùng các kỹ thuật tinh chế để tỉnh chế A2 tạo chế phẩm BI, đông khô chế phẩm BI tạo được chế phẩm B2
Trong các giai đoạn phân tách sử dụng phương pháp Gornal để xác định hàm lượng protein và dựa trên nguyên tắc xác định lượng ure còn dư sau phản ứng thủy phân bằng phương pháp đo mau diacetyl monoxime để xác định hoạt độ của enzym urease
2.3.1 Phuong phap diém tich
* Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa protein enzym ở một nồng độ muối (tính theo phần trăm nông độ bão hòa)
Trang 25độ nhỏ muối (NH,4)2SO, sé lam cho protein tan vao dung dich nhiéu hon Khi nồng
độ (NH¿);SO¿ tăng lên tới một giá trị nào đó thì tương tác protein — protein trội hơn và các phân tử protein bắt đầu kết tủa Giá trị nồng độ muối (NH¿);SOx gây nên kết tủa protein tùy thuộc vào từng loại protein và người ta lợi đụng sự khác nhau này để
tách chọn lọc các protein ra khỏi nhau
Một tính chất khác của protein là tính tan của các protein sẽ thấp nhất trong dung dịch tại điểm đẳng điện của chúng, người ta lợi dụng tính chất này đề tiễn hành kết tủa chúng tại giá trị điểm đắng điện của chúng Giá trị điểm đẳng điện có được bằng cách thay đổi pH của dung dịch chứa protein
2.3.2 Phương pháp đông khô
*Quá trình đông khô gồm 3 giai đoạn: đông lạnh, sấy sơ cấp, sấy thứ cấp
+ Giai đoạn đông lạnh: Trong giai đoạn này, sản phẩm được đóng băng hoàn toàn ở
nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ eutecti (đối với đạng kết tinh) hay nhiệt độ chuyền đổi thủy
tinh (đối với đạng vô định hình) của hệ Đầu tiên, các tinh thể nước đá được hình thành
và tách khỏi dung dịch Phần dung dịch chưa được đông lạnh có nồng độ được chất, tá dược tăng dân, băng điểm của nó giảm xuống và tiễn đến nhiệt độ eutecti (hay nhiệt độ
chuyển đổi thủy tinh) Cuối cùng các thành phần khác trong hệ kết tinh hoặc chuyển sang dạng vô định hình Kết thúc quá trình, hệ tồn tại nhiều dạng khác nhau: tỉnh thê,
vô định hình hoặc cả tinh thể và vô định hình
+ Giai đoạn sấy sơ cấp: Sản phẩm sau khi được đông lạnh thích hợp được chuyên sang buông đông khô dưới điều kiện áp suất nhỏ hơn áp suất hơi nước đá (thường từ 0,05 — 0,20 mmHg hay 0,0665 — 0,226 mbar), nhiệt độ condensor (nhiệt độ buồng
ngưng) khoảng -50°C, nhiệt độ của giá từ -30 đến 10°C Trong điều kiện này, nước sẽ
thăng hoa trực tiếp từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi không qua giai đoạn lỏng trung gian Quá trình nhận biết được bởi bề dày băng giảm trong khi bề dày của sản phẩm đông khô tăng lên Ở giai đoạn này, nhiệt độ của sản phẩm phải thấp hơn nhiệt độ phá
Trang 26+ Giai đoạn sấy thứ cấp: Nhiệt tiếp tục được cung cấp cho sản phẩm để loại bỏ hồn tồn nước khơng được đông lạnh và nước hấp phụ trên bề mặt tinh thể Giai đoạn này
thường kéo dài, đến khi chế phẩm đạt độ âm tương đối khoảng 1% thì kết thúc
2.3.3 Phương pháp tỉnh chế bằng kỹ thuật sắc ký rây phân tử trên Sephadex G-75 * Nguyên tắc:
Sử dụng một nguyên liệu có tính chất hạt, đưa các hạt gel vào cột Chuyển dung
dịch protein cần phân tích qua cột gel, sau một thời gian nhất định, mở van ở đáy cột, ta thu nhận các phân đoạn khác nhau Quả trình này gọi là quá trình ray phân tử
Sephadex là một dextran oligosaccharide được cấu tạo từ nhiều đơn vị a — ølucose nỗi với nhau bằng liên kết 1,2 ; 1,4; 1,6 ; 1,3 o-plucoside Do có nhiều liên kết
tạo thành mạng lưới, sephadex có khả năng hút nước và trương nở, khi ngâm các hạt gel trong nước vài gid sẽ tạo thành hai pha:
- Pha mang: gdm các mạng lưới liên kết trong hạt gel
- _ Pha loãng: pha năm giữa các hạt gel, phủ đầy bằng dung môi hoặc nước
Khi cho một hỗn hợp chất chảy qua cột chứa các hạt gel Sephadex đã trương nở
thì xảy ra quá trình tách các chất có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau Các
phân tử có kích thước nhỏ sẽ lọt vào trong lỗ gel trong khi các phân tử có kích thước lớn đi chuyên bên ngoài hạt gel và bị rửa giải sớm hơn các phân tử nhỏ Phương pháp
nảy có ưu điểm là tiện lợi, nhanh, không đòi hỏi lượng lớn và có thé tinh ché enzym
Trang 27O O O â) e đ Qf â Oe @O ® Ỷ ® (A) (B) (C) Hình 3.1 Nguyên lý của sắc ký rây phân tử of L2» ° C—o—cH AY wg } Va R ma ~ H OH N— H pee 0 / H | 0H 0 ery | we tro OH KOH HY HH Ht OH dọc HO 0 H OH KOH HY pm "HOH py ro R "4 I OH `" —o—œ “OH - ƒ H OH i At Pant H OH HO 4 R Vr prod Nett ar oH Hn po Gần ‘ TH ee YOH HS hn a ie ON Noo ` H OH 0H Hư HC—0H ws ONY 0 L XS H 0H OH
Hình 3.2 Cấu tạo của phân tir Sephadex
* Xác định hoạt tính riêng của dung dịch enzym trước khi lọc gel theo công thức:
Ho ạt tír
HTR,=
Trang 28* Tổng hàm lượng protein sau lọc gel được xác định theo công thức:
>) C =CI1.Y1+C2.V2+ + Cn.Vn
Trong đó:
>C: Tông hàm lượng protein sau lọc gel (mg/ml dung địch enzym) C;>C;: hoạt tính của mỗi peak (1>n) (mg/ml)
Vị¡>V, : thé tich cua méi peak (1>n) (ml)
Thu ¥ g éivgmpna dda ncu adungdi ch
c tym sau khil oc gel
T enk@nt qual traéoxa d nh gel theo cơngth Uc: T Ổngÿmaádltfil oc HTR, = gel * Hiệu suất về hoạt tính của enzym thu được qua lọc gel: HTR, %Hw= Tư, 2100 t Trong do:
% Hi: Hiéu suat vé hoat tinh cua enzym thu được qua lọc gel (%)
Trang 29* Hiệu suất thu nhận protein sau khi loc gel:
2 Ms
%Hụy= “ —x100
Trong đó:
%H,;: Hiệu suất thu nhận protein sau khi lọc gel:
>Ms : Tông khối lượng protein của dung dịch enzym sau khi loc gel (mg/ml dung
dịch enzym)
M, : Tổng khối lượng protein của đung địch enzym trước khi qua lọc gel (mg) 2.3.4 Phương pháp xác định hoạt độ urease
Nguyên tắc: (Dựa trên nguyên tắc định lượng ure còn dư theo phương pháp đo màu điacetyl monoxime) Dưới tắc dụng của urease, ure bị thủy phân giải phóng CO; và NH3 Phan ure con lại tham gia phản ứng với Diacetyl monoxime (DAM) với sự có mặt của chất oxy hóa (FeClạ) và ở môi trường acid nóng sẽ cho sản phẩm ngưng tụ màu hồng Màu của phản ứng được tăng cường nếu cho thêm Thiosemicarbazide
(TSC) Do quang dung dịch này ở 520 nm, cuvet lcm Dựa vào biêu đồ mẫu tính ra lượng ure bị thủy phân, từ đó xác định được hoạt tinh cua urease
Trang 30NOH H3C —————>y TT + H“ TỶ Diacetyl Hydroxylamin DAM FeCl; 9 Ỷ TSC HạN ẰNH; ure Ỳ CH3 | NH —C— 4, š | ` c=0 o=c ~ Diacetyl ure (hồng)
e Lượng ure trong mỗi ống được tính theo đồ thị đường chuẩn nồng do ure — mat do
quang được xây dựng
Trang 31+ Katal (K) va nanokatal (nK) + Katal là lượng enzym thủy phân một mol co chất trong 1 giây ở điều kiện xác định + Công thức: P.B 10 HdE = —— ( nanokaftal ) M.V¢.T Trong do:
P: lượng ure (mg) bi thủy phân
B: độ pha loãng của dung dịch chế phẩm enzym M =60.06: trọng lượng phân tử gam cua ure T: thời gian thủy phân (giây)
Vụ: số lượng enzym đem thử (ml)
- Hoạt độ protein tính theo % (hoạt độ protein tương đối) được tính theo công thức:
Deo chat + Dehing - Dạy
Hd (%) = x 100%
Deo chat
Trong do :
Deo cndt : Mat dd quang cua ống cơ chất
Denimg : Mat dO quang cua ống chứng
Dine : mat dé quang cua ống thử
2.3.5 Kỹ thuật định lượng protein bằng phương pháp Biuret
Trang 32*Nguyên tắc: Khi cho tác dụng với thuốc thủ Gornal, protein (có liên kết peptide) tạo thành phức màu tím hồng Đo quang phố hấp thụ, so với biêu đồ mẫu để định lượng protein
*Mục đích của phương pháp:
Xây dựng biểu đồ mẫu dé định lượng protein bằng phản ứng Biuret Dùng dung dịch protein đã biết nồng độ (casein 1%) làm dung dịch mẫu Chứng minh mối quan hệ
tuyến tính đồng biến của nồng độ protein và mật độ quang, làm cơ sở cho định lượng
nông độ protein của các dung dịch thử *Tinh két quả: + Cac hé s6 protein K; 1a ty 16 gitra néng d6 protein (mg/ml) va dé hap thu quang: K; = Nồng độ protein/Mật độ quang + Tính hệ số trung bình Ktb: Ky = Kyi + Công thức tính nồng độ protein theo D (mật độ quang): C protein =KuxD 2.3.6 Phương pháp xác định một số đặc điểm của chế phẩm urease *Tính chất cảm quan:
Lẫy một lượng nhỏ chế phẩm B2 quan sát trên bề mặt trắng ở điều kiện ánh sáng
thường, nhiệt độ thường để nhận xét về đặc điểm màu sắc, hình dạng *ĐỘ tan:
Độ tan của chế phẩm xác định bằng cách xác định khá năng hoà tan của B2 trong nước theo DĐVN II
* Hoạt độ:
Xác định theo nguyên tắc định lượng ure còn dư sau phản ứng thủy phân bằng phuong phap do mau diacetyl monoxime
Trang 33Độ âm của sản phẩm được xác định băng phương pháp cân, sấy mẫu sản phẩm tới khối lượng không đổi ở 60°C Độ âm của sản phẩm được tính theo công thức: Mo — My X(%) = , My Trong do: X: Độ âm (%)
Trang 34Chương 3: THỰC NGHIỆM, KÉT QUÁ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Thực nghiệm
3.1.1 Phương pháp thu dịch chiết hạt đậu tương
- Hat sau khi thu hoạch của cây đậu tương (Giycine max L Merr) được phơi khô,
loại bỏ hạt xấu, ngâm 4 h, xay mịn, bảo quản lạnh (nhiệt độ 0 - 4° €) - Giai đoạn xử lý, tách loại tạp thô:
Dịch chiết hạt đậu tương được hòa tan trong đệm phosphat pH = 7,6 theo tỷ lệ 30 g địch nhựa trong 200 ml đung dịch đệm, khuấy đều trong 3 giờ để enzym hòa tan hoàn toàn, để ở 4C qua đêm Lọc qua bông 2 lần, loại bỏ những chất không tan, thu phần dịch lỏng
- Dịch thu được đem ly tâm 16000v trong 10” thu lay dich, dich ly tam dem loc
qua giấy lọc 2 lan dé loai lipid
- Dịch lọc thu được dùng cho các quá trình chiết tách và tỉnh chế tiếp theo
3.1.2 Phương pháp diêm tích tạo chế phẩm thô 11
Trong nghiên cứu này để loại các protein tạp và các phân tử có trọng lượng phân tử cao khác ra khỏi urease trong dịch chiết hạt đậu tương, chúng tôi đã dùng phương pháp kết tủa phân đoạn (diêm tích) bằng muối trung tính, cụ thể là chúng tôi đã dùng
muỗi (NH¿);SO¿
* Sử dụng phương pháp diêm tích dùng muối (NH¿);ŠSO¿ ở các nông độ 25%, 55% bão hòa tạo chế phẩm A]:
Phần địch lọc thu được đem đun ở 60°C trong 1h rôi làm lạnh đến 30°C, sau do thém (NH,)2SO, đến 25 % bão hòa, pH = 7, để 1 h, sau đó đem ly tâm lạnh trong
10’ thu lấy dịch ly tâm Dịch ly tâm tiếp tục thêm (NH„);¿SO¿ đến 55 % bão hòa, pH
Trang 35Enzym urease thu được sau khi điêm tích bằng (NH¿);SO;¿ (chế phẩm A1) đem
thấm tích với nước cất 2 lần để loại muối vô cơ Dịch thẩm tích đem đặt vào buồng
chân không đề đông lạnh Điều kiện này cho phép nước chuyến trạng thái từ rắn sang thể hơi mà không phải qua thể lỏng trung gian Đông khô trong khoảng 24 h đến khi
chế phẩm đạt độ âm tương đối khoảng 1% thì kết thúc
3.1.4 Phương pháp tỉnh chế tiếp chế phẩm A2 tạo được chế phẩm BI
Urease trong chế phẩm đông khô A2 được tinh chế tiếp bằng các kỹ thuật: Hòa tan enzym thu được (chế phẩm A2) trong đệm phosphat pH=7, 1/15M, chuyên dung dich enzym lên cột gel Sephadex G - 75 và rửa giải với đệm thích hợp để thu được phân đoạn chứa urease (chế phẩm BI), sau đó đem chế phẩm BI đông khô thu được chế phẩm urease đã tinh chế
Chuẩn bị:
* Nguyên liệu: dung dịch enzym cần tinh sạch
* Hoa chat: dung dich HNO; 50%, aceton, gel Sephadex G-75, nước cất
* Dụng cụ: - cột gel (1 x 50 cm) rửa sạch bang HNO; rồi rửa lại bằng nước cất nhiều lần, tráng lại bằng aceton rồi sấy khô
- ống nghiệm được rửa sạch, tráng lại bằng nước cất, sây khô Tiến hành:
+ Cân 1,5 ø gel, ngâm trong dung dịch nước cất 30% Ethanol trong 24 giờ để gel trương nở hoàn toàn Dùng lượng nước sao cho khi gel lắng xuống lượng nước thừa có thê tích gấp 10 lần thể tích gel
+ Cho dung dịch đệm chảy qua cột
+ Cho một lớp bông thủy tỉnh vào đáy cột
+ Đề cột thăng, đỗ dung môi vào 1/3 cột, tránh bọt
+ Đồ gel vào cột bằng đũa thủy tỉnh, tránh bọt
Khi gel lắng xuống vài cm, mở đáy cột cho dung dịch đệm từ từ chảy ra Tiếp tục
Trang 36- lớp gel đã lắng ngày càng cao dân - lớp gel đang lắng
- lớp gel trong suốt ở trên cùng
Nếu trong quá trình đỗ mà lớp gel lắng nhanh hơn thì phải hút bỏ dung môi phía trên Đồ đến khi đạt chiều cao cần thiết (25 cm)
+ Đặt lên gel một miếng giấy lọc và một ít bông thủy tinh + Cho dung dịch đệm chảy qua trong 3-4 h để ôn định cột es : gi ayloc | : bong th uy tinl Gel sephadex \í + Pha dung dịch mẫu thử protein với tỷ lệ 0,1g/ml Hình 3.3 Cột lọc gel + Hút bỏ phần dung môi trên cột gel, mở khóa cho chảy tiếp đến khi mực nước đến sát lớp gel
+ Cho 1 ml dung dich enzym cần tách vào, để cho ngắm hết
+ Tiến hành rửa giải bằng dung dịch đệm phosphate pH = 7, 1⁄15 M với tốc độ 2 phút/ml Thu các phân đoạn 2 ml một vào các ông nghiệm để xác định nồng độ protein và hoạt tính của enzym trong từng phân đoạn
Trang 37Dung dịch urease thu được sau khi rửa giải trên cột sắc ký lọc gel Sephadex G - 75 đem đặt vào buông chân không để đông lạnh Sau đó tiến hành đông khô tương tự như với chế phẩm AI
3.1.6 Phương pháp xác định hoạt độ urease
Tiến hành: Pha lỗng enzym đến nơng độ thích hợp bằng dung dịch đệm pH 7,0 Sử dụng cơ chất là ure 0,1%.Cho vào 3 ống nghiệm như sau: , Ong co chat | Ong thir | Ong Enzym Hóa chat (ml) (ml) (ml) Ure 0,1% 2 2 0 Dém phosphat pH 7 0,1 0 2 Dung dich Enzym 0 0,1 0,1 Mật độ quang D1 D2 D3 Nong d6 Ure con lai (mg/ml) PI P2 P3
Đề 1 giờ tủ âm 60°C Sau đó cho vào mỗi ống 3ml clorua feric và 3 ml TT DAM -
TSC Dun s6i cách thủy 10 phút, làm nguội, đem đo quang ở 520nm, cuvet lcm
Dựa trên biểu đồ mẫu tính ra lượng ure bị thủy phân: P=PI + P3 —- P2
Trong đó:
P1: lượng ure trong ống cơ chất P2: lượng ure trong ống thử P3: lượng ure trong ông Enzym
* Đồ thị đường chuẩn nông độ ure —- mật độ quang được xây dựng như sau:
Trang 38quang ở bước sóng 520nm, cuvet lcm và thiết lập đồ thị sự phụ thuộc mật độ quang vào nông độ ure Nông độ | DAM- Clorua Mật độ Ure 0,1% | Hệ đệm ure TSC feric quang D STT (ml ) (ml) (mg/ml ) (ml) (ml ) (520 nm ) 1 0 1,0 0 3 3 2 0,2 0,8 0,2 3 3 3 0,4 0,6 0,4 3 3 4 0,6 0,4 0,6 3 3 5 0,8 0,2 0,8 3 3 6 1,0 0 1,0 3 3 3.1.7 Dinh lugng protein-urease *Tién hanh: Thuc hién phan tng: Dung dich thu: 1 ml, Thuốc thử Gornal: 5 ml
Lắc đều, để yên 30 phút, đo quang ở 550 nm, cuvet 1 cm Kết quả thu được đựa vâo
biểu đồ mẫu đã xác định hàm lượng protein
* Xây dựng đường chuẩn nông độ protein-mật độ quang
Tiến hành: Dùng dung dịch casein 1% là protein mẫu để pha chính xác các dung địch protein có nông độ từ 0 đến 10 mg/ml và thực hiện phản ứng theo bảng Lắc đều, để các ống 30 phút ở nhiệt độ phòng sau đó đem đo mật độ quang ở bước sóng 550nm, cuvet
Trang 39Casein Nong d6 | Thuốc thử Hệ đệm Mật độ quang D STT 1% protein Gornal (ml ) (550 nm ) (ml) (mg/ml ) (ml) 1 0 1,0 0 5 2 0,2 0,8 2 5 3 0,4 0,6 4 5 4 0,6 0,4 6 5 5 0,8 0,2 8 5 6 1,0 0 10 5 3.2 Két qua
3.2.1 Xây dựng đường chuẩn nông độ protein-mật độ quang
Tiến hành: Dùng dung dịch casein 1% là protein mẫu để pha chính xác các dung dịch protein có nồng độ từ 0 đến 10 mg/ml và thực hiện phản ứng theo bảng Lắc đều, để các ống 30 phút ở nhiệt độ phòng sau đó đem đo mật độ quang ở bước sóng 550nm,
Trang 40Đường chuẩn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ protein 0.2 0.18 0.16 0.14 0.12 quang D 0.1 oO: 0.08 0.06 0.04 Mat d 0.02 0 2 4 6 8 10 12 Nong độ protein C (mg/ml)
Hình 3.4 Đường chuẩn sự phụ thuộc mật độ quang vào nông độ protein 3.2.2 Xây dựng đường chuẩn nông độ ure-mật độ quang
Tiến hành: Dùng dung dịch ure 0,1% là dung dịch mẫu để pha chính xác các dung dịch ure có nồng độ từ 0 đến 1,0 mg/ml và thực hiện phán ứng theo bảng Lắc đều, đun sôi cách thủy các ống trong 10 phút sau đó làm nguội rồi đem đo mật độ quang ở bước