Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và khảo sát khả năng tích lũy tanin của callus cây khôi nhung (ardisia silvestris pitard)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÍCH LŨY TANIN CỦA CALLUS CÂY KHÔI NHUNG (Ardisia silvestris Pitard) DƯƠNG MINH HIỀN Đà Nẵng, năm 2023 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG MƠI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÍCH LŨY TANIN CỦA CALLUS CÂY KHƠI NHUNG (Ardisia silvestris Pitard) Ngành: Cơng nghệ sinh học Khóa: 2019-2023 Sinh viên: Dương Minh Hiền Người hướng dẫn: TS Võ Châu Tuấn Đà Nẵng, năm 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu chưa công bố cơng trình khác trước Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tác giả Dương Minh Hiền I LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực khố luận tốt nghiệp này, tơi nhận nhiều quan tâm giúp đỡ từ cá nhân tập thể suốt thời gian thực Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Võ Châu Tuấn – thầy giáo tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình tơi thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô giáo khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu, xây dựng thành cơng khóa luận Tơi xin cảm ơn bạn lớp 19CNSH anh chị phịng thí nghiệm khoa Sinh – Mơi trường ln động viên giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Cuối xin chân thành cảm ơn tới ba, mẹ gia đình tơi ln lo lắng chăm sóc tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp II MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT V DANH MỤC BẢNG BIỂU VI DANH MỤC HÌNH ẢNH VII TÓM TẮT VIII MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Khôi nhung 1.2 Nuôi cấy callus ảnh hưởng yếu tố môi trường nuôi cấy 1.3 Tình hình nghiên cứu Khôi nhung 10 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.2 Phạm vi nghiên cứu 13 2.3 Nội dung nghiên cứu 13 2.4 Phương pháp nghiên cứu 14 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 19 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 III 3.1 Ảnh hưởng auxin đến khả sinh trưởng callus điều kiện in vitro 20 3.2 Ảnh hưởng cytokinin đến khả sinh trưởng callus điều kiện in vitro 25 3.3 Ảnh hưởng cytokinin kết hợp auxin đến khả sinh trưởng callus điều kiện in vitro 28 3.4 Xác đinh hàm lượng hàm lượng polyphenol tanin tổng cao chiết callus Khôi nhung 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 Kết luận 35 Đề nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC a IV DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid BAP : 6-benzylaminopurine Cs Cộng : NAA : 1-Naphthaleneacetic acid ĐHST : Điều hòa sinh trưởng IBA : Indole 3-butyric acid Kin : Kinetin MS : Murashige Skoog (1962) NXB : Nhà xuất TDZ : Thidiazuron V DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 Tên bảng Mật độ quang chất chuẩn acid gallic nồng độ khác Ảnh hưởng chất ĐHST NAA nồng độ khác đến khả sinh trưởng callus sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng chất ĐHST IBA nồng độ khác đến khả phát sinh callus sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng chất ĐHST 2,4-D nồng độ khác đến khả phát sinh callus sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng chất ĐHST BAP nồng độ khác đến khả phát sinh callus sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng chất ĐHST KIN nồng độ khác đến khả phát sinh callus sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng chất ĐHST TDZ nồng độ khác đến khả phát sinh callus sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng 2,4-D nồng độ mg/L kết hợp KIN nồng độ khác đến khả phát sinh callus sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng 2,4-D nồng độ mg/L kết hợp BAP nồng độ khác đến khả phát sinh callus sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng 2,4-D nồng độ mg/L kết hợp TDZ nồng độ khác đến khả phát sinh callus sau tuần nuôi cấy Trang 17 20 22 23 25 26 26 28 30 32 Kết định lượng polyphenol tannin tổng cao chiết callus 3.10 Khơi nhung tính theo đường chuẩn acid gallic VI 34 DANH MỤC HÌNH ẢNH Tên hình vẽ Hình Trang 1.1 Cây Khơi nhung phân bố ngồi tự nhiên 2.1 Callus Khơi nhung điều kiện in vitro 13 2.2 Mối tương quan mật độ quang (ΔOD) nồng độ acid gallic 17 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả sinh trưởng callus sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả sinh trưởng callus sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D đến khả sinh trưởng callus sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng nồng độ TDZ đến khả sinh trưởng callus sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng 2,4-D nồng độ mg/L kết hợp KIN nồng độ khác đến khả phát sinh callus sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng 2,4-D nồng độ mg/L kết hợp BAP nồng độ khác đến khả phát sinh callus sau tuần nuôi cấy Ảnh hưởng 2,4-D nồng độ mg/L kết hợp KIN nồng độ khác đến khả phát sinh callus sau tuần nuôi cấy VII 21 22 24 27 29 31 33 TĨM TẮT Khơi nhung có tên khoa học Ardisia silvestris Pitard, thuộc chi Ardisia họ Myrsinaceae, loại thảo dược quý, khôi nhung sử dụng rộng rãi loại dược liệu có tác dụng việc điều trị dày tá tràng, làm giảm bớt ợ chua, nóng rát vùng thượng vị, kích thích lên da non làm lành dày, tá tràng Hiện nay, loài bị rơi vào tình trạng nguy cấp, đe dọa tuyệt chủng đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996, 2007) Những nghiên cứu đề tài thực nhằm cung cấp dẫn liệu khoa học q trình ni cấy sinh trưởng callus Khơi nhung phục vụ cho nhân giống vơ tính tổng hợp chất có hoạt tính sinh học Nghiên cứu sử dụng mẫu callus nuôi cấy điều kiện in vitro mơi trường MS có bổ sung auxin cytokinin riêng lẻ phối hợp nồng độ khác Kết cho thấy, sau tuần ni cấy auxin thích hợp cho sinh trưởng callus 2,4-D nồng độ 1,00 mg/L, số sinh trưởng đạt 10,25; khối lượng tươi đạt 204,9 mg/mẫu khối lượng khô đạt 13,8 mg/mẫu Cytokinin thích hợp cho sinh trưởng callus TDZ nồng độ 0,50 mg/L, số sinh trưởng đạt 8,42; khối lượng tươi đạt 13,63 mg/mẫu khối lượng khô đạt 6,38 mg/mẫu Auxin kết hợp với cytokinin thích hợp cho sinh trưởng callus mg/l 2,4-D kết hợp 0,5 mg/L KIN số sinh trưởng đạt 13,20; khối lượng tươi đạt 258,20 mg/mẫu khối lượng khô đạt 17,53 mg/mẫu Cao chiết ethanol 70% từ callus Khôi nhung có hàm lượng polyphenol tannin tổng tương ứng 7241,4 μg/g 891,5 μg/g VIII Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ TDZ đến khả sinh trưởng callus sau tuần nuôi cấy (A) 0,5 mg/L, (B) mg/L, (C) 1,5 mg/L, (D) mg/L TDZ chất ĐHST thuộc nhóm cytokinin có tác dụng thúc đẩy q trình phân bào mơ sẹo thực vật [12] Chính vậy, việc ni cấy callus mơi trường MS có bổ sung TDZ yếu tố thúc đẩy phát triển callus Hầu hết, callus nuôi cấy môi trường MS bổ sung TDZ có khả sinh trưởng callus với số sinh trưởng đạt từ 4,00 – 8,02 khối lượng tươi từ 6,50 – 13,65 mg/mẫu (bảng 3.6) Ở nghiệm thức bổ sung 0,5 mg/L TDZ có ảnh hưởng tích cực đến khả sinh trưởng callus, với số sinh trưởng đạt 8,42 cao so với nghiệm thức khác Bên cạnh đó, khối lượng tươi đạt 16,63 mg/mẫu cao gấp 1,6 đến lần so với nghiệm thức cịn lại Khối lượng khơ đạt 6,38 mg/mẫu thấp nghiệm thức bổ sung mg/L TDZ (6,9 mg/mẫu) mg/L TDZ (6,85 mg/mẫu) Tuy nhiên, việc so sánh khối lượng khô nghiệm thức khơng có ý nghĩa mặt thống kê Từ kết trên, thấy chất ĐHST TDZ có ảnh hưởng đến q trình sinh trưởng callus sau tuần nuôi cấy so với chất ĐHST BAP KIN thuộc nhóm cytokinin 27 3.3 Ảnh hưởng cytokinin kết hợp auxin đến khả sinh trưởng callus điều kiện in vitro Auxin nhóm chất điều hịa sinh trưởng thực vật sử dụng thường xuyên nuôi cấy mô tế bào thực vật Nhiều nghiên cứu cho thấy, 2,4-D auxin thường dùng để kích thích phân bào sinh trưởng tế bào callus (Furuya T cs, 1983) Auxin kết hợp chặt chẽ với thành phần khác mơi trường dinh dưỡng để kích thích tăng trưởng mô sẹo, huyền phù tế bào điều hịa phát sinh hình thái, đặc biệt phối hợp sử dụng với cytokinin [6] Trong nghiên cứu này, khảo sát ảnh hưởng 2,4-D nồng độ mg/L kết hợp với KIN, BAP, TDZ nồng độ từ 0,25 – 1,5 mg/L để đánh giá khả sinh trưởng callus Khôi nhung sau tuần nuôi cấy 3.3.1 Ảnh hưởng 2,4-D kết hợp KIN đến khả sinh trưởng callus Các mẫu callus nuôi cấy mơi trường MS có bổ sung KIN nồng độ khác (0,25; 0,5; 1,0; 1,5 mg/L) kết hợp với mg/L 2,4-D để nghiên cứu khả sinh trưởng callus Khôi nhung Kết thu sau tuần ni cấy trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7 Ảnh hưởng 2,4-D nồng độ mg/L kết hợp KIN nồng độ khác đến khả sinh trưởng callus sau tuần nuôi cấy Chỉ số sinh trưởng 2,4-D BAP (mg/L) (mg/L) 1,00 0,25 169,9a 9,50b 7,68 1,00 0,50 87,3b 17,53a 13,20 Xốp, mọng nước màu trắng đục 1,00 1,00 70,04b 10,58b 9,03 Xốp, màu trắng đục 1,00 1,50 67,42b 9,73b 5,42 Khối lượng Khối lượng tươi (mg) khô (mg) Đặc điểm callus Xốp, mọng nước, màu trắng đục Xốp, mọng nước, màu trắng đục Ghi chú: Các chữ khác cột sai khác có mức ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p < 0,05 28 Hình 3.5 Ảnh hưởng 2,4-D nồng độ mg/L kết hợp KIN nồng độ khác đến khả phát sinh callus sau tuần nuôi cấy (A) mg/L 2,4-D 0,25 mg/L KIN, (B) 1,0 mg/L 2,4-D 0,5 mg/L KIN, (C) mg/L 2,4-D mg/L KIN, (D) 1,0 mg/L 2,4-D 1,5 mg/L KIN Kết nghiên cứu cho bảng 3.7 cho thấy, mơi trường MS có bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D 0,5 mg/L KIN, callus sinh trưởng tốt sau tuần nuôi cấy (chỉ số sinh trưởng đạt cao 13,2; khối lượng tươi đạt 258,2 mg/mẫu khối lượng khơ đạt 17,53 mg/mẫu) với callus có màu trắng đục, xốp, mọng nước (hình 3.5B) Trên mơi trường có kết hợp 1,0 mg/L 2,4-D với nồng độ KIN khác khả tạo callus Đặc biệt, môi trường bổ sung tổ hợp 1,0 mg/L 2,4-D 1,5 mg/L KIN, KIN nồng độ cao, sinh trưởng callus bị ức chế, sinh trưởng (chỉ số sinh trưởng đạt 5,42; khối lượng tươi 106,6 mg/mẫu khối lượng khơ 9,73 mg/L) callus có màu trắng đục xốp mọng nước (Hình 3.5D) Như vậy, kết hợp 1,0 mg/L 2,4-D 0,5 mg/L KIN môi trường nuôi cấy mang lại hiệu tốt cho sinh trưởng callus Khôi nhung in vitro ảnh hưởng tìm thấy tương tự nhiều đối tượng nghiên cứu khác Nghiên cứu Trương Thị Phương Lan cs (2018) cho thấy, kết nghiên cứu môi trường 29 nuôi cấy đến sinh trưởng callus Nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) có mơi trường ni cấy callus thích hợp mơi trường có bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D kết hợp với 1,5 mg/L KIN với kích thước trung bình đạt 1,564 cm, khối lượng tươi đạt 0,904 g khối lượng khô callus đạt 0,084 g [9] 3.3.2 Ảnh hưởng 2,4-D BAP đến khả sinh trưởng callus Các mẫu callus nuôi cấy môi trường MS có bổ sung BAP nồng độ khác (0,25; 0,5; 1; 1,5 mg/L) kết hợp với mg/L 2,4-D để nghiên cứu khả sinh trưởng callus Khôi nhung Kết thu sau tuần ni cấy trình bày bảng 3.8 Bảng 3.8 Ảnh hưởng 2,4-D nồng độ mg/L kết hợp BAP nồng độ khác đến khả sinh trưởng callus sau tuần nuôi cấy Chỉ số sinh trưởng 2,4-D BAP (mg/L) (mg/L) tươi (mg) khô (mg) 1,00 0,25 169,9a 12,72a 8,8 1,00 0,50 87,3b 7,62ab 4,49 Xốp, mọng nước, màu trắng đục 1,00 1,00 70,04b 5,28b 3,49 Xốp, mọng nước, màu trắng đục 1,00 1,50 67,42b 4,43b 3,2 Xốp, mọng nước, màu trắng đục Khối lượng Khối lượng Đặc điểm callus Xốp, mọng nước, màu trắng đục Ghi chú: Các chữ khác cột sai khác có mức ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p < 0,05 30 Hình 3.6 Ảnh hưởng 2,4-D nồng độ mg/L kết hợp BAP nồng độ khác đến khả phát sinh callus sau tuần nuôi cấy (A) mg/L 2,4-D 0,25 mg/L BAP, (B) 1,0 mg/L 2,4-D 0,5 mg/L BAP, (C) mg/L 2,4-D mg/L BAP, (D) 1,0 mg/L 2,4-D 1,5 mg/L BAP Kết nghiên cứu cho thấy, 2,4-D nồng độ mg/L kết hợp BAP có ảnh hưởng đến khả phát sinh callus Khi nồng độ BAP tăng từ 0,25 – 1,5 mg/L kết hợp với 1mg/ L 2,4-D có xu hướng làm giảm khả sinh trưởng callus Sự suy giảm sinh trưởng callus thể qua suy giảm khối lượng tươi khô Callus sinh trưởng tốt xác định nồng độ BAP 0,25 mg/ L kết hợp với mg/L 2,4-D thông qua khối lượng tươi khô callus đạt 169 mg 12,72 g Khi nồng độ BAP tăng lên đến 1,5 mg/L làm suy giảm khả sinh trưởng của callus đáng kể thông qua suy giảm khối lượng tươi khơ có giá trị là: 67,42 mg 4,43 mg (bảng 3.8) Tương tự, suy giảm khối lượng tươi khô callus nồng độ BAP tăng lên số sinh trưởng callus giảm dần Kết nghiên cứu cho thấy, nồng độ BAP tăng từ 0,25 – 1,5 mg/L kết hợp với mg/L 2,4-D, đặc điểm hình thái callus 31 có xu hướng thay đổi nồng độ 0,5 mg/L BAP có đặc điểm xốp, bớt mọng nước, màu trắng đục so với nồng độ BAP khác (Hình 3.6) 3.3.3 Ảnh hưởng 2,4-D TDZ lên khả sinh trưởng callus Các mẫu callus nuôi cấy môi trường MS có bổ sung BAP nồng độ khác (0,25; 0,5; 1; 1,5 mg/L) kết hợp với mg/L 2,4-D để nghiên cứu khả sinh trưởng callus Khôi nhung Kết thu sau tuần ni cấy trình bày bảng 3.9 2,4-D TDZ (mg/L) (mg/L) Khối lượng tươi (mg) 1,00 0,25 63,51 1,00 0,50 1,00 1,00 a Khối lượng khô (mg) a Chỉ số sinh Đặc điểm callus trưởng Xốp, mọng nước, màu 6,76 3,92 64,13a 6,61a 3,96 Xốp, mọng nước, màu trắng xám 1,00 69,01a 6,36a 4,26 Xốp, màu trắng vàng 1,50 65,93a 5,99a 4,07 Xốp, mọng nước, màu trắng xám trắng đục Bảng 3.9 Ảnh hưởng 2,4-D nồng độ mg/L kết hợp TDZ nồng độ khác đến khả sinh trưởng callus sau tuần nuôi cấy Ghi chú: Các chữ khác cột sai khác có mức ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p < 0,05 32 Hình 3.7 Ảnh hưởng 2,4-D nồng độ mg/L kết hợp TDZ nồng độ khác đến khả phát sinh callus sau tuần nuôi cấy (A) mg/L 2,4-D 0,25 mg/L TDZ, (B) 1,0 mg/L 2,4-D 0,5 mg/L TDZ, (C) mg/L 2,4-D mg/L TDZ, (D) 1,0 mg/L 2,4-D 1,5 mg/L TDZ Kết nghiên cứu cho thấy, 2,4-D nồng độ mg/L kết hợp TDZ có ảnh hưởng đến khả phát sinh callus Khi nồng độ TDZ tăng từ 0,25 – 1,00 mg/L kết hợp với 1mg/ L 2,4-D có xu hướng làm tăng khả sinh trưởng callus Sự tăng lên sinh trưởng callus thể qua gia tăng khối lượng tươi khô Callus sinh trưởng tốt xác định nồng độ TDZ 1,00 mg/ L kết hợp với mg/L 2,4-D thông qua khối lượng tươi khô callus đạt 69,01 mg/mẫu 6,36 mg/mẫu Khi nồng độ TDZ tăng lên đến 1,5 mg/L làm suy giảm sinh trưởng của callus thông qua suy giảm khối lượng tươi khơ có giá trị 65,93 mg/mẫu 5,99 mg/mẫu Tương tự, gia tăng khối lượng tươi khô callus nồng độ TDZ tăng lên 1,00 mg/L số sinh trưởng callus tăng dần (bảng 3.9) Kết nghiên cứu cho thấy, nồng độ TDZ tăng từ 0,25 – 1,50 mg/L kết hợp với 1mg/ L 2,4-D, đặc điểm 33 hình thái callus có xu hướng thay đổi Tại nồng độ 0,25 - 0,5 mg /L TDZ, callus có đặc điểm xốp, mọng nước, màu trắng xám Đặc điểm callus xốp, màu trắng vàng không mọng nước quan sát nồng độ 1,00 mg/LTDZ Khi nồng độ TDZ tăng lên 1,5 mg/L, đặc điểm hình thái bắt đầu chuyển sang trạng thái xốp, màu trắng xám mọng nước (hình 3.7) 3.4 Xác đinh hàm lượng hàm lượng polyphenol tanin tổng cao chiết callus Khôi nhung Hàm lượng polyphenol tannin tổng (tính theo chuẩn acid gallic) có mg mẫu xây dựng từ phương trình hồi quy y = 0,0028x + 0,0164 trình bày Bảng 3.10 Bảng 3.10 Hàm lượng polyphenol tannin tổng cao chiết callus Khơi nhung tính theo đường chuẩn acid gallic Hàm lượng Hàm lượng polyphenol tổng Hàm lượng polyphenol không liên kết với casein tannin tổng (µg GAE/g) (µg GAE/g) (µg GAE/g) 7241,4 6349,9 891,5 Polyphenol nhóm hợp chất lớn bao gồm nhiều nhóm hợp chất flavonoid, tannin, coumarin, acid phenolic, stilben, lignan… Trong đó, flavonoid tannin hai nhóm hợp chất biết đến nhiều với tác dụng sinh học phổ rộng Kết định lượng polyphenol tannin tổng cho thấy callus Khơi nhung có nhóm hợp chất tannin, hàm lượng tannin tổng trung bình chiếm 12,31% hàm lượng polyphenol tổng Tannin thuộc nhóm hợp chất polyphenol ý nghiên cứu từ lâu, nghiên cứu trước chứng minh tannin nhóm hợp chất có tác dụng sinh học phổ rộng Một số tác dụng sinh học tannin kháng oxy hoá, kháng khuẩn, kháng viêm, chống stress oxy hoá, ngăn chặn peroxyl hoá lipid màng tế bào, kháng ung thư, kháng ung thư, chống viêm loét dày, bảo vệ dày, giảm lipid máu, … Kết hợp với kết thu từ nghiên cứu cho thấy callus Khơi nhung nguồn dược liệu tiềm để sản suất tanin quy mô lớn tác dụng theo hướng 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Trên kết nghiên cứu, rút kết luận sau: - Nuôi cấy callus ảnh hưởng chất ĐHST auxin điều kiện in vitro, mơi trường ni cấy MS có bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D môi trường tốt cho sinh trưởng callus Khôi nhung Chỉ số sinh trưởng đạt 10,25; khối lượng tươi đạt 204,9 mg/mẫu khối lượng khô đạt 13,8 mg/mẫu, sau tuần nuôi cấy - Nuôi cấy callus ảnh hưởng chất ĐHST cytokinin điều kiện in vitro, mơi trường ni cấy MS có bổ sung 0,50 mg/L TDZ môi trường tốt cho sinh trưởng callus Khôi nhung Chỉ số sinh trưởng đạt 8,42; khối lượng tươi đạt 13,63 mg/mẫu khối lượng khô đạt 6,38 mg/mẫu, sau tuần nuôi cấy - Mơi trường MS có bổ sung auxin kết hợp với cytokinin, mơi trường có bổ sung mg/L 2,4-D kết hợp 0,5 mg/L KIN môi trường tốt sinh trưởng callus Khôi nhung Chỉ số sinh trưởng đạt 13,20; khối lượng tươi đạt 258,20 mg/mẫu khối lượng khô đạt 17,53 mg/mẫu, sau tuần nuôi cấy - Cao chiết ethanol 70% từ callus Khôi nhung có hàm lượng polyphenol tannin tổng tương ứng 7241,4 μg/g 891,5 μg/g bột callus khô Đề nghị Cây Khôi nhung thuốc có giá trị, chúng tơi xin đề nghị tiếp tục nghiên cứu điều kiện, môi trường nuôi cấy tế bào Khôi nhung môi trường lỏng hệ lên men (bioreactor) 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ Y tế (2009), “Dược điển Việt Nam (III), (IV), (V)”, Nxb Y HỌC Huỳnh Văn Biết, Nguyễn Thị Ngọc Phương, Nguyễn Thị Thanh Nga, Trương Quang Toản Phùng Võ Cẩm Hồng (2020), Phân tích thành phần hóa thực vật xác định khả chống oxy hóa kháng khuẩn dịch chiết từ Khôi nhung (Ardisia silvestris Pitard), Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển, 19(4), 28-35 Lê Văn Chi (1992), Cách sử dụng chất điều hoà sinh trưởng vi lượng hiệu cao, Nxb Khoa học – kỹ thuật, Hà Nội Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam tập, Nxb Y học Hà Nội tr.1223 Trương Thị Linh Hà (2023), Nghiên cứu nuôi cấy callus khôi nhung (Ardisia silvestris Pit.), Luận văn thạc sỹ chuyên nghành Sinh học thực nghiệm, trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng Lê Văn Hồng (2008), Cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật, Đại học Đà Nẵng Trần Huy Hoàng, Phạm Văn Hiển, Đặng Trường Giang, Nguyễn Hoàng Ngân, Vũ Bình Dương, Phạm Quốc Bình (2017), Xây dựng phương pháp định lượng polyphenol toàn phần đài hoa bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.) quang phổ UV-VIS”, Tạp chí y-dược học qn sự, số 8-2017 Đồn Thi Thu Hương, Nguyễn Văn Việt, Nguyễn Thị Huyền, Trần Việt Hà (2019) Hồn thiện quy trình nhân giống khơi tía (Ardisia sylvestris Pitard) kỹ thuật ni cấy in vitro, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Lâm nghiệp, số 1, Tr 25-31 Trương Thị Phương Lan, Lê Thị Anh Thư, Nguyễn Thị Hà Ngân (2018), Thăm dò ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng callus nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe), Tạp chí khoa học công nghệ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 12, Số 36 10 Nguyễn Thị Nhật Linh (2017), Nghiên cứu nuôi cấy rễ thứ cấp sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et grushv) khảo sát ảnh hưởng số elicitor lên tích lũy saponin, Luận án Tiến sĩ ngành Sinh lý học thực vật, Đại học Khoa học Huế.37 11 Nguyễn Bá Lộc (2006), Giáo trình chất điều hồ sinh trưởng thực vật, Khoa Sinh, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế 12 Nguyễn Hồng Lộc (2011), Ni cấy mơ tế vào thực vật, Nxb Đại học Huế 13 Đỗ Tất Lợi (2005), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Hồng Đức, tr.481482 14 Nguyễn Thành Long (2019), Khảo sát hàm lượng tannin hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol từ Khôi nhung (Ardisia silvestris Pitard) bán đảo Sơn Trà, Thành phố Đà Nẵng, Khoá luận tốt nghiệp ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm 15 Nguyễn Hữu Nhân (2021), Nghiên cứu ảnh hưởng số chất kích kháng lên tích lũy eurycomanone ni cấy huyền phù tế bào bách bệnh (Eurycoma longifolia JACK), Luận án Tiến sĩ Sinh học, Đại học khoa học huế 16 Ngô Xuân Mạnh, Lương Thị Hà, Ngô Xuân Trung (2015), Hàm lượng polyphenol khả chống oxy hóa chúng số loại nấm ăn, Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 13, số 2: 272-278 17 Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, Tr 28-54 18 Hoàng Tấn Quảng, Phạm Thị Diễm Thi, Trần Thuý Lan, Phạm Mai Thu Thuỷ, Vũ Đức Hoàng, Phan Thị Ánh Kim (2021), Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng callus giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino) – Một dược liệu có giá trị, Tạp chí khoa học Đại học Huế, Khoa học Tự nhiên, Tập 130, số 1C, 127137 37 19 Lê Anh Sơn, Đỗ Thị Hà, Vũ Thị Diệp, Đậu Bá Thìn, Nguyễn Thị Thảo (2017), Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính chống oxy hóa gây độc tế bào ung thư dịch chiết Khơi tía, Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 6/2017, Trang 346 – 351, 201 20 Sách đỏ Việt Nam (Phần II: Thực vật), Phần 1(2007), NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội tr 21 21 Phạm Bá Tuyến (2014), Nghiên cứu tác dụng chế phẩm Hpmax điều trị loét hành tá tràng có Helicobacter pylori, Đại học Y Hà Nội.38 22 Nguyễn Văn Uyển (1996), Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 23 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, Thực phẩm - Xác định hàm lượng tannin - Phương pháp chuẩn độ, Thuyết minh dự thảo tiêu chuẩn quốc gia 24 Vũ Văn Vụ (2009), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục Việt Nam, Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 25 Fui Joo Bong, Nelson Jeng Yeou Chear, Surash Ramanathan, Nethia MohanaKumaran, Sreeramanan Subramaniam, Bee Lynn Chew (2021), The development of callus and cell suspension cultures of Sabah Snake Grass (Clinacanthus nutans) for the production of flavonoids and phenolics, Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 33 26 Bourgaud F., Gravot A., Milesi S., Gontier E (2001), Production of plant secondary metabolites: a historical perspective, Plant Science, 161(5), pp 839-851 27 C Veersham (2004), In Elicitation: Medicinal Plant Biotechnology, CBS Publisher, India 270-293 28 Fett-Neto A.G., Zhang W.Y., DiCosmo F (1994), Kinetics of taxol production, growth and nutrient uptake in cell suspensions of Taxus cuspidate, Biotechnology and Bioengineering, 44, pp 205-210 29 Jinxiang Ai, Jiayi Song, Zhenan Yan, Zhichao Wang, Wenqian Chen, Yuhuan Wu, Yanyan Wang, Leilei Pan, Yutao Xu, Peng Liu (2022), Effects of Exogenous Melatonin 38 on Physiological Response and DNA Damage of Ardisia mamillata and A crenata Under Lead Stress, Chinese Bulletin of Botany, 57(2): 171-181 30 Murashige T., Skoog F (1962), A revised medium for rapid growth andbio assays with tobacco tissue cultures, Physiol Plant, 15(3), pp 473-497 31 Namdeo A.G (2007), Plant cell elicitation for production of secondary metabolites: A review, Pharmacognosy Reviews, 1(1), pp 69-79 32 Nguyen Thi Quynh, Le Trung Hieu, and Pham Thanh (2022), The effects of plant growth regulators on phenolic and flavonoid content in callus cultures of Ardisia silvestris Pitard, Plant cell biotechnology and molecular biology, 1-5.39 33 S Deepthi, K Satheeshkumar (2016), Enhanced camptothecin production induced by elicitors in the cell suspension cultures of Ophiorrhiza mungos Linn, Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), vol 124, pp 483–493 34 Tran Minh Duc, Nguyen Thi Quynh and Pham Thanh (2021), Regeneration of plant via callus-mediated organogenesis from leaf, petiole, and inter nodal segment of Ardisia silvestris Pitard, Propagation of Ornamental Plants, Vol 21, no 3, 96-103 35 X.L Liu, Y.Q Hao, L Jin, Z.J Xu, T.A McAllister, Y Wang (2013), Anti-Escherichia coli O157: H7 properties of purple prairie clover andsainfoin condensed tannins, Molecules, 18, pp 2183-2199 39 PHỤ LỤC Phụ lục Bảng thành phần môi trường Murashige - Skoog (MS, 1962) Hóa chất Stock Nồng độ (mg/l) Nồng độ Dung tích dùng (g/1000 mL) cho KNO3 1900 95 KH2PO4 170 8,5 NH4NO3 1650 82,5 MgSO4.7H2O 370 18,5 CaCl2.2H2O 440 44 H3BO3 6,2 0,62 MnSO4.4H2O 22,3 1,69 CoCl2.6H2O 0,025 0,0025 CuSO4.5H2O 0,025 0,0025 ZnSO4.7H2O 8,6 1,06 Na2MoO4.2H2O 0,25 0,025 KI 0,83 0,083 FeSO4.7H2O 27,8 2,78 20 mL MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 10 mL 10 mL 10 mL Na - EDTA 37,3 4,09 Myo - inositol 100 10 Thiamine – HCl 0,1 0,01 Pyridoxine – HCl 0,5 0,05 Nicotinic axit 0,5 0,05 0,2 Glycine a 10 mL Phụ lục Máy cô quay Phụ lục Cao chiết tanin từ callus Khôi nhung b