Phương pháp khảo sát khả năng chuyển/nhận gen kháng kháng sinh

5. Một số chất sử dụng trong môi trường chọn lọc để nuôi cấy vi sinh vật

2.2.9. Phương pháp khảo sát khả năng chuyển/nhận gen kháng kháng sinh

*Mô hình thí nghiệm:

Hình 2. 1: Mô hình thí nghiệm khảo sát chuyển/nhận gen kháng kháng sinh giữa 2 chủng Bacillus và E.coli Ec457

E. coliEc457 là chủng vi khuẩn có gen kháng kháng sinh Cefotaxime nằm trên plasmid. Khả năng nhận gen kháng sinh của các chủng Bacillusđược thực hiện cụ thể theo các bước sau [60] [61]:

- Chuẩn bị môi trường thạch M1/M2, M3, M4.

- Chủng Bacillustiềm năng và E. coliEc457 lấy từ khuẩn lạc mọc riêng rẽ được hoạt hóa trong 5ml môi trường NB ở 370C, 120 vòng/phút trong 16-20 giờ.

- Dịch sau hoạt hóa được đem đi đo mật độ quang (OD) tại bước sóng

600nm để xác định mật độ tế bào ban đầu (dựa vào đường chuẩn giữa mật độ quang và mật độ tế bào). Tiến hành pha loãng canh trường vi khuẩn đến nồng độ khoảng 107 CFU/ml.

- Bổ sung 100µl dịch nuôi cấy của chủng Bacillusnồng độ khoảng 107 CFU/ml và 100µl dịch nuôi cấy của E.coliEc457 nồng độ khoảng 107

CFU/ml vào 9800µl môi trường NB. Lắc đều cạnhtrường hỗn hợp vi

- Sau 4 giờ, tiến hành pha loãng canh trường hỗn hợp vi khuẩn và chang đếm trên môi trường M1/M2, M3, M4.

- Thực hiện song song ở cùng điều kiện 2 mẫu kiểm chứng gồm:

+ Kiểm chứng dương: 100µl dịch nuôi của chủng Bacillus nồng độ khoảng 107CFU/ml được cấy vào 9900µl môi trường NB vô trùng. Nuôi và chang đếm mật độ vi khuẩn sau 4 giờ trên môi trường

M1/M2.

+ Kiểm chứng âm: 100µl dịch nuôi cấy của E.coli Ec457 nồng độ

khoảng 107CFU/ml được cấy chuyền vào 9900µl môi trường NB.

Nuôi và chang đếm mật độ vi khuẩn sau 4 giờ trên môi trường M3.

- Tần số tiếp hợp của chủng phân lập được xác định theo công thức

[108]:

* Hiệu quả kết hợp= Mật độ tế bào kết hợp (CFU/ml) / Mật độ tế bào nhận (CFU/ml).

Với:

- Mật độ tế bào kết hợp được tính theo tổng số khuẩn lạc

Bacillusđược nuôi trong đĩa M4 với mật độ vi khuẩn trong môi trường thạch là 105 CFU/ml. - Mật độ tế bào nhận = 2 2 1 2 1 ( / ) ( 0,1 ). . C N CFU ml n n f V = +∑ (C2: Tổng số khuẩn lạc Bacillusđược nuôi trong môi trường

M1/M2).

2.2.10. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu

Các thí nghiệm được lặp lại ít nhất 2 lần và được xử lý theo phần mềm

Microsoft excel 2019.

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tuyển chọn chủng Bacillus

141 chủng vi khuẩn tạo bào tử được phân lập từ 10 mẫu phân gà, phân lợn từ các trang trại chăn nuôi tại Hà Nội, Quảng Ninh bằng cách xử lý nhiệt. Bacillus

là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, dương tính với catalase, hình thành bào tử, bao gồm hơn 60 loài với kiểu hình khá khác nhau. Từ các kết quả sàng lọc ban đầu cho thấy 59/141 chủng phân lập được cho là thuộc các loài

Bacillus.

Hình 3. 1: Hình nhuộm Gram của chủng CHL2.

Hình 3. 2:Hoạt tính catalase của một số chủng Bacillus.

Tiến hành khảo sát khả năng chịu đựng pH thấp của 59 chủng Bacillus. Các

chủng này được ủ trong môi trường NB pH=2.5 trong 16-20 giờ. Sau khi quan sát và đánh giá, kết quả thu được 52/59 chủng có khả năng chịu được và tồn tại trong điều kiện có tính axit cao.

52 chủng này được tiến hành thử nghiệm đánh giá khả năng sản xuất enzyme protease, cellulase, amylase. Dựa trên hoạt động sản xuất enzyme từ kết

quả của nhóm nghiên cứu, 33 chủng Bacilluslà các chủng có khả năng sinh một

enzyme được lựa chọn để đánh giá tính nhạy cảm với một số loại kháng sinh.

3.2. Tính nhạy cảm với kháng sinh của các chủng Bacillus

Khả năng nhạy cảm với kháng sinh của 33 chủng Bacillusđược thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (mục 2.2.6.a) với 13 loại kháng sinh khác

nhau. Đây là các loại kháng sinh phổ biến được sử dụng trong phòng và điều trị trong chăn nuôi tại Việt Nam, nằm trong danh mục được phép sử dụng theo thông

tư 06/2016 – TT – BNNPTNT và danh mục thuốc thú y được phép lưu hành cập

nhật đến ngày 31/12/2020 (trang thông tin điện tử Cục thú y, Bộ NNPTNT). Kết quả về kháng sinh đồ được trình bày trong bảng 5.2, hình 3.3 và hình 3.4.

Hình 3. 3: Tính mẫn cảm đối với kháng sinh của một số chủng Bacillus sp.

100 GEN

% Nhạy % Trung gian % Kháng

84.8 15.2

TE

% Nhạy % Trung gian % Kháng

100

K

% Nhạy % Trung gian % Kháng

15.2

84.8

RI

% Nhạy % Trung gian % Kháng

48.5 51.5

E

% Nhạy % Trung gian % Kháng

66.7 33.3

CM

% Nhạy % Trung gian % Kháng

27.3 72.7

AMX

% Nhạy % Trung gian % Kháng

9.1

90.9

AMP

% Nhạy % Trung gian % Kháng

100

CIP

% Nhạy % Trung gian % Kháng

100

S

Hình 3. 4: Tỷ lệ phần trăm khả năng nhạy cảm với một số loại kháng sinh của các chủng Bacillus.

Khả năng nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn probiotic thường được quan tâm, vì nếu vi khuẩn probiotic còn nhạy cảm với kháng sinh thì nó sẽ an toàn về mặt sinh học, nó sẽ không chứa plasmid hoặc gene kháng kháng sinh của các kháng sinh được sử dụng. Hình 3.4 cho thấy các chủng khảo sát nhạy cảm với 13 loại kháng sinh thử nghiệm ở các mức độ khác nhau. Tất cả các chủng Bacillus

khảo sát hoàn toàn nhạy cảm với gentamycin, ciprofloxacin, kanamycin, streptomycin. Phần lớn các chủng này nhạy cảm với chloramphenicol (97,0%),

tetracycline (84,8%), amikacin (93,9%) và clindamycin (66,7%). Ngoài ra, các

chủng Bacilluscòn kháng với erythromycin (51,5%), ampicillin (90,9%), cefoxitin (75,8%), amoxicillin (72,7%) và rifampicin (84,8%).

Theo nghiên cứu của Mingmongkolchai và cộng sự (2017) đã đánh giá mức độ an toàn của bảy chủngBacillushình thành bào tử để sử dụng làm phụ gia thức ăn chăn nuôi với 10 loại kháng sinh. Các chủng Bacillus trong nghiên cứu của Mingmongkolchai và cộng sự đều nhạy cảm với chloramphenicol, erythromycin,

97 3

C

% Nhạy % Trung gian % Kháng

24.2 75.8

FOX

% Nhạy % Trung gian % Kháng

93.9 6.1

AK

gentamycin, tetracycline, streptomycin và kanamycin [62]. Kết quả nghiên cứu của Mingmongkolchai và cộng sự tương đồng với kết quả nghiên cứu của chúng tôi.

Nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây. Các chủng Bacillus sp. phân lập được thử nghiệm cho thấy nhạy cảm với

chloramphenicol, erythromycin, ciprofloxacin, streptomycin, gentamycin [63].

Ampicillin và amoxicillin được sử dụng để điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn. Tuy nhiên, một số lợi khuẩn Bacillusspp. được sử dụng rộng rãi để kiểm soát dịch bệnh được phát hiện là có khả năng chống lại các β-lactam (amoxicillin và ampicillin) [64].

Sự đề kháng thuốc kháng sinh có được do sự thay đổi trong cấu trúc gen của chúng. Điều này có được là do sự đột biến gen hoặc sự có sự thu nhận gen

kháng kháng sinh giữa các vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy.

Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy, trong 33 chủng Bacillusđược khảo sát thì có chủng P4QN13 nhạy cảm với tất cả các kháng sinh thử nghiệm (100%), 4 chủng nhạy cảm với hầu hết các loại kháng sinh thử nghiệm (92,31%) là CTY7, CQN6,

P4QN2, P5QN4, chủng P6QN2 nhạy cảm với đasố kháng sinh với tỷ lệ 85,62%,

2/33 chủng có khả năng nhạy với các loại kháng sinh dưới 50%, các chủng còn lại đều có khả năng nhạy cảm với kháng sinh trên 50%. Như vậy, 6 chủng vi khuẩn

Bacillus trong khảo sát của chúng tôi cho kết quả nhạy cảm với nhiều kháng sinh hơn so với nghiên cứu của Lê Thị Hải Yến và cộng sự (2016) khi khảo sát 21 chủng vi khuẩn Bacillussubtilis với 9 loại kháng sinh (5 chủng nhạy với đa số kháng sinh với tỷ lệ 78% và các chủng còn lại nhạy trên 50% tổng số kháng sinh thử nghiệm)

[25] và tương đồng với nghiên cứu của Mingmongkolchai và cộng sự (2017) khi

khảo sát tính nhạy cảm của 7 chủng Bacillusđều nhạy cảm với tất cả các loại kháng sinh thử nghiệm trong đó có 6 loại kháng sinh được thử nghiệm theo khuyến cáo của EFSA (chloramphenicol, erythromycin, gentamicin, tetracycline,

Bảng 3. 1: Khả năngnhạy cảm với một số kháng sinh của các chủng Bacillus STT Chủng Bacillus Khảnăng nhạy cảm với kháng sinh Số kháng sinh nhạy cảm % Số kháng sinh trung gian % Số kháng sinh kháng % 1 CTY6 9 69,23 - - 4 30,77 2 CTY7 12 92,31 - - 1 7,69 3 CTY14 7 53,85 1 7,69 5 38,46 4 CTY16 7 53,85 1 7,69 5 38,46 5 CTY18 6 46,16 2 15,38 5 38,46 6 CTY28 8 61,54 1 7,69 4 30,77 7 CHL2 9 69,23 - - 4 30,77 8 CHL6 9 69,23 - - 4 30,77 9 CHL14 7 53,85 1 7,69 5 38,46 10 CHL15 7 53,85 1 7,69 5 38,46 11 CHL16 9 69,24 2 15,38 2 15,38 12 CQN5 8 61,54 - - 5 38,46 13 CQN6 12 92,31 - - 1 7,69 14 CQN10 8 61,54 1 7,69 4 30,77 15 P1QN3 9 69,23 - - 4 30,77 16 P2QN1 8 61,54 - - 5 38,46 17 P2QN7 7 53,85 1 7,69 5 38,46 18 P3QN6 8 61,54 - - 5 38,46 19 P3QN4 8 61,54 - - 5 38,46 20 P3QN10 8 61,54 1 7,69 4 30,77 21 P3QN12 6 46,16 2 15,38 5 38,46 22 P4QN2 12 92,31 - - 1 7,69 23 P4QN5 8 61,54 - - 5 38,46 24 P4QN11 8 61,54 1 7,69 4 38,46 25 P4QN13 13 100 - - - -

26 P5QN4 12 92,31 - - 1 7,69 27 P5QN6 10 76,93 1 7,69 2 15,38 28 P5QN7 9 69,24 - - 4 38,46 29 P5QN11 7 53,85 1 7,69 5 38,46 30 P5QN12 8 61,54 - - 5 38,46 31 P5QN13 9 69,24 2 15,38 2 15,38 32 P6QN2 11 85,62 1 7,69 1 7,69 33 PHN4 7 53,85 1 7,69 5 38,46 Chú thích: -: không có giá trị.

Dựa trên kết quả đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh kết hợp với các kết quả nghiên cứu khả năng sản xuất enzyme protease, amylase, cellulase của nhóm nghiên cứu, lựa chọn 8 chủng Bacillusnhạy cảm với kháng sinh và khả năng sản xuất enzyme cao đó là: CTY7, CHL15, CHL16, P4QN2, P4QN11, P4QN13, P5QN4, P6QN2 để tiến hành đánh giá khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn trong điều kiện dạ dày và ruột non giả lập.

3.3. Đánh giá khảnăng kháng khuẩn của các chủng Bacillus

Hiệu quả của một sản phẩm probiotic là khi đưa vào đường tiêu hóa sẽ giúp gia tăng sự chuyển hóa thức ăn, tăng khả năng miễn dịch, ngoài ra còn có tác dụng ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh, giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột và hạnchế các bệnh đường tiêu hóa [25].

Dựa vào kết quả đánh giá khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn trong điều kiện dạ dày và ruột non giả lập của nhóm nghiên cứu, nghiên cứu lựa chọn 5

chủng Bacillussp. phân lập: P5QN4, CHL16, P4QN13, P4QN11, CHL15 là các

chủng có khả năng sống sót cao nhất trong các chủng Bacillusthử nghiệm để tiến hành đánh giá khả năng kháng một số chủng vi khuẩn gây bệnh thường gặp. Các kết quả về khả năng kháng S. aureus ATCC25923, S. aureus S21, S. Typhimurium,

P.aeruginosa, E. aerogenes, Proteus vulgaris, E. coliEc457 bằng phương pháp đối kháng trực tiếp (mục 2.2.5) của 5 chủng Bacillusđược thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.5. Đường kính vòng vô khuẩn càng lớn thì khả năng kháng khuẩn của chủng

Bacillus càng mạnh và ngược lại.

Commented [12]: nói qua kết quả một chút đểđưa ra cơ sở mình chọn 5 chủng dưới. nhớ trích dẫn tài liệu tham khảo là luận văn của lan anh

Commented [13R12]:

Commented [14]: viết tên đầy đủ lần đầu thôi, lần sau có thể viết tắt như c viết

Bảng 3. 2: Khả năng kháng một số chủng vi sinh vật gây bệnh của các chủng

Bacillustiềm năng.

Chủng phân lập

Đường kính vòng vô khuẩn (mm)*

S. aureus S21 S. aureus ATCC25923 E. aerogenes S. Typhimurium E.coli Ec457 P. aeruginosa Proteus CHL15 8,7 ± 0,6 3,0 ± 0,0 3,0 ± 0,0 0 0 0 0 CHL16 13,0 ± 1,4 4,5 ± 0,7 5,0 ±0,0 0 0 0 0 P4QN11 6,5 ± 0,7 6,0 ±0,0 0 0 0 0 0 P4QN13 7,0 ± 0,0 0 0 0 0 0 0 P5QN4 5,7 ± 0,6 2,0 ±0,0 0 0 0 0 0

*Đường kính vòng vô khuẩn không bao gồm cả đường kính khuẩn lạc Bacillus

(P<0,05). Hình 3. 5: Hoạt tính kháng một số loại vi khuẩn gây bệnh của các chủng Bacillus. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Đ ườ ng k ính vòng v ô khuẩ n Vi khuẩn gây bệnh CHL15 CHL16 P4QN11 P4QN13 P5QN4

Dựa vào kết quả trong bảng 3.2 và hình 3.5, ta thấy dịch vi khuẩn thu được của các chủng Bacillusthể hiện hoạt động kháng khuẩn ở các mức độ khác nhau. Tất cả các chủng Bacillus nghiên cứu đều có hoạt tính kháng S. aureusS21 với đường kính vòng vô khuẩndao động trong khoảng 5,7 – 13,0 mm. Trong đó, chủng CHL16 có khả năng kháng S. aureusS21 tốt nhất và chủng P5QN4 kháng S. aureus

S21 kém nhất với đường kính vòng vô khuẩn tương ứng là 13,0 mm và 5,7 mm.

4/5 chủngBacilluscó khả năng kháng S. aureusATCC25923 trong đó P4QN11

cho thấy khả năng kháng khuẩn tốt nhất (trung bình đạt 6,0 mm). Chỉ 2/5 chủng

Bacilluscó khả năng khángE. aerogenes. Tất cả các chủng Bacilluskiểm tra đều không có khả năng kháng S. Typhimurium, Proteus vulgaris, E.coli Ec457 và

P.aeruginosa.

Hình 3. 6: Hoạt tính kháng E.coli Ec457, Staphylococcus aureus

ATCC25923 và S. aureusS21 của một số chủng Bacillus.

Theo Lê Thị Hải Yến và cộng sự (2016) [25] khảo sát về khả năng kháng

E. coli, Salmonella spp. và Staphylococcus spp. của 4 chủng vi khuẩn Bacillus

(AG27, AG60, VL05, VL28) được phân lập từ đất và phân trại gà thu được kết quả ở mức độ khác nhau. Bốn chủng AG27, AG60, VL05 và VL28 đều kháng

Staphylococcus, vùng kháng khẩn dao động 19-30 mm (giá trị trung bình cao nhất đạt 30mm), các chủng này đều có khả năng kháng E.coli(giá trị trung bình vòng

vô khuẩn dao động 14-19mm) và Salmonellaspp. (giá trị trung bình vòng vô khuẩn dao động 20-25mm). Đối chiếu với các kết quả nghiên cứu trên cho thấy 1/5 chủng

Bacillustrong nghiên cứu của chúng tôi có khả năng kháng S. aureusS21 ở mức

trung bình và tất cả các chủng đều có khả năng kháng S. aureusATCC25923 ở

mức thấp. Trong nghiên cứu của Vũ Thanh Thảo và cộng sự (2014) cũng cho thấy chủng Bacillus subtilisBS02 có khả năng kháng đối với E.coli, S.aureus nhưng không có khả năng kháng đối với Salmonella Typhimurium, Proteus vulgaris và

Pseudomonas aeruginosa [65]. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Marahiel và cộng sự (1993) khi chứng minh các chủng Bacilluscó thể sinh ra cácchất kháng khuẩn như subtilin, bacilysin, bacteriocin, … để tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh [66].

Hình 3.5 cho thấy các chủng Bacilluscó tác dụng ức chế vi khuẩn Gram dương là S. aureus ATCC25923 và S. aureusS21 hơn là vi khuẩn Gram âm là

S. Typhimurium, E.coli Ec457, P.aeruginosa, E. aerogenes, Proteus. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với công bố trước đó. Theo nghiên cứu của Aslim và cộng sự (2002) nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của 30 chủng Bacillus

được phân lập từ các mẫu đất đối với Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocoliticavà Micrococcus flavus, kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt động kháng khuẩn của các chủng Bacillusđối với vi khuẩn Gram dương tốt hơn vi khuẩn khuẩn Gram âm [67]. Điều này có thể được giải thích rằng các chủng

Bacillusthường tạo ra các hợp chất polypeptide, chẳng hạn như bacteriocin, những hợp chất này thường ảnh hưởng đến vi khuẩn Gram dương [67].

Trong một số nghiên cứu trước đó cũng chỉ rarằngcác chủng Bacillustạo

ra các hợp chất như Lichenicidin, Bacitracin, Coagulin,…, những hợp chất này thường ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương [37]. Điều này có thể giải thích cho hoạt động kháng khuẩn của các chủng Bacillus trong nghiên cứu của chúng tôi đối với vi khuẩn Gram dương tốt hơn vi khuẩn Gram âm.

Dựa vào kết quả kháng khuẩn ở bảng 3.2, các chủng CHL16, CHL15 và P4QN11 là các chủng có khảnăng kháng khuẩn tốt nhất được lựa chọn cho các thí