Phân tích khác biệt di truyền của các quần thể cây khôi nhung (ardisia silvestris pitard) bằng chỉ thị phân tử rapd

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN TÍCH KHÁC BIỆT DI TRUYỀN CỦA CÁC QUẦN THỂ CÂY KHÔI NHUNG (Ardisia silvestris Pitard) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD NGUYỄN HOÀNG UYÊN Đà Nẵng, năm 2023 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN TÍCH KHÁC BIỆT DI TRUYỀN CỦA CÁC QUẦN THỂ CÂY KHÔI NHUNG (Ardisia silvestris Pitard) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD Ngành: Cơng nghệ sinh học Khóa: 2019- 2023 Sinh viên: Nguyễn Hoàng Uyên Người hướng dẫn: TS Trần Quang Dần Đà Nẵng, năm 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu tác giả chưa công bố công trình khác trước Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Người cam đoan Nguyễn Hoàng Uyên i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh- Môi trường, Trường đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Quang Dần - người trực tiếp hướng dẫn tận tình dạy, hướng dẫn, định hướng tư duy, giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Sinh - Môi trường giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình tơi thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ tơi vật chất lẫn tinh thần để tơi đạt kết tốt Đà Nẵng, ngày 15 tháng 05 năm 2023 Sinh viên thực Nguyễn Hoàng Uyên ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Nội dung nghiên cứu 4.1 Ảnh hưởng khối lượng mẫu thời gian ủ đến chất lượng DNA tổng số Khôi nhung 4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ gắn mồi đến chất lượng phản ứng PCR 4.3 Xác định khác biệt di truyền quần thể Khôi nhung thị phân tử RAPD CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu khôi nhung 1.1.1 Đặc điểm thực vật học 1.1.2 Giá trị dược liệu 1.2 Hiện trạng nghiên cứu đa dạng di truyền giá trị dược liệu chi Ardisia 1.2.1 Trong nước 1.2.2 Ngoài nước 1.3 Các thị phân tử dựa phản ứng PCR nghiên cứu đa dạng di truyền 1.3.1 Kỹ thuật RAPD 1.3.1.1 Cơ sở kỹ thuật RAPD iii 1.3.1.2 Ứng dụng kỹ thuật RAPD 1.3.2 Kỹ thuật ISSR 11 1.3.3 Kỹ thuật AFLP 12 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Vật liệu nghiên cứu 13 2.2 Phạm vi nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 13 2.3.1 Tách chiết DNA tổng số 13 2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu 13 2.3.3 Điện di 16 2.3.4 Phân tích khác biệt di truyền quần thể Khôi nhung 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 Ảnh hưởng khối lượng mẫu thời gian ủ đến chất lượng DNA tổng số Khôi nhung 18 3.1.1 Ảnh hưởng khối lượng mẫu đến chất lượng DNA tổng số Khôi nhung 18 3.1.2 Khảo sát thời gian ủ CTAB trình tách chiết 18 3.2 Khảo sát nhiệt độ gắn mồi phản ứng PCR 21 3.3 Xác định khác biệt di truyền quần thể Khôi nhung thị phân tử RAPD 23 3.3.1 Tính đa hình mồi RAPD 23 3.3.2 Sự khác biệt di truyền quần thể Khôi nhung 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28 Kết luận 28 Kiến nghị 28 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Cs Cộng CI Chloroform: isoamylalcohol TAE Tris- acetate- EDTA TBE Tris- borate- EDTA TE Tris- EDTA CTAB Cetyltrimethylammonium bromide RAPD Random Amplified Polymorphic DNA PIC Polymorphic Information Content v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Tên bảng Trang 2.1 Thông tin mẫu khôi nhung sử dụng nghiên cứu 13 2.2 Trình tự đoạn mồi RAPD sử dụng nghiên cứu 16 3.1 Hàm lượng DNA tổng số, giá trị OD 260/ 280 OD 160/ 230 21 tách theo điều kiện tốt khảo sát 3.2 Các số đánh giá tính đa hình quần thể 11 mẫu Khôi nhung 23 khuếch đại bới 04 mồi RAPD 3.3 Hệ số tương đồng di truyền 11 mẫu Khôi nhung khuếch đại thị RAPD vi 26 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cây Khơi nhung ngồi tự nhiên 3.1 Điện di DNA tổng số tách chiết với khối lượng mẫu khác 18 3.2 Điện di DNA tổng số tách chiết với thời gian ủ khác 19 3.3 DNA tổng số mẫu sử dụng phản ứng PCR 20 3.4 Khảo sát nhiệt độ gắn mồi RAPD 22 3.5 Điện di mẫu Khôi nhung mồi RAPD OPA08 24 3.6 Điện di mẫu Khôi nhung mồi RAPD OPB18 24 3.7 Điện di mẫu Khôi nhung mồi RAPD OPC11 25 3.8 Điện di mẫu Khôi nhung mồi RAPD B28 26 3.9 Cây phân loại di truyền 11 mẫu Khôi nhung nghiên cứu khuếch 27 đại thị RAPD vii TĨM TẮT Khơi nhung (Ardisia silvestris Pitard) thuốc có giá trị điều trị bệnh Ở Việt Nam, phân bố số nơi nghiên cứu đa dạng di truyền Khôi nhung hạn chế Trong nghiên cứu này, khác biệt mặt di truyền quần thể Khôi nhung phân bố ở: Sơn Trà, Hà Giang in vitro đánh giá thị RAPD DNA tách chiết phương pháp CTAB với khối lượng mẫu 30 mg thời gian ủ 90 phút Các mồi lựa chọn cho phân tích bắt cặp tốt nhiệt độ 35℃ Phản ứng PCR thực với mồi RAPD cho băng đa hình Có tổng số 103 băng khuếch đại từ mồi RAPD, với tỷ số băng đa hình đạt 62,5% Hệ số đa dạng PIC mồi thấp 0,3752 (mồi OPC11) cao 0,4742 (mồi OPA08), hệ số đa dạng trung bình đạt 0,3928 Biểu đồ hình thể mối quan hệ di truyền 11 mẫu Khơi nhung phân tích qua thị RAPD, biểu đồ di truyền quần thể Khôi nhung dựa thị RAPD cho thấy quần thể Khôi nhung tỉnh Hà Giang bán đảo Sơn Trà nghiên cứu phân làm nhánh riêng biệt với hệ số tương đồng di truyền khoảng 0,38- 0,85 Vậy quần thể Khôi nhung có khác biệt di truyền với Từ chìa khóa: RAPD, Ardisia silvestris Pitard, Khơi nhung, CTAB viii ảnh hưởng thời gian ủ đệm chiết CTAB đến nồng độ DNA tiến hành khảo sát thời gian: 60 phút, 75 phút, 90 phút 120 phút Kết cho thấy, thời gian ủ có ảnh hưởng đến hiệu suất tách DNA tổng số khôi nhung Trong thời gian ủ 60 phút 75 phút vạch băng mờ, so với Ladder thấy nồng độ DNA không cao Tuy nhiên, thời gian ủ 90 phút, có vạch băng sáng, rõ nghiệm thức lại, với nồng độ DNA so với Ladder, nồng độ DNA khoảng 80 ng Ở thời gian 120p nồng độ DNA cao khơng Vậy thời gian ủ 60 phút 75 phút thời gian khơng đủ để CTAB hoạt động giải phóng lượng DNA tổng số hoàn toàn tế bào mẫu Khôi nhung, CTAB tạo phức với DNA polysaccharide chưa cao nên hàm lượng DNA thời gian thấp Còn thời gian 90 phút thời gian thích hợp cho CTAB hoạt động, tạo phức CTAB với DNA polysaccharide hiệu nên vạch băng DNA tổng số thời gian 90 phút sáng rõ Trong nghiên cứu thuốc Đảng sâm Phạm Thanh Huyền (2017) hay mẫu ngô nghiên cứu Trương Thu Hằng (2013) ủ CTAB 90 phút nhiệt độ 65℃ Còn số dòng lúa nghiên cứu Nguyễn Tiến Dũng cộng (2021), mẫu tách chiết ủ CTAB với thời gian 30 phút nhiệt độ 65℃ Vậy thời gian ủ CTAB tùy thuộc vào loại mẫu khác Với Khôi nhung thời gian ủ 90 phút 65℃ Hình 3.2 Điện di DNA tổng số tách chiết với thời gian ủ khác M, Hypper Ladder 1Kb; 1, 60 phút; 2, 75 phút; 3, 90 phút; 4, 120 phút 3.1.3 Tách chiết DNA tổng số mẫu Khôi nhung 19 11 mẫu Khôi nhung tiến hành tách chiết DNA tổng số phương pháp CTAB với điều kiện khối lượng mẫu thời gian ủ đệm chiết khảo sát Hàm lượng DNA tổng số tách với khối lượng mẫu đầu vào 30 mg thời gian ủ đệm chiết 90 phút Qua hình 3.4 cho thấy, hàm lượng DNA tổng số thu từ mẫu cao, vạch băng sáng dày Điều thể qua bảng 3.1 cho thấy, hàm lượng DNA thu mẫu cao, mẫu IV1 có nồng độ DNA thấp 61.8 ng/µl Ở mẫu ST2 có nồng độ DNA cao 300.8 ng/µl Tỷ lệ OD 260/280 mẫu cao, điều chứng tỏ mẫu tách chiết tạp protein Tỷ lệ OD 260/230 mẫu tương đối thấp, cho thấy nhiều tạp bẩn carbonhydrate, polysaccharide, phenol,… Hình 3.3 DNA tổng số mẫu sử dụng phản ứng PCR 1, ST1; 2, ST2; 3, ST3; 4, ST4; 5, STd; 6, H1; 7, H2; 8, H3; 9, IV1; 10, IV2;11, IV3 20 Bảng 3.1 Hàm lượng DNA tổng số, giá trị OD 260/280 OD 260/230 tách theo điều kiện tốt khảo sát Mẫu Nucleic acid (ng/µl) 260/280 260/230 ST1 192.2 2.29 1.05 ST2 300.8 1.97 0.98 ST3 103.3 2.14 0.93 ST4 187.2 1.95 0.69 STd 156.5 2.09 0.95 H1 397.7 1.18 0.88 H2 80.0 2.52 0.74 H3 122.2 2.30 0.95 IV1 61.8 3.09 1.35 IV2 166.5 2.32 1.09 IV3 76.2 2.93 0.67 3.2 Khảo sát nhiệt độ gắn mồi phản ứng PCR 10 mồi lựa chọn cho nghiên cứu có nhiệt độ nóng chảy mồi khác 32℃, 36℃ 40℃ Trong phản ứng PCR, nhiệt độ gắn mồi phải mức nhiệt độ nóng chảy thấp mồi 3℃ Vì vậy, nghiên cứu thực khảo sát nhiệt độ gắn mồi với nghiệm thức nhiệt độ 33℃, 35℃ 37℃ với tất 10 mồi Qua hình 3.5 cho thấy, kết nhiệt độ 35℃ gắn mồi hiệu so với 33℃ 37 ℃ Vạch băng 37℃ mờ, băng xuất thấp Cịn nhiệt độ 35℃ vạch băng rõ nét, sáng xuất nhiều băng so với nhiệt độ 33℃ 37℃ Chứng tỏ, nhiệt độ gắn mồi 35℃ nhiệt độ thích hợp sử dụng chạy phản ứng RAPD- PCR nghiên cứu Kết tương đồng với nghiên cứu A K Lee cs (2003), tác giả sử dụng 10 mồi tương tự chạy phản ứng PCR với nhiệt độ gắn mồi 35℃ nghiên cứu 21 Hình 3.4 Khảo sát nhiệt độ gắn mồi RAPD M The Fastgene DNA ladder NIPPON 1kb; 1, ST1; 2, ST2; 3, ST3; 4, ST4; 5, STd; 6, H1; 7, H2; 8, H3; 9, IV1; 10, IV2; 11, IV3 22 3.3 Xác định khác biệt di truyền quần thể Khôi nhung thị phân tử RAPD 3.3.1 Tính đa hình mồi RAPD Dựa vào kết phân tích hình ảnh điện di sản phẩm PCR với 11 mẫu Khôi nhung mồi RAPD cho thấy, mồi cho băng đa hình (Bảng 3.2 bảng 3.3) Có tổng số 103 băng khuếch đại từ mồi RAPD, với tỷ số băng đa hình đạt 62,5% Tỷ lệ đa hình cao chứng tỏ sử dụng thị RAPD đạt hiệu phân tích đa dạng di truyền Khôi nhung Bảng 3.2 Các số đánh giá tính đa hình quần thể 11 mẫu Khôi nhung khuếch đại 04 mồi RAPD STT Tên mồi Tổng số locus Số băng Số locus đa hình PBB (%) 4 13 3.25 ±1.5 27 35 33 103 25.75 ±12.31 2 1.75 ±2.38 50 50 50 100 OPA08 OPB18 OPC11 B28 Tổng cộng Số trung bình Độ lệch chuẩn 62.5 Phạm vi kích thước băng (bp) 250- 1500 750- 1500 250- 3000 1200 PIC 0.4742 0.3254 0.3752 0.3967 0.3928 ±0.06 Ghi chú: PBB: tỷ lệ phần trăm locus đa hình; PIC: hệ số đa hình di truyền Qua bảng 3.2 cho thấy, có 13 locus RAPD với 103 alen Trong số trung bình mồi RAPD phát 3,25 Trung bình số alen mồi đạt 25,75; thấp mồi B28 với alen cao mồi OPB18 với 35 alen Hệ số PIC dùng làm thước đo tính đa hình alen locus RAPD Theo Boisten cs (1980), số PIC > 0,5 mồi sử dụng cho kết đa hình cao, ngược lại số PIC nằm khoảng 0,25 ≤ PIC ≤ 0,5 cho kết đa hình trung bình với số PIC < 0,25 kết đa hình thấp Hệ số đa dạng PIC mồi thấp 0,3752 (mồi OPC11) cao 0,4742 (mồi OPA08), hệ số đa dạng trung bình đạt 0,3928 Qua thấy mồi cho đa hình với 11 mẫu Khơi nhung trung bình, mồi có ý nghĩa việc đánh giá đa dạng di truyền mẫu nghiên cứu 23 Hình 3.5 Điện di mẫu Khôi nhung mồi RAPD OPA08 M, The Fastgene DNA ladder NIPPON 1kb; 1, ST1; 2, ST2; 3, ST3; 4, ST4; 5, STd; 6, H1; 7, H2; 8, H3; 9, IV1; 10, IV2; 11, IV3 Hình 3.6 Điện di mẫu Khôi nhung mồi RAPD OPB18 M, The Fastgene DNA ladder NIPPON 1kb; 1, ST1; 2, ST2; 3, ST3; 4, ST4; 5, STd; 6, H1; 7, H2; 8, H3; 9, IV1; 10, IV2; 11, IV3 24 Hình 3.7 Điện di mẫu Khơi nhung mồi RAPD OPC11 M, The Fastgene DNA ladder NIPPON 1kb; 1, ST1; 2, ST2; 3, ST3; 4, ST4; 5, STd; 6, H1; 7, H2; 8, H3; 9, IV1; 10, IV2; 11, IV3 Hình 3.8 Điện di mẫu Khơi nhung mồi RAPD B28 M, The Fastgene DNA ladder NIPPON 1kb; 1, ST1; 2, ST2; 3, ST3; 4, ST4; 5, STd; 6, H1; 7, H2; 8, H3; 9, IV1; 10, IV2; 11, IV3 3.3.2 Sự khác biệt di truyền quần thể Khôi nhung Cây phân loại xây dựng dựa hệ số tương đồng di truyền Jaccard kiểu phân nhóm UPGMA Từ kết phân tích hình ảnh điện di RAPD, nhận thấy 11 mẫu Khôi nhung nghiên cứu khuếch đại mồi RAPD phân thành nhánh riêng biệt với hệ số tương đồng nằm khoảng 0,38 - 0,85 (hình 3.7 bảng 3.3) 25 Sự khác biệt di truyền quần thể Khôi nhung xác định thông qua hệ số tương đồng di truyền biểu đồ hình Các quần thể có giá trị hệ số di truyền tương ứng gần đến khác biệt di truyền lớn, quần thể có hệ số di truyền giống tương ứng gần tới gần mặt di truyền (Trương Thị Hồng Hải & cs, 2018) Nhóm I bao gồm mẫu Khôi nhung với mức độ tương đồng di truyền từ 0,77 1,00 Gồm mẫu ST1, ST3, ST4, STd, ST2, IV1, IV2 IV3, quần thể mẫu thu khu bảo tồn thiên nhiên Bán đảo Sơn Trà, Đà Nẵng in vitro quần thể có nguồn gốc chung từ Bán đảo Sơn Trà, Đà Nẵng nên khơng có khác biệt di truyền nhiều Trong nhóm lại phân chia thành nhóm Ia Ib, phân nhóm Ia bao gồm mẫu Khôi nhung mọc tự nhiên bán đảo Sơn Trà có hệ số di truyền 1,00, cịn nhóm Ib gồm mẫu in vitro có nguồn từ bán đảo Sơn Trà có hệ số di truyền khoảng 0,85 - 1,00 Nhóm II gồm mẫu Khôi nhung với mức độ di truyền 1,00 Gồm mẫu H1, H2 H3, mẫu có nguồn gốc tỉnh Hà Giang Các mẫu tỉnh Hà Giang khác biệt mặt di truyền so với quần thể Khơi nhung có nguồn gốc bán đảo Sơn Trà với hệ số di truyền 0,54 Kết phân tích biểu đồ di truyền quần thể Khôi nhung dựa thị RAPD cho thấy quần thể Khôi nhung nghiên cứu phân làm nhánh riêng biệt Điều chứng tỏ địa lý cách hàng trăm kilomet, quần thể Khôi nhung khu vực khơng có chung nguồn gốc, có khác biệt mặt di truyền 26 Bảng 3.3 Hệ số tương đồng di truyền 11 mẫu Khôi nhung khuếch đại thị RAPD ST1 ST2 ST3 ST4 STd H1 H2 H3 IV1 IV2 IV3 ST1 1.00 0.85 1.00 1.00 1.00 0.54 0.54 0.54 0.77 0.77 0.85 ST2 ST3 ST4 STd H1 H2 H3 1.00 0.85 0.85 0.85 0.54 0.54 0.54 0.92 0.92 0.85 1.00 1.00 0.46 0.46 0.38 1.00 0.46 1.00 0.46 1.00 1.00 0.38 0.92 0.92 1.00 1.00 1.00 1.00 0.54 0.54 0.54 0.77 0.77 0.85 1.00 1.00 0.54 0.54 0.54 0.77 0.77 0.85 1.00 0.54 0.54 0.54 0.77 0.77 0.85 1.00 1.00 1.00 0.46 0.46 0.38 IV1 IV2 IV3 Hình 3.9 Cây phân loại di truyền 11 mẫu Khôi nhung nghiên cứu khuếch đại thị RAPD 27 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kết phân tích cho thấy, tách chiết DNA phương pháp CTAB với điều kiện khảo sát với khối lượng mẫu đầu vào 30 mg thời gian ủ mẫu với đệm chiết 90 phút cho hàm lượng DNA tương đối cao, chưa sạch, lẫn tạp bẩn Ở nhiệt độ bắt cặp mồi 35℃ cho hiệu bắt cặp tốt Dựa vào kết phân tích hình ảnh điện di sản phẩm PCR với 11 mẫu Khôi nhung 10 mồi RAPD cho thấy, mồi chọn cho băng đa hình Có tổng số 103 băng khuếch đại từ mồi RAPD, với tỷ số băng đa hình đạt 62,5 Hệ số đa dạng PIC mồi thấp 0,3752 (mồi OPC11) cao 0,4742 (mồi OPA08), hệ số đa dạng trung bình đạt 0,3928 Hệ số đa dạng trung bình cho thấy việc sử dụng thị RAPD hồn tồn có khả đánh giá đa dạng di truyền quần thể Khơi nhung Biểu đồ hình thể mối quan hệ di truyền 11 mẫu Khơi nhung phân tích qua thị RAPD, biểu đồ di truyền quần thể Khôi nhung dựa thị RAPD cho thấy quần thể Khôi nhung nghiên cứu phân làm nhánh riêng biệt với hệ số tương đồng di truyền khoảng 0,38- 0,85 Có khác biệt di truyền quần thể Khôi nhung Kiến nghị Tiếp tục mở rộng nghiên cứu đặc điểm di truyền quần thể Khôi nhung 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bộ Khoa học Công nghệ, Sách đỏ Việt Nam, phần II: Thực vật, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, 2007 [2] Đỗ Tất Lợi, Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 2006 [3] Huỳnh Văn Biết, Nguyễn Thị Ngọc Phương, Nguyễn Thị Thanh Nga, Trương Quan Toản, Phùng Võ Cẩm Hồng, Phân tích thành phần hóa thực vật xác định khả chống oxy hóa kháng khuẩn dịch chiết từ khôi nhung (Ardisia silvestris Pitard), 2020, Tạp chí nơng nghiệp phát triển 19(4), 28- 35 [4] Ngơ Xn Bình, Nguyễn Tiến Dũng, Lã Văn Hiền, Nguyễn Đức Huy, Đào Minh Lệ, Cao Lệ Quyên, Trương Thanh Tùng, Bùi Tri Thức, Nguyễn Xuân Vũ, Sàng lọc tuyển chọn số dòng lúa chỉnh sửa gen GS3 CRISPR/Cas9, 2021, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 64(2), 60- 64 [5] Kiều Thị Dung, Nguyễn Huy Hoàng, Hồ Trung Lương, Lưu Cảnh Trung, Khuất Hữu Trung, “Đánh giá đa dạng di truyền loài quế Thanh Hóa thị RAPD”, 2016, Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam, 13(2), 39-44 [6] Huỳnh Kim Diệu, Phan Thị Tư, Đánh giá đa dạng di truyền tính kháng khuẩn Lược vàng (Callisia fragrans LINDL.), 2014, Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ [7] Trương Thu Hằng, Chọn tạo dịng ngơ chuyển gen kháng sâu (CryIAc) thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, 29, 3(2013), 17- 29 [8] Lê Thị Thanh Hương, Nguyễn Thị Quỳnh, Điều tra thực vật sử dụng làm thuốc chữa bệnh dày theo kinh nghiệm cộng đồng dân tộc tỉnh Thái Nguyên, 2020, Tạp chí Khoa học Công nghệ ĐHTN, 225(08), 209- 216 [9]Trương Thị Hồng Hải, Trần Bảo Ngà, Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn giống mướp hương Lufa cylindrica (L.) Roem) thị RAPD, 2018, Tạp chí Khoa học Đại học Huế, 127, 43- 51 29 [10] Phạm Thanh Huyền, Đinh Đoàn Long, Sử dụng thị ADN (RAPD-PCR) nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Đảng sâm góp phần định hướng cơng tác bảo tồn phát triển Việt Nam, 2017, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, 33, 1(2017), 32- 39 [11] Nguyễn Đức Thành, “ Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật”, 2014, Tạp chí Sinh học, 36(3), 265- 294 [12] Nguyễn Văn Giang, Vũ Ngọc Lan, Tống Văn Hải, “Nghiên cứu đa dạng di truyền khoai môn- sọ thị phân tử DNA”, 2012, Tạp chí khoa học Phát triển, 11, 1- [13] Lý Đức Long, Trần Thị Thu Hà, “Nghiên cứu đặc điểm sinh thái học hình thái lồi khơi tía (Ardisia silvestris Pitard) huyện Thạch An, Cao Bằng”, 2020, TNU journal of Science and Technology, 225(11), 201- 208 [14] Tôn Nữ Thị Quỳnh, Trương Thị Đẹp, Đặng Văn Sơn, Đa dạng nguồn tài nguyên thuốc Khu bảo tồn thiên nhiên Sơn Trà- TP Đà Nẵng, 2018, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 60(9), 20- 24 [15] Phạm Bá Tuyến, “ Nghiên cứu tác dụng chế phẩm HPmax điều trị loét hành tá tràng có Helicobacter pylori”, 2014, Luận án, Đại học Y Hà Nội [16] Phạm Thanh Huyền, Đinh Đoàn Long, “ Sử dụng thị DNA (RAPD- PCR) nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Đảng sâm góp phần định hướng cơng tác bảo tồn phát triển Việt Nam”, 2017, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y dược, 33(1), 32- 39 [17] Duc Tran Minh, Quynh Thi Nguyen, Thanh Pham, “ Regeneration of plants via callus- mediated organoogennesis from leaf, petiole and inter nodal segment of Ardisia silvestris Pitard”, 2021, Propagation of Ornamental Plants, 21(3), 96- 103 [18] Ae- Kyung Lee, Jeung Keun Suh, Mark Roh & Janet Slovin, Analysis of genetic relationship of Ardisia spp Using RAPD markers, 2003, Journal of Horticultural Science & Biotechnology, 78(1), 24- 28 [19] Joseph D Clarke, “Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) DNA minirprep for Plant DNA Isolation” , 2009, Cold spring harbor protocols 30 [20] John G K Williams, Anne R Kubelik, Kenneth J Livak, J Antoni Rafalski, Scott V Tingey, “DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are usefuls as genetic markers”, 1990, Nucleic acid Research, 18(22), 6531- 6535 [21] Kantipudi Nirmal Babu, Muliyar Krishna Rajesh, Kukkumgai Samsudeen, Divakaran Minoo, Erinjery Jose Suraby, Kallayan Anupama and Paul Ritto, “Randomly Amplified Polymorrphic DNA (RAPD) and Derived Techniques”, 2014, Molecular Plant Taxonomy: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 1115, 191- 209 [22] V M Shinde, K Dhalwal, K R Mahadik, K S Joshi and B K Patwardhan, “RAPD Analysis forr Determination of Components in Herbal Medicine”, 2007, eCAM, 4(S1), 21-23 [23] Shrisha Naik Bajpe, Kigga Kadappa Sampath Kumara, Ramachandra Kukkundoor Kini, “Genetic diversity of Embelia Species, Maesa indica and Solanacea sampled from western ghats of karnataka using DNA markers”, 2018, Life Science informatic Publications 31 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH Phụ lục Hypper Ladder 1kb Phụ lục The Fastgene DNA ladder NIPPON 1kb 32 Phụ lục 3: Hình thái quần thể Khơi nhung Hình 3.10 Hình thái Khơi nhung (A) Mẫu Khơi nhung kiểu bầu hình elip bán đảo Sơn Trà- TP Đà Nẵng; (B) Mẫu Khôi nhung kiểu hình mác bán đảo Sơn Trà- TP Đà Nẵng; (C) Mẫu Khôi nhung invitro; (D) Mẫu Khôi nhung tỉnh Hà Giang 33