5. Một số chất sử dụng trong môi trường chọn lọc để nuôi cấy vi sinh vật
2.2.3.Phương pháp xác định hoạt tính catalase
Hoạt tính catalase của các chủng Bacillusđược xác định theo các bước như
sau [56]:
- Các chủng Bacillusđược cấy ria trên môi trường NA, được ủ ở 370C trong 16-20 giờ.
- Sau thời gian nuôi tiến hành nhỏ 3% hydrogen peroxide lên trên bề
mặt khuẩn lạc và quan sát.
- Khả năng sinh catalase được đánh giá theo tiêu chí:
Khuẩn lạc có sủi bọt: dương tính với catalase.
Khuẩn lạc không sủi bọt khí: âm tính với catalase. 2.2.4. Phương pháp xác định khảnăng chịu axit
Khả năng chịu axit của các chủng Bacillusđược thực hiện như sau:
- Các chủng Bacillus được nuôi trong môi trường đối chứng NB (pH ≈ 7.0) và môi trường NB pH 2.5 ở 370C, lắc 120 vòng/phút trong 16-20 giờ.
- Sau thời gian nuôi, các chủng Bacillusđược đánh giá khả năng sống sót thông qua độ đục của dịch huyền phù so với mẫu kiểm chứng và được ria trên môi trường NA.
- Các đĩa này được ủ ở 370C trong 16-20 giờ. Sau thời gian nuôi, tiến hành quan sát và đánh giá khả năng chịu axit của các chủng.
Trên đĩa thạch sau nuôi có khuẩn lạc mọc: chủng có khả năng
sống sót trong môi trường trường axit.
Trên đĩa thạch sau nuôi không khuẩn lạc mọc: chủng không khả
năng sống sót trong môi trường trường axit.
- Tiến hành lựa chọn các chủng Bacilluscó khả năng chịu axit cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.5. Phương pháp xác định khảnăng kháng khuẩn
Khả năng kháng khuẩn của các vi sinh vật probiotic được xác định theo phương pháp đối khángtrực tiếp [25] . Cụ thể như sau:
Commented [7]: viết rõ các chủng bacillus
Commented [8]: như thế nào là sinh hoạt tính catalase, cần trình bày rõ
Commented [9]: nên nêu rõ là các chủng như thế nào
- Vi khuẩn gây bệnh, vi khuẩn kháng kháng sinh và các chủng Bacillus
được hoạt hóa trong môi trường NB và nuôi ở 370C, 120 vòng/phút trong 16-20 giờ.
- Dịch sau hoạt hóa được đem đi xác định OD tại bước sóng 600nm và
được pha loãng đến nồng độ khoảng 106 CFU/ml.
- Bơm 2 mL dung dịch vi khuẩn đã được pha loãng (dự đoán nồng độ
khoảng 106CFU/ml) lên bề mặt môi trường NA, láng đều dịch trên bề mặt. Sau khi láng đều, hút phần dịch thừa ra.
- Sau đó, bơm5 µL dịch vi khuẩn Bacillusmật độ 108CFU/ml lên bề mặt thạch đã được trải vi khuẩn gây bệnh/vi khuẩn kháng kháng sinh, và đem ủ ở 370C trong 16-20 giờ.
- Đánh giá khả năng đối kháng được đo bằng đường kính vòng vô khuẩn
theo đơn vị mm. Lựa chọn các chủngcó khả năng kháng khuẩn tốt cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.6. Phương pháp xác định tính nhạy cảm với kháng sinh.
Kháng sinh đồ là kỹ thuật tìm hiểu khả năng tác dụng của chất kháng sinh đối với từng loại vi khuẩn.
a. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Tính nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đĩa khuếch tán theo hướng dẫn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm
(CLSI) [25] [57]. Cụ thể như sau:
- Vi khuẩn Bacillusđược hoạt hóa trong môi trường NB ở 370C, 120 vòng/phút trong 16-20 giờ.
- Dịch sau hoạt hóa được đem đi xác định OD tại bước sóng 600nm và
được pha loãng đến nồng độ khoảng 106 CFU/ml.
- Bơm 2 mL dung dịch vi khuẩn đã được pha loãng (nồng độ 106 CFU/ml) lên bềmặt môi trường Muller hinton agar, láng đều dịch trên bề mặt. Sau khi láng đều, hút phần dịch thừa ra.
- Đặt khoanh giấy chứa kháng sinh ở nồng độ thích hợp vào đĩa thạch
đã được láng dịch vi khuẩn và ủ ở 370C trong 16-20 giờ. 13 loại kháng sinh sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Gentamicin (GEN, 10μg),
Tetracycline (TE, 30 μg), Kanamycin (K, 30 μg), Rifampicin (RA, 30 μg), Erythromycin (E, 15 μg), Clindamycin (CM, 2 μg), Amoxicillin (AMX, 10 μg), Ampicillin (AMP, 10 μg), Ciprofloxacin (CIP, 5 μg),
Streptomycin (S, 10 μg), Chloramphenicol (C, 30 μg), Cefoxitin (FOX, 30 μg) và Amikacin (AK, 30 μg)).
- Sau khi nuôi, tiến hành đo đường kính vòng vô khuẩn và đánh giá tính nhạy cảm của các chủng Bacillusvới các loại kháng sinh theo bảng 5.
- Lựa chọn các chủng có tính nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh để
làm chủng khảo sát cho các thí nghiệm tiếp theo.
Breakpoint (điểm gãy) là giá trị phản ánh khả năng đáp ứng của liệu pháp kháng sinh, sử dụng để chỉ ra tính nhạy cảm (S), nhạy cảm tức thời (I) hay kháng (R) đối với một chủng vi sinh vật cụ thể [58].
Bảng 2. 2: Giá trị breakpoint đường kính vòng vô khuẩn (mm) [57].
Loại kháng sinh Lượng kháng sinh (μg/đĩa) S I R Gentamicin (GEN) 10 ≥ 15 13-14 ≤ 12 Tetracycline (TE) 30 ≥ 19 15-18 ≤ 14 Kanamycin (K) 30 ≥ 18 14-17 ≤ 13 Rifampicin (RI) 30 ≥ 26 - <23 Erythromycin (E) 15 ≥ 23 14-22 ≤ 13 Clindamycin (CM) 2 ≥ 21 15-20 ≤ 14 Amoxicillin (AMX) 10 ≥ 21 - ≤ 14 Ampicillin (AMP) 10 ≥29 - ≤28 Ciprofloxacin (CIP) 5 ≥ 21 16-20 ≤15 Streptomycin (S) 10 ≥ 14 - <14 Chloramphenicol (C) 30 ≥ 18 13-17 ≤ 12 Cefoxitin (FOX) 30 ≥ 22 - ≤ 21 Amikacin (AK) 30 ≥ 17 15-16 ≤ 14 (*) Breakpoint được sử dụng cho các kháng sinh trên là cho Staphylococcus spp.
2011 [57]. Các giá trị này có thể được sử dụng để kiểm tra Bacillus spp. (không
phải Bacillus anthracis) [33].
b. Phương pháp pha loãng liên tục để xác định nồng độ ức chế tối thiểu
MIC (Minimal Inhibition Concentration) được định nghĩa là nồng độ tối thiểu của một kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển vi khuẩn có thể quan sát được bằng mắt thường [58]. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp pha loãng liên
tục trong môi trường lỏng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh Cefotaxime đối với chủng Bacillus và E.coli Ec457 [57]. Cách tiến hành như sau:
- Chọn một khuẩn lạc từ đĩa thạch của mỗi chủng vi sinh vật và cấy vào môi trường NB, hoạt hóa ở 370C, 120 vòng/phút trong 16-20 giờ.
- Sau hoạt hóa, đo mật độ quang tại bước sóng 600nm của các canh
trường vi khuẩn. Tiến hành pha loãng canh trường vi khuẩn trong môi trường NB vô trùng về nồng độ 106 CFU/ml.
- Chuẩn bị một dãy các dung dịch kháng sinh với các nồng độ 40, 80,
160, 320, 640 µg/ml
- Thêm 20 µl kháng sinh Cefotaxime ở các nồng độ khác nhau vào mỗi
giếng, sau đó cho 180 µl canh trường vi khuẩn nồng độ 106 CFU/ml.
Như vậy nồng độ cuối của kháng sinh trong mỗi giếng từ 4, 8, 16, 32
và 64 µg/ml.
- Bổ sung 200µl môi trường NB vô trùng vào một giếng và 200µl canh
trường vi khuẩn nồng độ 106CFU/ml vào mỗi giếng làm kiểm chứng.
- Tiến hành ủ phên 96 giếng ở 370C, 120 vòng/phút trong 16-20 giờ. Sau đó tiến hànhđọc và xác định nồng độ ức chế tối thiểu của các chủng vi khuẩn và đánh giá tính nhạy cảm của các chủng với Cefotaxime theo bảng 6. MIC được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất ức chế sự phát triển nhìn thấy được của vi khuẩn.
- Các chủng Bacillusnhạy cảm với Cefotaxime được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 2. 3: Giá trị breakpoint của Bacillus sp. và E. coliđối với kháng sinh
Cefotaxime [57].
Cefotaxime Bacillus sp.* E. coli ATCC 25922 S I R S I R
Giá trị
breakpoint (µg/ml)
≤8 16-32 ≥64 ≤1 2 ≥4
(*) Breakpoint sử dụng để xác định MIC của Bacillussp. dựa theo Staphylococcus
spp. [33].
2.2.7. Phương pháp xác định nồng độ một số thành phần của môi trường chọn lọc cho E.coli và Bacillus sp.
Hóa chất gồm NaN3, LiCl được sử dụng để bổ sung vào môi trường dinh dưỡng nhằm đánh giá ảnh hưởng của nó đến sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường thạch.
Theo báo cáo của Herman và cộng sự [44] sự trao đổi khí của Bacillus subtiliskhi có sodium azide về cơ bản giống như đối chứng cho đến khi sử dụng nồng độ 0.003% sodium azide. Ở nồng độ này, sự tăng trưởng kém và hoạt động trao đổi chất hạn chế. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng số lượng tăng trưởng tương quan với mức tiêu thụ oxy.
Do đó, trong nghiên cứu khảo sát môi trường chọn lọc cho Bacillus chúng
tôi khảo sát môi trường MHA có bổ sung NaN3ở các nồng độ khác nhau: 0.001%, 0.0015%, 0.0018%, 0.002%, 0.0025%, 0.003%. và môi trường MHA có bổ sung
LiCl 10 g/l [59].
* Các môi trường kiểm tra bao gồm:
Môi trường M1: Môi trường MHA bổ sung NaN3ở các nồng độ khác
nhau: 0.001- 0.003%.
Môi trường M2: Môi trường MHA bổ sung LiCl nồng độ 10g/l.
* Các bước tiến hành:
- Chủng vi sinh vật lấy từ khuẩn lạc mọc riêng rẽ được hoạt hóa trong 5ml môi trường NB ở 370C, 120 vòng/phút trong 16-20 giờ.
- Cấy ria các chủng vi sinh vật đã được nuôi lỏng qua đêm lên các đĩa petri chứa môi trường MHA vô trùng có bổ sung NaN3/LiCl và môi
trường MHA (làm kiểm chứng). Sau đó, các đĩa được đem đi nuôi ở
370C trong 16-20 giờ.
- Sau thời gian nuôi, tiến hành đánh giá khả năng phát triển của vi sinh vật ở các môi trường.
- Lựa chọn môi trường chọn lọc thích hợp cho sự phát triển Bacillus và
ức chế sự phát triển của E.coli Ec457.
* Xác định khả năng phát triển của các chủng vi sinh vật bằng cách xác định tỷ lệ sống sót của các chủng trong môi trường M1/M2.
Tỷ lệ sống sót của chủng trong môi trường M1/M2 được xác định bằng mật độ tế bào của chủng vi sinh vật ở môi trường M1/M2 so với ở môi trường MHA. Cụ thể như sau:
- Chủng vi sinh vật lấy từ khuẩn lạc mọc riêng rẽ được hoạt hóa trong 5ml môi trường NB ở 370C, 120 vòng/phút trong 16-20 giờ.
- Canh trường vi khuẩn sau hoạt hóa được pha loãng đến nồng độ thích hợp và được chang đếm trên môi trường MHA và môi trường M1/M2. Sau đó các đĩa được đem đi nuôi ở 370C trong 16-20 giờ.
- Sau thời gian nuôi, đếm số khuẩn lạc và xác định mật độ tế bào vi
khuẩn.
- Tỷ lệ sống sót của chủng trên môi trường M1/M2 được tính bằng tỷ lệ phần trăm mật độ tế bào vi khuẩn trong môi trường M1/M2 (theo log) trên mật độ vi khuẩn trong môi trường MHA (theo log).
2.2.8. Phương pháp đánh giá khảnăng ức chế của Cefotaxime đến sự phát triển của E.coli và Bacillus sp. trong môi trường thạch của E.coli và Bacillus sp. trong môi trường thạch
Thí nghiệm khảo sát khả năng chuyển/nhận gen kháng kháng sinh Cefotaxime được thực hiện trong môi trường thạch nên nghiên cứu tiến hành đánh
giá ảnh hưởng của kháng sinh Cefotaxime đến sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường thạch.
* Phương pháp thực hiện được tóm tắt như sau:
- Chủng vi sinh vật lấy từ khuẩn lạc mọc riêng rẽ được hoạt hóa trong 5ml môi trường NB ở 370C, 120 vòng/phút trong 16-20 giờ.
- Chuẩn bị các đĩa petri chứa môi trường MHA vô trùng có bổ sung
kháng sinh tương ứng với nồng độ tăng gấp đôi từ 4µg/mL đến
16µg/mL.
- Cấy ria các chủng vi sinh vật đã được nuôi lỏng qua đêm lên các đĩa petri đã chuẩn bị lần lượt từ đĩa chứa nồng độ kháng sinh thấp nhất đến nồng độ kháng sinh cao nhất. Sau đó các đĩa được đem đi nuôi ở
370C trong 16-20 giờ.
- Sau thời gian nuôi, tiến hành đánh giá khả năng phát triển của vi sinh vật ở các nồng độ kháng sinh và lựa chọn được nồng độ thích hợp ức chế sự phát triển của chủng Bacillusmà có thể nhìn thấy bằng mắt thường.
* Khảo sát khả năng sống sót của chủng vi sinh vật trong môi trường M3
Các bước tiến hành:
- Chủng vi sinh vật lấy từ khuẩn lạc mọc riêng rẽ được hoạt hóa trong 5ml môi trường NB ở 370C, 120 vòng/phút trong 16-20 giờ.
- Dịch sau hoạt hóa được đem đi xác định OD tại bước sóng 600nm và
được pha loãng đến nồng độ khoảng 106 CFU/ml.
- Hút 100µl canh trường vi khuẩn nồng độ 106 CFU/ml đĩa petri chứa môi trường MHA có bổ sung Cefotaxime với nồng độ thích hợp. Đem đi nuôi ở 370C trong 16-20 giờ.
- Tiếp tục pha loãng canh trường vi khuẩn đến nồng độ thích hợp và
chang trên môi trường MHA làm mẫu kiểm chứng.
- Sau thời gian nuôi, tiến hành đánh giá tính nhạy cảm của các chủng vi sinh vật với nồng độ kháng sinh đó.
- Từ đó, ta xác định môi trường chọn lọc để ức chế sự phát triển của các chủng Bacillus.
2.2.9. Phương pháp khảo sát khảnăng chuyển/nhận gen kháng kháng sinh
*Mô hình thí nghiệm:
Hình 2. 1: Mô hình thí nghiệm khảo sát chuyển/nhận gen kháng kháng sinh giữa 2 chủng Bacillus và E.coli Ec457
E. coliEc457 là chủng vi khuẩn có gen kháng kháng sinh Cefotaxime nằm trên plasmid. Khả năng nhận gen kháng sinh của các chủng Bacillusđược thực hiện cụ thể theo các bước sau [60] [61]:
- Chuẩn bị môi trường thạch M1/M2, M3, M4.
- Chủng Bacillustiềm năng và E. coliEc457 lấy từ khuẩn lạc mọc riêng rẽ được hoạt hóa trong 5ml môi trường NB ở 370C, 120 vòng/phút trong 16-20 giờ.
- Dịch sau hoạt hóa được đem đi đo mật độ quang (OD) tại bước sóng
600nm để xác định mật độ tế bào ban đầu (dựa vào đường chuẩn giữa mật độ quang và mật độ tế bào). Tiến hành pha loãng canh trường vi khuẩn đến nồng độ khoảng 107 CFU/ml.
- Bổ sung 100µl dịch nuôi cấy của chủng Bacillusnồng độ khoảng 107 CFU/ml và 100µl dịch nuôi cấy của E.coliEc457 nồng độ khoảng 107
CFU/ml vào 9800µl môi trường NB. Lắc đều cạnhtrường hỗn hợp vi
- Sau 4 giờ, tiến hành pha loãng canh trường hỗn hợp vi khuẩn và chang đếm trên môi trường M1/M2, M3, M4.
- Thực hiện song song ở cùng điều kiện 2 mẫu kiểm chứng gồm:
+ Kiểm chứng dương: 100µl dịch nuôi của chủng Bacillus nồng độ khoảng 107CFU/ml được cấy vào 9900µl môi trường NB vô trùng. Nuôi và chang đếm mật độ vi khuẩn sau 4 giờ trên môi trường
M1/M2.
+ Kiểm chứng âm: 100µl dịch nuôi cấy của E.coli Ec457 nồng độ
khoảng 107CFU/ml được cấy chuyền vào 9900µl môi trường NB.
Nuôi và chang đếm mật độ vi khuẩn sau 4 giờ trên môi trường M3.
- Tần số tiếp hợp của chủng phân lập được xác định theo công thức
[108]:
* Hiệu quả kết hợp= Mật độ tế bào kết hợp (CFU/ml) / Mật độ tế bào nhận (CFU/ml).
Với:
- Mật độ tế bào kết hợp được tính theo tổng số khuẩn lạc
Bacillusđược nuôi trong đĩa M4 với mật độ vi khuẩn trong môi trường thạch là 105 CFU/ml. - Mật độ tế bào nhận = 2 2 1 2 1 ( / ) ( 0,1 ). . C N CFU ml n n f V = +∑ (C2: Tổng số khuẩn lạc Bacillusđược nuôi trong môi trường
M1/M2).
2.2.10. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu
Các thí nghiệm được lặp lại ít nhất 2 lần và được xử lý theo phần mềm
Microsoft excel 2019.
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tuyển chọn chủng Bacillus
141 chủng vi khuẩn tạo bào tử được phân lập từ 10 mẫu phân gà, phân lợn từ các trang trại chăn nuôi tại Hà Nội, Quảng Ninh bằng cách xử lý nhiệt. Bacillus
là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, dương tính với catalase, hình thành bào tử, bao gồm hơn 60 loài với kiểu hình khá khác nhau. Từ các kết quả sàng lọc ban đầu cho thấy 59/141 chủng phân lập được cho là thuộc các loài
Bacillus.
Hình 3. 1: Hình nhuộm Gram của chủng CHL2.
Hình 3. 2:Hoạt tính catalase của một số chủng Bacillus.