(Luận văn) nghiên cứu tính đa dạng di truyền của cây ba kích tại quảng nam đà nẵng bằng chỉ thị phân tử rapd

a ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG LÊ HỒNG KHẨN lu an va n NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI tn to p ie gh TRUYỀN CỦA CÂY BA KÍCH TẠI w QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ d oa nl PHÂN TỬ RAPD ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Đà Nẵng – Năm 2018 n va ac th si b ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG LÊ HỒNG KHẨN lu an va n NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI tn to ie gh TRUYỀN CỦA CÂY BA KÍCH TẠI p QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ w d oa nl PHÂN TỬ RAPD ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Đà Nẵng – Năm 2018 n va ac th si i LỜI CAM ĐOAN Đề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền Ba kích Quảng NamĐà Nẵng thị phân tử” nhóm chúng tơi thực Mọi số liệu, hình ảnh, kết hồn tồn lấy từ thí nghiệm sau thực Các tài liệu có tìm sách, báo, tạp chí… nước giới đáng tin cậy xác Tác giả lu an va n Lê Hoàng Khẩn p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si ii LỜI CẢM ƠN Chúng em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Sinh học-Môi trường, Trường Đại học Sư phạm-Đại học Đà Nẵng tận tình giúp đỡ chúng em suốt năm học qua Đặc biệt, chúng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Minh Lý Th.S Vũ Đức Hoàng, người tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành tốt khố luận tốt nghiệp Cũng xin gửi lời cảm ơn đến Hội động vật FrankFurt hỗ trợ lu phần kinh phí để em thực đề tài tập thể lớp Cơng Nghệ Sinh học khố an n va 2014-2018 bên cạnh quan tâm giúp đỡ thời gian qua p ie gh tn to Một lần em xin chân thành cảm ơn! d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT V DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH VII MỞ ĐẦU lu an PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU n va 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY BA KÍCH to tn 1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.3 Phân bố p ie gh 1.1.2 Giá trị dược liệu nl w 1.1.4 Một số nghiên cứu đa dạng di truyền thành phần hóa học d oa Ba kích ngồi nước an lu 1.2 CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR TRONG u nf va NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN ll 1.2.1 Chỉ thị RAPD m oi 1.2.2 Kỹ thuật RAPD-SCAR z at nh 1.2.3 Kỹ thuật ISSR z PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 @ l gm 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 11 m co 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 11 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 12 an Lu 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 n va ac th si iv 2.2.1 Phương pháp đánh giá hình thái 12 2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA 13 2.2.2 Phương pháp điện di gel agarose 14 2.2.4 Phương pháp phân tích di truyền kỹ thuật RAPD 15 2.2.5 Phân tích sản phẩm phản ứng PCR-RAPD 15 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 3.1 ĐÁNH GIÁ HÌNH THÁI 17 3.2 TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ 19 lu an 3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN BẰNG CHỈ THỊ PCR- n va RAPD 20 tn to 3.4 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN GIỮA CÁC MẪU BA p ie gh KÍCH 25 w KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28 d oa nl TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT lu an microgram µL microliter AFLP amplified fragment length polymorphism AP-PCR arbitrary primed polymerase chain reaction bp base pair CAPS cleaved amplified polymorphics sequences cs cộng CTAB cetyltrimethyl-ammonium bromide DAF DNA amplification fingerprinting n va µg p ie gh tn to deoxyribonucleic acid nl w DNA deoxyribonucleoside triphophate inter-simple sequence repeats u nf va kilobase ll Kb an ISSR ethylene diamine tetraacetic acid lu EDTA d oa dNTP m milligram mL millilite mM millimol NCBI National Center for Biotechnology Information PCR polymerase chain reaction RAPD randomly amplified polymorphic DNA oi mg z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si vi SRAP sequence related amplified polymorphism SSR simple sequence repeats PIC Polymorphic Information Content TAE Tris-Acetic acid-EDTA lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si vii DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH Danh mục bảng: Bảng 2.1 Danh sách địa điểm thu mẫu 12 Bảng 2.2 Thành phần đệm chiết qua lần cải tiến 13 Bảng 2.3 Danh mục mồi ngẫu nhiên sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 3.1 Nồng độ dung dịch dna tổng số tách chiết từ mẫu nghiên cứu 20 lu Bảng 3.2 Tổng hợp số loại phân đoạn, băng DNA nhân số phân an đoạn, băng DNA đa hình 22 n va tn to Bảng 3.3 sản phẩm đa hình RAPD mồi OPF-11 nhận sau chạy PCR với DNA tổng số mẫu ba kích 24 gh p ie Bảng 3.4 Hệ số tương đồng di truyền (Nei) mẫu ba kích 25 nl w Danh mục hình: d oa Hình 2.1 Chu kỳ nhiệt chạy phản ứng PCR 14 lu an Hình 3.1 Kết đánh giá hình thái mẫu: non có màu tím sẫm (I); u nf va non có màu xanh (II); có hình dạng trịn (III) già có nhiều lơng mặt ll (IV) 18 m oi Hình 3.2 Hình thái loại kiểu hình ba kích sử dụng nghiên cứu: z at nh non có màu tím sẫm (I); non có màu xanh (II); có hình dạng trịn (III) z già có nhiều lơng mặt (IV) 18 @ gm Hình 3.3 DNA tổng số tách chiết từ 11 mẫu ba kích Đường chạy ký hiệu M m co l DNA ladder 1000 bp (Phusabiochem), đường chạy đến 11 dna tổng số mẫu từ bk1 đến bk11 19 an Lu n va ac th si viii Hình 3.4 Sản phẩm rapd sử dụng mồi OPF-11 Đường chạy ký hiệu M dna ladder 1000 bp (Phusabiochem), đường chạy đến 11 sản phẩm PCR mẫu từ BK1 ĐẾN BK11 23 Hình 3.5 Sản phẩm RAPD sử dụng mồi OPB-04 Đường chạy ký hiệu M DNA ladder 1000 bp (Phusabiochem), đường chạy đến sản phẩm PCR mẫu từ BK1 đến BK8 23 Hình 3.6 Kết phân tích mối quan hệ di truyền mẫu phần mềm NTSYSPC 2.0 với hệ số NEI72, phương pháp Clustering SAHN 26 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 19 3.2 TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ Sau tách chiết DNA thực kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số phương pháp điện di gel agarose 1% Kết điện di thể hình 3 10 11 M lu an n va p ie gh tn to w oa nl Hình 3.3 DNA tổng số tách chiết từ 11 mẫu Ba kích Đường chạy ký d hiệu M DNA ladder 1000 bp (PhusaBiochem), đường chạy đến 11 lu va an DNA tổng số mẫu từ BK1 đến BK11 u nf Kết điện di hình cho thấy, băng DNA tổng số thu gọn, tập ll trung, có mẫu xuất vệt sáng kéo dài Điều cho thấy mẫu m oi DNA tách chiết có độ nguyên vẹn cao, không lẫn protein, loại ARN z at nh tạp chất khác Điều chứng tỏ phương pháp tách chiết DNA tổng số z sử dụng phù hợp với đối tượng Ba kích DNA tổng số thu đảm bảo @ gm tiêu chuẩn kỹ thuật để tiến hành thí nghiệm Ngoài ra, nồng độ l độ tinh dung dịch DNA có ảnh hưởng đến kết nhân m co DNA ngẫu nhiên kỹ thuật RAPD Kết xác định nồng độ độ tinh an Lu dung dịch DNA tách chiết từ mẫu Ba kích cho thấy, tỷ số OD260nm/OD280nm tất mẫu DNA nằm khoảng 2,0-2,62 Kết cho thấy va n mẫu DNA đảm bảo độ tinh cần thiết để thực phản ứng PCR-RAPD ac th si 20 Kết thu trình bày bảng Bảng 3.1 Nồng độ dung dịch DNA tổng số tách chiết từ mẫu nghiên cứu OD260nm OD280nm OD260/280 Hàm lượng DNA (ng/ µl) BK1 2,797 1,263 2,21 139,8 BK2 1,554 0,593 2,62 77,7 BK3 0.858 0.407 2,11 72,9 BK4 5,237 2,564 2,04 261,8 BK5 1,873 0,868 2,16 93,7 BK6 2,910 1,351 2,15 145,5 BK7 10,155 4,727 2,15 507,8 BK8 6,501 3,061 2,12 325,0 BK9 3,307 1,534 2,16 165,3 6,126 2,872 2,13 306,3 1,867 0,850 2,20 93,3 lu Kí hiệu mẫu an n va ie gh tn to p BK10 BK11 w oa nl Các mẫu DNA tổng số sau xác định nồng độ pha loãng đến nồng d độ (30 ng/µl), để thực phản ứng PCR-RAPD an lu ll u nf RAPD va 3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN BẰNG CHỈ THỊ PCR- oi m Để nghiên cứu quan hệ di truyền Ba kích, chúng tơi sử dụng mồi z at nh RAPD có tên trình tự bảng DNA tinh pha lỗng để làm khn cho phản ứng RAPD Sau z gm @ hoàn thành phản ứng PCR sản phẩm điện di gel Agarose 1,6% để phân l tích đa hình DNA mẫu nghiên cứu Từ hình ảnh điện di, chúng tơi tiến m co hành phân tích dựa có mặt hay vắng mặt băng DNA có kích thước an Lu giống mẫy nghiên cứu Từ hình ảnh đó, băng DNA xuất giếng kí hiệu 1, cịn khơng có kí hiệu Dựa vào mức độ đa hình n va ac th si 21 băng đánh giá đa dạng di truyền mẫu Ba kích Sử dụng 10 đoạn mồi ngẫu nhiên để chạy phản ứng PCR-RAPD 11 mẫu DNA khuôn tách chiết từ 11 mẫu Ba kích để phân tích đa dạng di truyền quan hệ di truyền quần thể Ba kích Kết điện di sản phẩm PCRRAPD cho thấy, 10 đoạn mồi ngẫu nhiên sử dụng xuất phân đoạn DNA nhân Trong 10 mồi nghiên cứu có 9/10 mồi có băng DNA đa hình 11 mẫu phân tích, mồi OPF-11 cho số băng DNA đa hình cao đạt 88,89% % (hình 5), có mồi OPB-04 cho kết lu đơn hình băng AND (hình 6) Như vậy, tỷ lệ băng đa hình mồi dao động an n va từ 0% (OPB-04) đến 85,53% (OPF-11) Kết thống kê băng DNA p ie gh tn to nhân băng DNA đa hình tổng hợp bảng d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 22 Bảng 3.2 Tổng hợp số loại phân đoạn, băng DNA nhân số phân đoạn, băng DNA đa hình Tên mồi PIC Số loại phân đoạn DNA nhân Số lượng Số loại phân đoạn DNA đa hình Số băng DNA nhân Tỉ lệ (%) Số băng DNA đa hình Số lượng Tỉ lệ (%) 71,43 30 30 OPA-17 0.7662 83,33 19 42,11 OPB-04 0 11 0 OPB-14 0.8127 62,5 44 11 25 OPC-04 0.7926 87,5 36 25 69,44 OPD-01 0.6422 75 17 35,29 0.6274 66,67 18 38,89 50 22 11 50 71,43 34 12 35,29 88,89 76 65 85,53 55 41 74,54 307 154 50,16 p ie gh tn to u nf n va va an 0.6317 lu OPA-02 OPC-03 oa nl w OPE-01 OPF-02 0.7932 OPF-11 0.8229 0.7243 d an lu Tổng ll oi m z at nh Qua bảng nhận thấy giá trị PIC đoạn mồi RAPD sử dụng biến động từ 0,6317 đến 0,8229 Các thị RAPD có giá trị PIC lớn 0,5 có giá trị z cao việc đánh giá mối quan hệ di truyền Mồi OPF-11 cho giá trị PIC lớn @ m co l di truyền Ba kích gm 0,8229 Chứng tỏ mồi OPF-11 có giá trị cao việc đánh giá đa dạng Sau hai kết số kết thu việc sử dụng an Lu thị RAPD phản ứng PCR Hình ảnh điện di đa hình băng DNA thu n va sản phẩm PCR-RAPD sử dụng mồi OPF-11 OPB-04 ac th si 23 10 11 M lu Hình 3.4 Sản phẩm RAPD sử dụng mồi OPF-11 Đường chạy ký hiệu an va M DNA ladder 1000 bp (PhusaBiochem), đường chạy đến 11 sản n phẩm PCR mẫu từ BK1 đến BK11 p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh Hình 3.5 Sản phẩm RAPD sử dụng mồi OPB-04 Đường chạy ký hiệu M DNA ladder 1000 bp (PhusaBiochem), đường chạy đến sản phẩm z gm @ PCR mẫu từ BK1 đến BK8 l Dựa vào kết điện di thu được, tiến hành lập bảng thống kê kết với m co mồi nghiên cứu, với số (khơng có xuất vạch băng), (có cứu Các mồi lại tiến hành tương tự an Lu xuất vạch băng) Bảng kết thông kê mồi OPF-11với mẫu nghiên n va ac th si 24 Bảng 3.3 Sản phẩm đa hình RAPD mồi OPF-11 nhận sau chạy PCR với DNA tổng số mẫu Ba kích Kích thước (bp) 2000 1500 1000 800 700 400 300 200 100 BK1 0 1 0 BK9 1 1 0 BK11 1 1 0 0 BK5 1 1 1 BK7 1 1 1 BK4 1 1 0 BK2 1 1 1 1 BK8 1 0 0 BK10 1 1 0 BK3 0 1 0 BK6 1 0 0 0 Từ kết ta thấy vệt băng phân bố từ 100 bp đến 2000 bp Số Kí hiệu lu an n va ie gh tn to p lượng băng đa hình xuất 85,53% giá trị PIC đạt giá trị cao 0.8229 d oa nl w Nên mồi OPF-11 có giá trị cao việc đánh giá đa dạng di truyền Ba kích ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 25 3.4 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN GIỮA CÁC MẪU BA KÍCH Kết thu trình bày bảng cho thấy, hệ số tương đồng di truyền cặp mẫu nằm khoảng từ 0,44 -0,89 (tương ứng với từ 44% -89%) Điều này, cho thấy cá thể quần thể Ba kích Quảng Nam có khác về mặt di truyền, hay nói cách khác có đa dạng di truyền cá thể quần thể Bảng 3.4 Hệ số tương đồng di truyền (NEI) mẫu Ba kích lu an n va p ie gh tn to d oa nl w an lu Để thuận lợi cho việc phân tích, đánh giá quan hệ di truyền cá thể va Ba kích, sử dụng phần mềm NTSYSpc chuyển hóa số liệu tương quan di ll u nf truyền mẫu bảng thành dạng biểu đồ hình cây, mẫu có hệ số tương oi m đồng tương đương xếp vào nhóm Dựa vào biểu đồ hình mẫu nghiên cứu (hình 7) z at nh đánh giá mức độ đa dạng tương quan di truyền z m co l gm @ an Lu n va ac th si 26 (I) (II) lu an va Hình 3.6 Kết phân tích mối quan hệ di truyền mẫu n phần mềm NTSYSpc 2.0 với hệ số NEI72, phương pháp clustering SAHN to gh tn Dựa vào biểu đồ hình (Hình 6) chúng tơi chia 11 mẫu nghiên cứu thành p ie nhóm chính: Nhóm gồm mẫu BK1, BK3 BK9 chia thành nhánh phụ: nhánh oa nl w phụ gồm mẫu BK1 BK3 đánh giá khơng có sai khác di truyền, d hệ số tương đồng mẫu 0,89 (89%) Nhánh phụ gồm mẫu BK9 có hệ an lu số tương đồng so với BK1 BK3 0.75 (75%) 0.67 (67%); nhánh u nf va gồm mẫu lại, chia thành nhánh phụ ll Nhóm chia thành nhánh: nhánh phụ gồm có mẫu chia oi m thành nhánh nhỏ: BK4 BK8 xếp vào nhóm, đánh giá khơng z at nh có sai khác di truyền với hệ số tương đồng 0,89 (89%), BK11 BK6 xếp vào nhóm với hệ số tương đồng 0.85 (85%) Nhánh phụ gồm mẫu, z gm @ chia thành nhánh nhỏ: BK5 BK2 xếp vào nhóm với hệ số tương đồng 0,87 (87%), BK7 BK10 xếp vào nhóm với hệ số m co l tương đồng 0.83 (83%) Từ kết nhận thấy có ngoại lai giống Ba kích khu an Lu vực nghiên cứu Tại xã A Tiêng, địa phương hỗ trợ giống nên việc mẫu thu n va có quan hệ di truyền gần với mẫu thu xã Lăng (xã giáp ranh với ac th si 27 xã A Tiêng) điều hợp lý Tại xã Lăng, Ba kích nhân giống việc cắt cành, giâm hom, hình thức sinh sản vơ tính, mà Ba kích có giống lớn mặt di truyền Ngoài ra, nhu cầu giống cao nên đại phương nhập từ địa phương khác dẫn đến du nhập giống So sánh khác kết đánh giá hình thái kết phân tích mối đa dạng di truyền thấy khác biệt Các mẫu có kiểu hình thái lại khác xa khoảng cách di truyền Điều khẳng định chị thị phân tử có ý nghĩa cao việc đánh giá tính đa dạng di truyền lu Từ kết khẳng định có đa dạng mức lồi Ba kích an tím mức độ phân tử (kết khẳng định nghiên cứu phân tích va n đa dạng di truyền Ba kích thị ISSR Chu Thị Thu Hà cs (2015)) gh tn to Đây thuận lợi cho cơng tác chọn giống, nhằm bảo tồn phát triển Sự đa dạng cấu trúc quần thể Ba kích có khu vực Quảng p ie nguồn gen Ba kích nl w Nam-Đà Nẵng phần cho thấy yêu cầu bảo tồn nguồn gen loài thuốc d oa việc làm cần thiết, đồng thời cho thấy cơng tác tiêu chuẩn hóa quy trình an lu chọn, tạo giống, thu hái, chế biến sản xuất dược liệu từ loài thuốc u nf va nước ta cần quan tâm phát triển đa dạng nguồn gen thuốc nguyên nhân dẫn đến biến động chất lượng sản phẩm dược liệu ll oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết thu chúng tơi có kết luận sau: - Kết thu phân tích 10 đoạn mồi PCR-RAPD thu 307 băng DNA, có 189 băng đa hình, trung bình tỷ lệ băng DNA đa hình chiếm 60,58%, mồi OPF-11 cho tỷ lệ băng DNA đa hình cao đạt 85,53% - Đã xây dựng sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền 11 mẫu Ba kích nghiên cứu Kết cho thấy quần thể Ba kích khu vực lu an Quảng Nam-Đà Nẵng có mức độ đa dạng di truyền tương đối cao n va Kiến nghị tn to Trong thí nghiệm tách chiết thành công DNA tổng số ie gh Ba kích Tuy nhiên, cịn chưa xác định nguyên nhân hàm lượng DNA p không cao Vì vậy, chúng tơi có đưa số kiến nghị sau: nl Trong trình nghiên cứu có phát đoạn mồi OPB-04 cho d oa ⁃ Khảo sát thêm phương pháp tách chiết DNA tổng số Ba kích w ⁃ an lu băng đơn hình Đây đoạn mồi đặc biệt ứng dụng để va nhận biết Ba kích, dùng đoạn mồi để phân biệt Ba kích Thu thập thêm nhiều mẫu Ba kích khu vực khác oi m ⁃ ll u nf loại khác Cần nghiên cứu khác vấn đề z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước [1] Danh mục thực vật, động vật hoang dã quý (Nghị định số 48/2002/NĐCP ngày 22 tháng năm 2002) [2] Đỗ Huy Bích cộng (2004), 1000 thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tập 1: trang 986-993, Tập II: 410-415 Trang 101, tr 704 – 714 [3] Nguyễn Cẩm Dương; “Phân tích đa dạng di truyền nguồn tài nguyên số loài dược liệu Việt Nam thị ADN”; Luận văn thạc sĩ khoa học, Trường đại học Khoa học tự nhiên - Đại học quốc gia Hà Nội 2010 lu [4] Bùi Mạnh Cường, Trần Hồng Uy cộng (2000), “Nghiên cứu đa dạng di truyền số dịng ngơ đường phương pháp RADP markers”, Tạp chí Di truyền học ứng dụng an n va gh tn to [5] Chu Thị Thu Hà (2015), “Phân tích tính đa dạng di truyền nguồn gen ba kích (Morinda officinalis How) Quảng Ninh thị ISSR”, Khoá luận tốt nghiệp trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2015 p ie [6] Nguyễn Thị Thu Hương (2008), “Nghiên cứu đặc tính sinh dược học số hợp chất tự nhiên từ dịch chiết rễ Ba Kích”, Luận văn thạc sĩ sinh học Đại học Sư phạm Hà Nội nl w d oa [7] Đỗ Tất Lợi (2003), “Những thuốc vị thuốc Việt Nam”, NXB Khoa học Kỹ thuật lu u nf va an [8] Trịnh Thị Thịnh (2010), “Phân tích tính đa dạng di truyền đậu tương thị SSR”, Tạp chí Khoa học Phát triển 2010”: Tập 8, số 4: 638-646 ll [9] Ngô Thị Minh Tâm, Bùi Mạnh Cường (2007), “Sử dụng thị SSR phân tích đa dạng di truyền để dự đoán ưu lai khả kết hợp số dịng ngơ thuần”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, Kỳ 1, tháng 5/2007 oi m z at nh z [10] Nguyễn Đức Thành (2014), Các kỹ thuật thị DNA nghiển cứu chọn lọc thực vật, Tạp chí sinh học 2014, 36(3): 265-294 gm @ m co l [11] Võ Châu Tuấn, Huỳnh Minh (2010), “Nghiên cứu nhân giống in vitro Ba kích”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Đại học Đà Nẵng an Lu [12] Trần Mỹ Tiên, Nguyễn Mai Thanh Tâm, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương, 2012 Nghiên cứu tác dụng hướng sinh dục nam Ba kích (Morinda officinalis How) Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, 16(1): 192-198 n va [13] Dự án tạo lập, quản lý phát triển nhãn hiệu chứng nhận “Quảng Ninh” ac th si 30 cho sản phẩm rượu Ba kích Quảng Ninh (số 2018/NNPTNT, V/v xác nhận hướng dẫn kỷ thuật trồng chăm sóc Ba kích Quảng Ninh) [14] Võ Văn Chi, 2012 Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Hà Nội tập 1- Tài liệu nước [15] Ding P, Xu J.Y, Chu T.L (2006); “RAPD analysis on germ plasm resources of different farm races of Morinda officinalis”, Zhong Yao,29(1):1-3 [16] Elizângela Almerida Rocha, Luciano Vilela Paiva, Humberto Henrique de Carvalho, and Claudia Teixeira Guimarães (2010); “Molecular characterization and genetic diversity of potato cultivars using SSR and RAPD markers”; Crop Breeding and Applied Biotechnology 10: 204-210, 2010 lu [17] Emma S Mace and Ian D Godwin (2002), “Development and characterization of polymorphic microsatellite markers in taro (Colocasia esculenta)”, Genome 45: 823–832 (2002) an va n [18] Jonh Wiley& Sons, “Current protocol in molecular Biology”, 2003 ie gh tn to [19] J.L Noyer C Billot1, A Weber, P Brottier, J Quero-Garcia and V Lebot (2003); “Genetic diversity of Taro (Colocasia esculenta (L.) Schott) assessed by SSR markers” p [20] Yu H H., Yang L Z., Sun B., Liu N R., 2011; “Genetic diversity and relationship of endangered plant Magnolia officinalis (Magnoliaceae) assessed with ISSR polymorphisms” Biochemical Systematics and Ecology, 39(2): 71-78 oa nl w d [21] Wei L J, Lu P., Su W.P., 2006 Tissue culture and rapid propagation of Morinda officinalis How Plant Physilogy Comunication, 42(3): 475 va an lu [22] Ning-Zhen Huang, Chuan-Ming Fu, ZhiGuo Zhao, Feng-Luan Tang, Feng u nf ll Li, 2007 Tissue culture and rapid proliferation of Morinda officinalis How m oi Botany, Guangxi Zhuangzu Autonomous Region and the Chinese Academy of z at nh Sciences, Guilin 541006, China z m co l gm @ an Lu n va ac th si A PHỤ LỤC HÌNH ẢNH lu an n va gh tn to Hình 1: Hình thái nhóm có hình thái non có màu tím sẫm (I) p ie d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si B lu an n va p ie gh tn to w d oa nl Hình 2: Hình thái nhóm có hình thái non có màu xanh (II) ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu va n Hình 3: Hình thái nhóm có hình thái có hình dạng trịn (III) ac th si C lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z Hình 4: Hình thái nhóm có hình thái già có nhiều lông mặt (IV) m co l gm @ an Lu n va ac th si