5. Một số chất sử dụng trong môi trường chọn lọc để nuôi cấy vi sinh vật
3.6. Khảo sát khả năng nhận gen kháng kháng sinh của các chủng Bacillus tiềm
tiềm năng
Việc đánh giá khả năng nhận gen kháng kháng sinh của chủng Bacillus
được nghiên cứu bằng cách nuôi chung với chủng E. coliEc457 là chủng kháng kháng sinh có gen kháng cefotaxime nằm ở plasmid. Sau khi nuôi chung, dịch nuôi cấy được chang đếm trên một số môi trường đặc hiệu bao gồm các môi trường: chỉ
cho E.coliEc457 phát triển (M3), chỉ cho chủng Bacillus phát triển (M2), môi trường ức chế sự phát triển của E. coli Ec457 và Bacillus (M4).
Bảng 3. 9: Môi trường chọn lọc cho thí nghiệm nhận gen kháng kháng sinh của chủng Bacillus sp.
Môi trường Thành phần Mục đích sử dụng
M2 MHA có bổ sung LiCl
10g/l Cho Bacillusphát triển.
M3 MHA có bổ sung
Cefotaxime 16µg/ml
Cho E.coli Ec457 phát
triển.
M4
MHA có bổ sung LiCl
10g/l và Cefotaxime 16µg/ml
Bacillus và E.coli Ec457
đều không phát triển.
* Khảo sát khả năng nhận gen kháng kháng sinh của chủng nghiên cứu.
Khả năng nhận gen kháng kháng sinh của chủng Bacillusđược khảo sát dựa trên thử nghiệm nuôi cấy tiếp hợp giữa chủng Bacillus và E.coliEc457, được thực hiện như mục 2.2.9. Sau khi nuôi tiếp hợp chủng Bacillus và E. coli Ec457, nghiên
cứu đã tiến hành xác định mật độ của vi khuẩn trên môi trường chọn lọc
M2,M3,M4. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3. 10: Hiệu quả liên hợp giữa chủng Bacillusvà chủng E.coliEc457 thời điểm t=4h. Chủng Mật độ tế bào của chủng Bacillus (CFU/ml) Mật độ tế bào của chủng tiếp hợp (CFU/ml) Hiệu quả kết hợp
Commented [22]: phần này c nghĩ là nên để mô hình bố trí thí nghiệm ở mục phương pháp trước, vì hiện ny viết rất khó hiểu. mục 3 chỉ trìn bày kết quả thôi
P4QN11 (5,22 ± 3,82) x107 (1,38 ± 0,25) x104 2,63 x10-4
CHL16 (2,23 ± 0,72) x108 0 0
Từ kết quả thu được cho thấy, CHL16 không có khả năng nhận gen kháng
kháng sinh, mật độ chủng P4QN11 sau khi nuôi tiếp hợp cùng với chủng E.coli
Ec457 là (1,38 ± 0,25) x104 CFU/ml. Như vậy, có thể một lượng vi khuẩn P4QN11 có khả năng nhận gen kháng kháng sinh với tần số liên hợp là 2,63 x 104sau 4 giờ nuôi cấy tiếp hợp. Toomey và cộng sự đã khảo sát khả năng chuyển/ nhận của các vi khuẩn lactic bằng phương pháp giao phối bộ lọc trong ống nghiệm [68]. Theo
Toomey và cộng sự đã đánh giá tần số truyền gene giữa các cặp vi khuẩn là cao, nằm khoảng khoảng 1,8 x 105- 2,2 x 10-2. Trong nghiên cứu của Leungtongkam và cộng sự (2018) khi khảo sát khả năngchuyển gen kháng kháng sinh từ chủng A. baumannii kháng thuốc (XDR-AB và NDM-AB) đến các chủng Acinetobacter
spp. được phân lập từ các mẫu nước tại Thái Lan. Kết quả của các thí nghiệm liên hợp chứng minh rằng khả năng kháng ticarcillin và kanamycin có thể đã chuyển từ bốn chủng cho XDR-AB sang hai chủng A. baumanniiphân lập kháng natri azide, không có sự liên hợp giữa các chủng trên đĩa môi trường MHA có chứa
tetracycline. Tần số liên hợp đối với kháng ticarcillin nằm trong khoảng 1,0 x 10-4 đến 4,1 x 10-7, tần số liên hợp cho kháng kanamycin nằm trong khoảng 1,3 x 10-5 đến 5,7 x 10-7 [61]. Đối chiếu với kết quả nghiên cứucủa chúng tôi, cho thấy chủng P4QN11 có tần số nhận gen kháng kháng sinh tương đối cao.
a. b.
Hình 3. 13: Khuẩn lạc của chủng P4QN11 sau khi nuôi cấy tiếp hợp trên môi trường M2 (hình a) và trên môi trường môi trường M4 (hình b).
Chủng Bacillussau khi được nuôi cấy tiếp hợp với E.coliEc457 (chủng cho) được đem đi xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng môi trường lỏng (mục 2.2.6.b) để xác định tính nhạy cảm của chủng Bacillus
sau tiếp hợp với kháng sinh Cefotaxime. Nồng độ kháng sinh Cefotaxime thử nghiệm là 4, 8, 16, 32, 64 µg/ml. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.11.
Bảng 3. 11: Giá trị MIC của các chủng Bacillussau khi nuôi cấy tiếp hợp đối với Cefotaxime.
Chủng vi khuẩn Giá trị MIC (µg/ml)
CHL16 ≤4 ±0
P4QN11 16 ± 0
Từ kết quả bảng 3.11 cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của CHL16 không có sự thay đổi đối với Cefotaxime sau 4 giờ nuôi cấy tiếp hợp (≤4 µg/ml) do chủng này không có khả năng nhận gen kháng Cefotaxime từ chủng cho là
E.coliEc457. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chủng tiếp hợp giữa P4QN11
và E.coliEc457 tăng đáng kể (từ ≤4 µg/ml đến 16 µg/ml). Do đó, chủng P4QN11 có thể coi là có khả năng kháng kháng sinh do có khả năng nhận gen kháng kháng sinh Cefotaxime với tần số trung bình là 2,63 x10-4.
CHƯƠNG III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
-Tuyển chọn được 52 chủng Bacilluscó khả năng chịu được môi trường axit.
-Các chủng Bacillusphân lập đều nhạy cảm với gentamycin, ciprofloxacin, kanamycin, streptomycin. Phần lớn các chủng này nhạy cảm với chloramphenicol
(97,0%), tetracycline (84,8%), amikacin (93,9%) và clindamycin (66,7%); kháng
với erythromycin (51,5%), ampicillin (90,9%), cefoxitin (75,8%), amoxicillin (72,7%) và rifampicin (84,8%).
-Năm chủng phân lập đãchọn gồm: P5QN4, CHL16, P4QN13, P4QN11,
CHL15 có tác dụng ức chế vi khuẩnS. aureus S21, S. aureus ATCC 25923, E.
aerogenes với đường kính vòng kháng khuẩn dao động từ 0-13,0mm Trong đó
chủng CHL16 có khả năng kháng S. aureusS21 tốt nhất và P4QN11 có khả năng
kháng S. aureus ATCC 25923 tốt nhất. Tất cả các chủng Bacilluskiểm tra đều không có khả năng kháng Salmonella Typhimurium, Proteus vulgaris, E.coli
Ec457 và P.aeruginosa.
-Chủng CHL16 không có khả năng nhận gen kháng kháng sinh và chủng
P4QN11 có khả năng nhận gen kháng kháng sinh từ E.coliEc457 sau 4 giờ nuôi cấy tiếp hợp với tần số tiếp hợp 2.63 x 10-4.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu phân tích sinh học phân tử đối với chủng P4QN11 và CHL16 để xác định rõ hơn sự có mặt/không có mặt của gen kháng kháng sinh
Cefotaxime trong tế bào.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Donaldson, R. M, "Normal bacterial populations of the intestine and their relation to intestinal function," New England Journal of Medicine, pp. 270(20), 1050-1056, 1964.
[2] Fefana asbl, "Probiotics in animal nutrition," https://healthdocbox.com/73247954-Nutrition/Probiotics-in-animal-
nutrition.html, 2005.
[3] Kingsley C. Anukam, MHPM và Gregor Reid, "Probiotics: 100 years (1907- 2007) after Elie Metchnikoff’s observation," Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology, p. 1 466 – 474, 2007.
[4] Đậu Ngọc Hào, "Sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi và sức khỏe cộng đồng," Khoa học kỹ thuật thú ý, pp. tập XXIII số 3-2016, 2016. [5] Patterson. J.A and Burkholder. K.M.,, "Application of prebiotics and
probiotics in poultry production," J. Animal Science, pp. 82, pp. 627-631., 2003.
[6] Department of Animal Health and Production, Faculty of Veterinary Medicine, University of Nigeria, Nsukka, Nigeria, "Probiotics in animal production: A review.," Journal of Veterinary Medicine and Animal Health.,
pp. Vol. 5(11), pp. 308-316,, 2013.
[7] Yirga, H., "The use of probiotics in animal nutrition.," Journal of Probiotics & Health, p. 03(02)., 2015.
[8] Yu, H., Braun, P., Yildirim, M. A., Lemmens, I., Venkatesan, K., Sahalie, J., … Vidal, M., "High-quality binary protein interaction map of the yeast interactome network," Science, pp. 322(5898), 104–110., 2008.
[9] Cho JH, Zhao PY, Kim IH, "Probiotics as a dietary additive for pigs,"
Journal of Animal and Veterinary Advances, pp. 10: 2127-2134., 2011. [10] Steiner, T, "Probiotics in poultry and pig nutrition: basics and benefits.,"
2009. [Online].
[11] Cebra., J. J., "Influences of microbiota on intestinal immune system development," American Journal of Clinical Nutrition, pp. 69, pp. 1046S- 1051S, 1999.
[12] Dugas. B., Mercenier. A., Lenoir – Wijnkoop. I., Arnaud. C., Dugas. N. and Postaire. E., "Immunity and prebiotics," Immunology Today, pp. 20, pp. 387- 390, 1999.
[13] Fuller.R., "Probiotics in man and animals," J Appl Bacteriol, pp. 66, pp. 65– 78, 1989.
[14] Phương Thị Hương, Vũ Văn Hạnh, "Lựa chọn điều kiện lên men cho sự sinh trưởng chủng Bacillus subtilisbsvn15 ứng dụng sản xuất chế phẩm probiotic trong chăn nuôi.," Tạp chí Công nghệ Sinh học, pp. 16(1): 167-172, 2017. [15] "Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of
human and veterinary importance," EFSA Journal, 2012.
[16] Elshaghabee FMF, Rokana N, Gulhane RD, Sharma C, Panwar H., "Bacillus
as potential probiotics: status, concerns, and future perspectives," Front Microbiol, p. 10;8:1490, 2017 Aug.
[17] Trịnh Thành Trung, Phan Lạc Dũng, Trần Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp, Đào Thị Lương, "Đặc điểm sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum sp 1901 phân lập tại
Rừng Quốc gia Hoàng Liên.," Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự
nhiên và Công nghệ,, pp. Tập 29, Số 3 (2013) 59-70, 2013.
[18] F. Cadoret, M.T. Alou, P. Afouda, I.S. Traore, L. Bréchard, C. Michelle, F. Di Pinto, C. Andrieu, J. Delerce, A. Levasseur, P.-E. Fournier, D. Raoult, "Noncontiguous finished genome sequences and description of Bacillus massiliglaciei, Bacillus mediterraneensis, Bacillus massilinigeriensis,
Bacillus phocaeensis and Bacillus tuaregi, five new species identified by culturomics," New Microbes New Infect, p. 19: 45–59, 2017 Sep.
[19] Sertac Argun Kıvanç, Murat Takım, Merih Kıvanç, and Gülay Güllülü,
"Bacillus Spp. isolated from the conjunctiva and their potential antimicrobial activity against other eye pathogens.," Afr Health Sci, p. 14(2): 364–371, 2014 Jun;.
[20] Miguel Gueimonde, Borja Sánchez, Clara G. de los Reyes-Gavilán, Abelardo Margolles., "Antibiotic resistance in probiotic bacteria," Front. Microbiol, p. 4, 2013.
[21] Mingmongkolchai, S., & Panbangred, W., "Bacillus probiotics: an alternative to antibiotics for livestock production," Journal of Applied Microbiology, pp. 124(6), 1334–1346, 2018.
[22] FAO, "Probiotics in animal nutrition – Production, impact and regulation," 2016.
[23] "Scientific opinion on the maintenance of the list of QPS biological agents intentionally added to food and feed (2013 update)," EFSA Journal, p. 11(11):3449, 2013.
[24] Nguyễn Văn Phúc, Phan Thị Phượng Trang, "Phân lập, định danh và xác định các đặc tính có lợi của chủng Bacillusspp. từ ao nuôi tôm ở tỉnh Bến
Tre.," Tạp chí khoa học DHSP TPHCM, vol. số 64, 2014.
[25] Lê Thị Hải Yến, Nguyễn Đức Hiền, "Khảo sát đặc tính probiotic các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập tại các tỉnh đồng bằng sông cửu long,"
Tạp chı́ Khoa hoc Trường Đai học Cần Thơ. Số chuyên đề: Nông nghiệp, pp. (2): 26-32, 2016.
[26] Barbosa, Teresa M., Serra, Cláudia R., La Ragione, Roberto M., Woodward, Martin J. và Henriques, Adriano O., "Screening for Bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract," Applied and Environmental Microbiology,, pp. 71(2), 968-978, 2005.
[27] Alexopoulos, C., Georgoulakis, I. E., Tzivara, A., Kyriakis, C. S., Govaris, A., & Kyriakis, S. C., "Field evaluation of the effect of a probiotic‐containing
Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis spores on the health status, performance, and carcass quality of grower and finisher pigs," Journal of Veterinary Medicine Series A, pp. 51(6), 306-312, 2004.
[28] Hong, H. A., Duc, L. H., & Cutting, S. M., "The use of bacterial spore formers as probiotics," FEMS Microbiology Reviews, pp. 29(4), 813–835, 2005.
[29] Zhu, K., Hölzel, C. S., Cui, Y., Mayer, R., Wang, Y., Dietrich, R., … Ding, S., "Probiotic Bacillus cereus strains, a potential risk for public health in China," Frontiers in Microbiology, p. 7, 2016.
[30] Joachim Frey. , "Antimicrobial resistance in Bacilli, transfer and detection.," Research field: Molecular biology..
[31] Monod, M., Denoya, C., and Dubnau, D., "Sequence and properties of pIM13, a macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance plasmid from
Bacillus subtilis," J. Bacteriol, pp. 167, 138–147, 1986.
[32] Ali Sevim, Elif Sevim., "Plasmid mediated antibiotic and heavy metal resistance in Bacillus strains isolated from soils in Rize, Turkey," Journal of Natural and Applied Science, pp. 19(2), 133-141, 2015.
[33] Noor Uddin, G. M., Larsen, M. H., Christensen, H., Aarestrup, F. M., Phu, T. M., & Dalsgaard, A., "Identification and antimicrobial resistance of bacteria isolated from probiotic products used in shrimp culture," PLOS ONE, p. 10(7), 2015.
[34] Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Thị Thu Hường, Trịnh Thị Thùy Linh,, "Khảo sát thành phần vi sinh và các đặc tính probiotic," Tạp chí Khoa học và Phát triển, pp. tập 12, số 1: 65-72, 2014.
[35] Agersø, Y., Bjerre, K., Brockmann, E., Johansen, E., Nielsen, B., Siezen, R., … Zeidan, A. A., "Putative antibiotic resistance genes present in extant
Bacillus licheniformis and Bacillus paralicheniformis strains are probably intrinsic and part of the ancient resistome.," PLOS ONE, p. 14(1), 2019. [36] C Reygaert, W., "An overview of the antimicrobial resistance mechanisms
of bacteria," AIMS Microbiology, pp. 4(3), 482–501, 2018.
[37] Roxana-Mădălina Stoica, Mișu Moscovici , Caterina Tomulescu, Angela
Cășărică, Narcisa Băbeanu, Ovidiu Popa, Hatice Ahu Kahraman,
"Antimicrobial compounds of the genus Bacillus: A review," Rom Biotechnol Lett, pp. 24(6): 1111-1119, 2019.
[38] Fuchs, S. W., Jaskolla, T. W., Bochmann, S., Kötter, P., Wichelhaus, T., Karas, M., … Entian, K.-D., "Entianin, a Novel Subtilin-Like Lantibiotic from Bacillus subtilis subsp.spizizeniiDSM 15029T with High Antimicrobial Activity," Applied and Enviromental Microbiology, pp. 77(5), 1698-1707, 2011.
[39] Nwagu, T. N., Ugwuodo, C. J., Onwosi, C. O., Inyima, O., Uchendu, O. C., & Akpuru, C. , "Evaluation of the probiotic attributes of Bacillus strains isolated from traditional fermented African locust bean seeds (Parkia biglobosa), “daddawa.”," Annals of Microbiology , p. 70(1), 2020.
[40] "Quyết định :Ban hành “kế hoạch hành động quốc gia về quản lý sử dụng kháng sinh và phòng chống kháng kháng sinh trong sản xuất chăn nuôi và
nuôi trồng thủy sản giai đoạn 2017-2020”. BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT
TRIỂN NÔNG THÔN. Số: 2625/QĐ-BNN-TY".
[41] Trần Thị Bích Ngọc, Phạm Kim Đăng, Giải pháp thay thế kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi, NXB Học viện Nông nghiệp , 2021.
[42] PGS.TS. Nguyễn Thị Xuyên, PGS. TS. Lương Ngọc Khuê,GS. TS. Trần
Quỵ,GS.TS. Hoàng Thị Kim Huyền, Hướng dẫn sử dụng kháng sinh, NXB
Y học Hà Nội, 2015.
[43] Bonnet, M., Lagier, J. C., Raoult, D., & Khelaifia, S., "Bacterial culture through selective and non-selective conditions: the evolution of culture media in clinical microbiology," New Microbes and New Infections, p. 100622, 2019.
[44] Herman C. Lichstein and Malcolm H. Soule, , "Studies Of The Effect Of Sodium Azide On Microbic Growth And Respiration.," Received for publication June 19, 1943..
[45] Luginbühl, M., Weinmann, W., & Al-Ahmad, A., "Introduction of sample tubes with sodium azide as a preservative for ethyl glucuronide in urine,"
International Journal of Legal Medicine, pp. 131(5), 1283–1289, 2017. [46] Inderbir S. Padda, Shivaraj Nagalli, "Cefotaxime," Treasure Island
(FL):StatPearls, In: StatPearls [Internet], 2021 Jan. 2021 Jul.
[47] LeFrock, J. L., Prince, R. A., & Left, R. D., "Mechanism of action, antimicrobial activity, pharmacology, adverse effects, and clinical efficacy of cefotaxime.," Pharmacotherapy: The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy, pp. 2(4), 174–184, 1982.
[48] Silva, J.R. Anacona and Gladys Da, "Synthesis and antibacterial activity of cefotaxime metal complexes," Journal of the Chilean Chemical Society, pp. 447-450, 2005.
[49] Mir, R. A., Weppelmann, T. A., Johnson, J. A., Archer, D., Morris, J. G., & Jeong, K. C., "Identification and characterization of cefotaxime resistant bacteria in beef cattle," PLOS ONE, p. 11(9), 2016.
[50] Vinueza-Burgos, C., Ortega-Paredes, D., Narváez, C., De Zutter, L., & Zurita, J., "Characterization of cefotaxime resistant Escherichia coli isolated from broiler farms in Ecuador," PLOS ONE, p. 14(4), 2019.
[51] Adegoke, A. A., Madu, C. E., Aiyegoro, O. A., Stenström, T. A., & Okoh, A. I., "Antibiogram and beta-lactamase genes among cefotaxime resistant E. coli from wastewater treatment plant," Antimicrobial Resistance & Infection Control, p. 9(1), 2020.
[52] Dang, S. T. T., Bortolaia, V., Tran, N. T., Le, H. Q., & Dalsgaard, A., "Cephalosporin-resistant Escherichia coli isolated from farm workers and pigs in northern Vietnam," Tropical Medicine & International Health, pp. 23(4), 415–424, 2018.
[53] Duong Thi Quy Truong, Yaovi Mahuton Gildas Hounmanou , Son Thi Thanh Dang , John Elmerdahl Olsen , Giang Thi Huong Truong , Nhat Thi Tran , Flemming Scheutz , and Anders Dalsgaard, "Genetic comparison of ESBL- producing Escherichia coli from workers and pigs at Vietnamese pig farms,"
Antibiotics (Basel), p. 10(10): 1165., 2021 Oct.
[54] Nguyễn Lân Dũng, Giáo trình vinh sinh vật học, NXB Giáo dục Việt Nam,
2010.
[55] "TCVN 8736:2011. Thuốc thú y – phương pháp định lượng tổng số bào tử
Bacillus".
[56] Patel, A. K., Ahire, J. J., Pawar, S. P., Chaudhari, B. L., & Chincholkar, S. B., "Comparative accounts of probiotic characteristics of Bacillus spp.
isolated from food wastes," Food Research International, pp. 42(4), 505– 510, 2009.
[57] "CLSI, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement (2011).".
[58] "Clinical and Laboratory Standards Institude – CLSI,Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 9th ed. Approved Standard M7-A9.Vol.32 No.2," 2012.
[59] L.McKillip, John, "Selective medium for gram-positive bacteria," Pub. No.: US 2002/0192741 A1, 2002.
[60] Trần Nhật Phương, Trần Linh Thước, Phạm Hùng Vân, "Khảo sát sự chuyển gen đề kháng carbapenem từ Klebsiella pneumoniae sang Escherichia coli
J53 bằng con đường tiếp hợp in vitro," Science & Technology Development,
vol. 19, pp. No.T1-2016, 2016.
[61] Leungtongkam, U., Thummeepak, R., Tasanapak, K., & Sitthisak, S., "Acquisition and transfer of antibiotic resistance genes in association with conjugative plasmid or class 1 integrons of Acinetobacter baumannii," PLOS ONE, p. 13(12), 2018.
[62] Mingmongkolchai S. and Panbangred W., "In vitro evaluation of candidate
Bacillus spp. for animal feed," J. Gen. Appl. Microbiol, pp. 63 (2), 147-156, 2017.
[63] Agwa O. K., Uzoigwe C. I. and Wokoma E. C., "Incidence and antibiotic sensitivity of Bacillus cereus isolated from ready to eat foods sold in some markets in Portharcourt, Rivers state, Nigeria," Asian Jr. of Microbiol. Biotech. Env. Sci, p. 14 (1), 2012.
[64] Bautista J. R., and Teves F. G., "Antibiotic susceptibility testing of isolated