5. Một số chất sử dụng trong môi trường chọn lọc để nuôi cấy vi sinh vật
2.2.6. Phương pháp xác định tính nhạy cảm với kháng sinh
Kháng sinh đồ là kỹ thuật tìm hiểu khả năng tác dụng của chất kháng sinh đối với từng loại vi khuẩn.
a. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Tính nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đĩa khuếch tán theo hướng dẫn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm
(CLSI) [25] [57]. Cụ thể như sau:
- Vi khuẩn Bacillusđược hoạt hóa trong môi trường NB ở 370C, 120 vòng/phút trong 16-20 giờ.
- Dịch sau hoạt hóa được đem đi xác định OD tại bước sóng 600nm và
được pha loãng đến nồng độ khoảng 106 CFU/ml.
- Bơm 2 mL dung dịch vi khuẩn đã được pha loãng (nồng độ 106 CFU/ml) lên bềmặt môi trường Muller hinton agar, láng đều dịch trên bề mặt. Sau khi láng đều, hút phần dịch thừa ra.
- Đặt khoanh giấy chứa kháng sinh ở nồng độ thích hợp vào đĩa thạch
đã được láng dịch vi khuẩn và ủ ở 370C trong 16-20 giờ. 13 loại kháng sinh sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Gentamicin (GEN, 10μg),
Tetracycline (TE, 30 μg), Kanamycin (K, 30 μg), Rifampicin (RA, 30 μg), Erythromycin (E, 15 μg), Clindamycin (CM, 2 μg), Amoxicillin (AMX, 10 μg), Ampicillin (AMP, 10 μg), Ciprofloxacin (CIP, 5 μg),
Streptomycin (S, 10 μg), Chloramphenicol (C, 30 μg), Cefoxitin (FOX, 30 μg) và Amikacin (AK, 30 μg)).
- Sau khi nuôi, tiến hành đo đường kính vòng vô khuẩn và đánh giá tính nhạy cảm của các chủng Bacillusvới các loại kháng sinh theo bảng 5.
- Lựa chọn các chủng có tính nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh để
làm chủng khảo sát cho các thí nghiệm tiếp theo.
Breakpoint (điểm gãy) là giá trị phản ánh khả năng đáp ứng của liệu pháp kháng sinh, sử dụng để chỉ ra tính nhạy cảm (S), nhạy cảm tức thời (I) hay kháng (R) đối với một chủng vi sinh vật cụ thể [58].
Bảng 2. 2: Giá trị breakpoint đường kính vòng vô khuẩn (mm) [57].
Loại kháng sinh Lượng kháng sinh (μg/đĩa) S I R Gentamicin (GEN) 10 ≥ 15 13-14 ≤ 12 Tetracycline (TE) 30 ≥ 19 15-18 ≤ 14 Kanamycin (K) 30 ≥ 18 14-17 ≤ 13 Rifampicin (RI) 30 ≥ 26 - <23 Erythromycin (E) 15 ≥ 23 14-22 ≤ 13 Clindamycin (CM) 2 ≥ 21 15-20 ≤ 14 Amoxicillin (AMX) 10 ≥ 21 - ≤ 14 Ampicillin (AMP) 10 ≥29 - ≤28 Ciprofloxacin (CIP) 5 ≥ 21 16-20 ≤15 Streptomycin (S) 10 ≥ 14 - <14 Chloramphenicol (C) 30 ≥ 18 13-17 ≤ 12 Cefoxitin (FOX) 30 ≥ 22 - ≤ 21 Amikacin (AK) 30 ≥ 17 15-16 ≤ 14 (*) Breakpoint được sử dụng cho các kháng sinh trên là cho Staphylococcus spp.
2011 [57]. Các giá trị này có thể được sử dụng để kiểm tra Bacillus spp. (không
phải Bacillus anthracis) [33].
b. Phương pháp pha loãng liên tục để xác định nồng độ ức chế tối thiểu
MIC (Minimal Inhibition Concentration) được định nghĩa là nồng độ tối thiểu của một kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển vi khuẩn có thể quan sát được bằng mắt thường [58]. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp pha loãng liên
tục trong môi trường lỏng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh Cefotaxime đối với chủng Bacillus và E.coli Ec457 [57]. Cách tiến hành như sau:
- Chọn một khuẩn lạc từ đĩa thạch của mỗi chủng vi sinh vật và cấy vào môi trường NB, hoạt hóa ở 370C, 120 vòng/phút trong 16-20 giờ.
- Sau hoạt hóa, đo mật độ quang tại bước sóng 600nm của các canh
trường vi khuẩn. Tiến hành pha loãng canh trường vi khuẩn trong môi trường NB vô trùng về nồng độ 106 CFU/ml.
- Chuẩn bị một dãy các dung dịch kháng sinh với các nồng độ 40, 80,
160, 320, 640 µg/ml
- Thêm 20 µl kháng sinh Cefotaxime ở các nồng độ khác nhau vào mỗi
giếng, sau đó cho 180 µl canh trường vi khuẩn nồng độ 106 CFU/ml.
Như vậy nồng độ cuối của kháng sinh trong mỗi giếng từ 4, 8, 16, 32
và 64 µg/ml.
- Bổ sung 200µl môi trường NB vô trùng vào một giếng và 200µl canh
trường vi khuẩn nồng độ 106CFU/ml vào mỗi giếng làm kiểm chứng.
- Tiến hành ủ phên 96 giếng ở 370C, 120 vòng/phút trong 16-20 giờ. Sau đó tiến hànhđọc và xác định nồng độ ức chế tối thiểu của các chủng vi khuẩn và đánh giá tính nhạy cảm của các chủng với Cefotaxime theo bảng 6. MIC được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất ức chế sự phát triển nhìn thấy được của vi khuẩn.
- Các chủng Bacillusnhạy cảm với Cefotaxime được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 2. 3: Giá trị breakpoint của Bacillus sp. và E. coliđối với kháng sinh
Cefotaxime [57].
Cefotaxime Bacillus sp.* E. coli ATCC 25922 S I R S I R
Giá trị
breakpoint (µg/ml)
≤8 16-32 ≥64 ≤1 2 ≥4
(*) Breakpoint sử dụng để xác định MIC của Bacillussp. dựa theo Staphylococcus
spp. [33].
2.2.7. Phương pháp xác định nồng độ một số thành phần của môi trường chọn lọc cho E.coli và Bacillus sp.
Hóa chất gồm NaN3, LiCl được sử dụng để bổ sung vào môi trường dinh dưỡng nhằm đánh giá ảnh hưởng của nó đến sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường thạch.
Theo báo cáo của Herman và cộng sự [44] sự trao đổi khí của Bacillus subtiliskhi có sodium azide về cơ bản giống như đối chứng cho đến khi sử dụng nồng độ 0.003% sodium azide. Ở nồng độ này, sự tăng trưởng kém và hoạt động trao đổi chất hạn chế. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng số lượng tăng trưởng tương quan với mức tiêu thụ oxy.
Do đó, trong nghiên cứu khảo sát môi trường chọn lọc cho Bacillus chúng
tôi khảo sát môi trường MHA có bổ sung NaN3ở các nồng độ khác nhau: 0.001%, 0.0015%, 0.0018%, 0.002%, 0.0025%, 0.003%. và môi trường MHA có bổ sung
LiCl 10 g/l [59].
* Các môi trường kiểm tra bao gồm:
Môi trường M1: Môi trường MHA bổ sung NaN3ở các nồng độ khác
nhau: 0.001- 0.003%.
Môi trường M2: Môi trường MHA bổ sung LiCl nồng độ 10g/l.
* Các bước tiến hành:
- Chủng vi sinh vật lấy từ khuẩn lạc mọc riêng rẽ được hoạt hóa trong 5ml môi trường NB ở 370C, 120 vòng/phút trong 16-20 giờ.
- Cấy ria các chủng vi sinh vật đã được nuôi lỏng qua đêm lên các đĩa petri chứa môi trường MHA vô trùng có bổ sung NaN3/LiCl và môi
trường MHA (làm kiểm chứng). Sau đó, các đĩa được đem đi nuôi ở
370C trong 16-20 giờ.
- Sau thời gian nuôi, tiến hành đánh giá khả năng phát triển của vi sinh vật ở các môi trường.
- Lựa chọn môi trường chọn lọc thích hợp cho sự phát triển Bacillus và
ức chế sự phát triển của E.coli Ec457.
* Xác định khả năng phát triển của các chủng vi sinh vật bằng cách xác định tỷ lệ sống sót của các chủng trong môi trường M1/M2.
Tỷ lệ sống sót của chủng trong môi trường M1/M2 được xác định bằng mật độ tế bào của chủng vi sinh vật ở môi trường M1/M2 so với ở môi trường MHA. Cụ thể như sau:
- Chủng vi sinh vật lấy từ khuẩn lạc mọc riêng rẽ được hoạt hóa trong 5ml môi trường NB ở 370C, 120 vòng/phút trong 16-20 giờ.
- Canh trường vi khuẩn sau hoạt hóa được pha loãng đến nồng độ thích hợp và được chang đếm trên môi trường MHA và môi trường M1/M2. Sau đó các đĩa được đem đi nuôi ở 370C trong 16-20 giờ.
- Sau thời gian nuôi, đếm số khuẩn lạc và xác định mật độ tế bào vi
khuẩn.
- Tỷ lệ sống sót của chủng trên môi trường M1/M2 được tính bằng tỷ lệ phần trăm mật độ tế bào vi khuẩn trong môi trường M1/M2 (theo log) trên mật độ vi khuẩn trong môi trường MHA (theo log).
2.2.8. Phương pháp đánh giá khảnăng ức chế của Cefotaxime đến sự phát triển của E.coli và Bacillus sp. trong môi trường thạch