Nghiên cứu đa dạng nguồn gen lan phi điệp dendrobium anosmum bằng chỉ thị phân tử RAPD

LỜI CẢM ƠN Với mục tiêu nhằm đánh giá chất lƣợng học tập hồn thành chƣơng trình đào tạo sinh viên Trƣờng Đại học Lâm nghiệp, đƣợc đồng ý Ban Giám hiệu trƣờng Đại học Lâm nghiệp, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp giúp đỡ quý thầy, cô giáo hƣớng dẫn tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp với đề tài “ Nghiên cứu đa dạng nguồn gen Lan phi điệp (Dendrobium anosmum) thị phân tử RAPD” Sau thời gian học tập với tinh thần làm việc khẩn trƣơng tích cực nghiên cứu học hỏi theo chƣơng trình đào tạo kỹ sƣ khóa 60 (2015-2019) đến khóa luận tơi hồn thành Để hồn thành báo cáo tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Bùi Văn Thắng, Th.S Nguyễn Thị Huyền thầy cô giáo Bộ môn Công nghệ Gen Di truyền phân tử, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp định hƣớng đi, tận tình hƣớng dẫn giảng dạy tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu rèn luyện Trƣờng Do hạn chế mặt thời gian, kinh nghiệm thân điều kiện nghiên cứu nên tránh khỏi thiếu sót tồn định Tơi mong nhận đƣợc lời nhận xét, đóng góp ý kiến q thầy, giáo để đề tài đƣợc hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Sinh viên thực Trịnh Hải Duyên i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Hệ thống phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh thái 1.1.3 Phân bố địa lý 1.1.4 Giá trị 1.2 Đa dạng sinh học thị dùng nghiên cứu đa dạng sinh học 1.2.1 Khái niệm đa dạng sinh học 1.2.2 Một số thị dùng đa dạng sinh học 1.3 Một số ứng dụng kĩ thuật sinh học phân tử nghiên cứu đa dạng di truyền 11 1.3.1 Một số nghiên cứu đa dạng di truyền giới 11 1.3.2 Một số nghiên cứu đa dạng di truyền Việt Nam 13 CHƢƠNG 16 MỤC TIÊU – NỘI DUNG – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 16 2.1.1 Mục tiêu chung 16 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Vật liệu nghiên cứu 16 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.4.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA 18 2.4.2 Phƣơng pháp điện di gel agarose 19 2.4.2 Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 20 ii 2.4.3 Phƣơng pháp phân tích số liệu RAPD 21 CHƢƠNG 23 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu Lan phi điệp 23 3.2 Kết khuếch đại DNA kỹ thuật RAPD 11 cặp mồi ngẫu nhiên23 OPB10 30 3.3 Kết phân tích mối quan hệ di truyền mẫu nghiên cứu 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 Kết luận 33 Kiến nghị 33 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết đầy đủ Từ viết tắt DNA Axit deoxyribonucleic AFLP Amplified Fragment Length AND BP Base pair CTAB Cetyl Trimethyl Amonium Bromide CS Cộng Dntp Deoxynucleotide triphosphate EDTA Ethylene Diamino Tetra Acetic acide G Gam Kb Kilobase Mg/l Miligam/lít OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PIC Polymorphism information content RAPD Random Amplified Polymorphism AND SDS Sodium đoecyl sulphate STS Sequence Tagged Sites SSR Simple Sequence Repeats TAE Tris – Acetic acid – EDTA UV Ultra Violet V/P Vòng/phút iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Kí hiệu mẫu Lan phi điệp sử dụng cho nghiên cứu 17 Bảng 2.2 Danh sách trình tự 11 mồi dùng nghiên cứu 17 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR-RAPD 20 Bảng 2.4 Chu kỳ phản ứng PCR-RAPD 21 Bảng 3.1 Kết sử dụng 11 mồi RAPD nghiên cứu 24 Bảng 3.2 Mã hóa sản phẩm PCR – RAPD với mồi CP4 với mẫu Lan phi điệp mã 25 Bảng 3.3 Các phân đoạn DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên với mồi CP7 đƣợc mã hóa thành kí hiệu 27 Bảng 3.4 Các phân đoạn DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên với mồi CP8 đƣợc mã hóa thành kí hiệu 28 Bảng 3.5 Các phân đoạn DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên với mồi CP17 đƣợc mã hóa thành kí hiệu 29 Bảng 3.6 Các phân đoạn DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên với mồi OPB10 đƣợc mã hóa thành kí hiệu 30 Bảng 3.7 Hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu Lan nghiên cứu 31 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây hoa Lan phi điệp (Nguồn runghoalan.com) Hình 1.2 Hình thái hoa, lá, thân Lan phi điệp (Nguồn runghoalan.com) Hình 3.1 Kết điện di DNA tổng số mẫu Lan phi điệp 23 Ghi chú: Giếng – tƣơng ứng với mẫu M1-M8 23 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR – RAPD với mồi CP4 mẫu Lan phi điệp 25 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi CP7 mẫu Lan phi điệp 26 Hình 3.4 Kết băng DNA mẫu Lan phi điệp đƣợc khuếch đại với mồi CP8 27 Hình 3.5 Kết băng DNA mẫu Lan phi điệp đƣợc khuếch đại với mồi CP17 28 Hình 3.6 Kết băng DNA mẫu Lan phi điệp đƣợc khuếch đại với mồi OPB10 29 Hình 3.6 Sơ đồ biểu diễn mối quan hệ di truyền mẫu Lan phi điệp nghiên cứu 32 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Lƣỡng điểm hạc hay phi điệp, giả hạc, giả hạc tím (danh pháp hai phần: Dendrobium anosmum) loài lan chi Lan hoàng thảo Đây giống phong lan thƣờng đƣợc trồng nhiều tƣơng đối dễ trồng, khả chịu nóng, lạnh tƣơng đối tốt Cây dễ trồng cho nhiều hoa, hoa phi diệp to, từ khoảng 3- 5cm, hƣơng thơm nồng nàn Cây phân bố từ Nam Á đến Đơng Nam Á Tại Việt Nam, có mặt khu vực: Bắc Giang, Hà Nội, Hà Nam, Nghệ An, Lâm Đồng, Lào Cai, Hà Giang, Bắc Cạn, Hịa Bình, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Cao Bằng, Đơ Lƣơng, Vinh, Krong Pha, Đà Lạt, Đắc Lắk, Sông Bé, Lộc Ninh… Lan phi điệp loài hoa đẹp, mang lại giá trị kinh tế cao cho ngƣời kinh doanh Tuy nhiên số năm gần địa bàn tỉnh việc khai thác lan rừng bừa bãi (trong có Lan phi điệp) khiến nguồn tài nguyên quý ngày trở nên cạn kiệt Trƣớc thực tế nhiều viện nghiên cứu nhà khoa học nảy sinh ý tƣởng thực việc bảo tồn phát triển nguồn gen Lan phi điệp đặc trƣng số vùng bị có nguy mai Để làm đƣợc điều cần tiến hành nghiên cứu đánh giá đƣợc đa dạng di truyền Lan phi điệp số xuất xứ cung cấp sở khoa học cho việc bảo tồn phát triển nguồn gen Xuất phát từ thực tế này, thực đề tài: “Nghiên cứu đa dạng nguồn gen Lan phi điệp (Dendrobium anosmum) thị phân tử RAPD” nhằm cung cấp sở khoa học liệu di truyền phục vụ cho công tác bảo tồn đa dạng sinh học chọn tạo giống CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Hệ thống phân loại Tên Việt Nam : Lan phi điệp Tên khoa học : Dendrobium anosmum Bộ : Asparagales Họ : Orchidaceae Chi : Dendrobiinae Lồi : D anosmum Hình 1.1 Cây hoa Lan phi điệp (Nguồn runghoalan.com) 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh thái 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái  Thân phi điệp thông thƣờng thân cao chừng 40-60cm có tới 2m bng rủ xuống, có giống rụng vào mùa thu có giống xanh tốt quanh năm Mọc thành cụm qua năm thuộc nhóm đa thân Giả hành hay thân giả quan dự trữ nƣớc, thiếu nƣớc đa thân trì sống lâu loại đơn thân Thân chia thành nhiều đốt đốt chứa mắt ngủ Độ dài đốt phụ thuộc vào giống, độ tuổi cây, môi trƣờng… Màu sắc thân phi điệp đa dạng từ xanh, tím, chấm tím độ mập có đƣờng kính 1,5cm vào mùa nghỉ   Hoa có nhiều màu, phần đơng tím trắng, nhạt hay thẫm Hoa mọc đốt 4-6 to 6-10cm, thơm ngát nở vào mùa xn Ngồi sắc tím hồng thơng thƣờng cịn có mầu trắng hay cánh mầu trắng, họng tím Một khóm lan có tới 100 hoa chuyện thƣờng  Lá đơn mọc cách so le hành giả dài 10-15cm rộng 3-4cm Mép nguyên hệ gân song song nhọn Cây thƣờng rụng vào mùa thu, đông thắt ngọn, bƣớc vào mùa nghỉ  Rễ phi điệp thuộc loại rễ bì sinh xung quanh lớp mơ thật đƣợc bao bọc lớp mô xốp giúp dễ dàng hút nƣớc, muối khoáng ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt Chóp rễ có màu xanh cây, phần rễ có sắc lạp khơng bị ngăn mơ xốp nên giúp quang hợp [1] Hình 1.2 Hình thái hoa, lá, thân Lan phi điệp (Nguồn runghoalan.com) 1.1.2.2 Đặc điểm sinh thái  Yêu cầu ánh sáng: Các loài lan nói chung loại cần ánh sáng Do vậy, để phát triển tốt bạn cần đặt trời nhƣng cần làm mái che để trời nắng q lan khơng bị cháy nắng Nếu thấy có dấu hiệu quặt quẹo bị thiếu nắng, lúc ngƣời trồng nên chuyển đến chỗ có nhiều nắng Đặc biệt vào mùa đơng, nắng nên khó hoa  Yêu cầu nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp Lan phi điệp 8-25oC, nhƣng chịu đƣợc nhiệt độ nóng tối đa 38oC chịu độ lạnh 3,3°C Tuy nhiên, Phi Điệp trồng vào mùa đơng có nhiệt độ 15oC thời gian từ đến tuần khó hoa  u cầu độ ẩm: Độ ẩm thích hợp Lan phi điệp vàng từ 60% đến 70% Nếu độ ẩm thấp non bị teo dần không lớn đƣợc Do vậy, ngƣời trồng hoa cần đặt nơi thống gió, đặc biệt thời kỳ nụ sai hoa [1] 1.1.3 Phân bố địa lý  Thế giới Phi điệp thuộc dịng hồng thảo ƣa thích khí hậu nhiệt đới dịng lan đƣợc phân bố chủ yếu nƣớc Đông Nam Á nhƣ: Thái Lan, Lào, Việt Nam, Cumpuchia … Ngồi Lan phi điệp đƣợc tìm thấy nƣớc Ấn Độ, Nêpan hay Butan, Trung Quốc …  Việt Nam Cây có mặt khu vực: Bắc Giang, Hà Nội, Hà Nam, Nghệ An, Lâm Đồng, Lào Cai, Hà Giang, Bắc Cạn, Ninh Thn, Hịa Bình, Thái Nguyên, Phú Thọ, Đô Lƣơng, Vinh, Krong Pha, Đà Lạt, Đắc Lắk, Sông Bé, Lộc Ninh… 1.1.4 Giá trị  Giá trị dinh dƣỡng: Bên cạnh việc sử dụng làm cảnh đƣợc nhiều ngƣời yêu thích, phi điệp vàng đƣợc sử dụng làm thuốc trị bệnh Thuốc từ Lan phi điệp vàng trị miệng khô, trị táo khát, trị phổi kết hạch, trị dày thiếu vị chua, trị di tinh, trị mồ hôi trộm, trị thắt lƣng đau mỏi, trị chứng nhiệt gây tổn tân dịch  Giá trị kinh tế: Với dịng Lan phi điệp vàng phi điệp tím giá loại chênh nhiều Có cách tính giá là: tính theo hàng kg mua hàng chƣa vừa khai thác từ rừng cách tính giá theo giị với hàng Ngồi cịn cách tính theo cm hàng đột biến  tích đƣợc xây dựng cơng thức tính toán Nei Li (1979): Sxy = 2xy/(x+y) Trong đó: xy: số băng hai mẫu x: số băng mẫu x y: số băng mẫu y Từ Sxy ta tính đƣợc khoảng cách di truyền x y Dxy = - Sxy Hàm lƣợng thông tin đa hình (PIC - Polymorphic Information Content) đƣợc tính theo công thức Saal & Wricke (1999): PICi =1 - ΣPij2 Trong đó, Pij tần số xuất allen thứ j kiểu gen i đƣợc kiểm tra Phạm vi giá trị PIC từ (không đa hình) tới (đa hình hồn tồn) [16] 22 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu Lan phi điệp Tách chiết DNA tổng số bƣớc bƣớc khởi đầu vơ quan trọng, định thành công cho phản ứng PCR sau DNA tổng số tách chiết đƣợc phải có kích thƣớc lớn, đảm bảo tính ngun vẹn phân tử, khơng lẫn RNA, protein hay tạp chất khác Kết kiểm tra chất lƣợng DNA gel agarose 0,82% (hình 3.1.) cho thấy tất mẫu Lan phi điệp tách chiết đƣợc DNA tổng số cho thấy băng DNA tổng số thu đƣợc rõ nét, độ sáng đồng đều, chứng tỏ mẫu có nồng độ tƣơng đối đồng đều, DNA bị gãy, đảm bảo đủ tiêu chuẩn để tiến hành phản ứng PCR - RAPD Hình 3.1 Kết điện di DNA tổng số mẫu Lan phi điệp Ghi chú: Giếng – tƣơng ứng với mẫu M1-M8 3.2 Kết khuếch đại DNA kỹ thuật RAPD 11 cặp mồi ngẫu nhiên Sau thực phản ứng PCR-RAPD với 11 mồi ngẫu nhiên, sản phẩm đƣợc điện di gel agarose 1,5% Các băng DNA xuất điện di đƣợc tổng hợp để phân tích mối quan hệ di truyền mẫu Lan phi điệp nghiên cứu Kết tổng hợp bảng 3.1 Qua bảng 3.1 thấy tất 11 mồi mẫu nhiên đƣợc sử dụng nghiên cứu cho kết khuếch đại băng DNA tất mẫu, thu đƣợc tổng cộng 345 băng, có 332 băng đa hình, tỷ lệ băng đa hình 23 chiếm 86,1% Trung bình mẫu cho 43 băng mồi cho 31 băng Số phân đoạn DNA đƣợc nhân 82, 74 phân đoạn phân đoạn đa hình chiếm tỷ lệ phân đoạn đa hình 86,1% Mồi OPCA20 có số loại phân đoạn DNA đƣợc khuếch đại nhiều (12 phân đoạn DNA), đó, 10 mồi cịn lại xuất từ đến phân đoạn DNA đƣợc khuếch đại Đặc biệt có mồi CP8 xuất phân đoạn có phân đoạn đơn hình mồi OPG13 xuất phân đoạn có phân đoạn đơn hình, mồi CP7 OPB10 xuất phân đoạn có phân đoạn đơn hình, mồi CP17 xuất phân đoạn có phân đoạn đơn hình mồi RM4 xuất phân đoạn có phân đoạn đơn hình Tất 11 mồi cho tỷ lệ phân đoạn DNA đa hình 86,1% (CP4, CP7, CP8, CP17, OPB10, RA159, OPCA20, OPG13, RM4, OPE20, OPE14) Số phân đoạn DNA trung bình/mẫu có khác biệt lớn dao động khoảng từ (OPE14) đến 5.6 (CP4) Tỉ lệ phân đoạn đa hình cao (86,1%) nhƣ số phân đoạn DNA trung bình/mẫu dao động lớn cho thấy mức độ đa dạng di truyền mẫu Lan phi điệp nghiên cứu cao Bảng 3.1 Kết sử dụng 11 mồi RAPD nghiên cứu Số phân đoạn DNA khuếch STT Tên mồi đại CP4 CP7 CP8 CP17 OPB10 RA159 6 12 OPCA20 OPG13 RM4 OPE20 10 OPE14 11 Số phân đoạn DNA đa hình 8 12 6 Tỷ lệ phân đoạn đa hình (%) 100% 89% 67% 83% 89% 100% 100% 33% 86% 100% 100% 24 Tổng số băng DNA/mồi 45 40 36 23 38 26 41 22 38 20 16 Số phân đoạn DNA trung bình/mẫu 5,6 4,5 2,88 4,75 3,25 5,13 2,75 4,75 2,5 Tổng số 82 74 86,1% 345 Kết điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi CP4 đƣợc thể hình 3.2 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR – RAPD với mồi CP4 mẫu Lan phi điệp Ghi chú: M thang DNA 100bp; giếng 1- tƣơng ứng với tám mẫu Lan nghiên cứu M1 – M8 Bảng 3.2 Mã hóa sản phẩm PCR – RAPD với mồi CP4 với mẫu Lan phi điệp mã Mồi CP4 Băng Mẫu 190 250 480 800 1000 M1 1 1 1 M2 0 1 1 M3 1 1 1 M4 1 1 1 M5 0 0 1 M6 0 1 M7 0 1 1 M8 0 0 1 25 1200 1300 1500 Kết điện di sản phẩm PCR-RAPD mẫu Lan phi điệp nghiên cứu với mồi CP4 xuất loại phân đoạn DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên Qua hình 3.2 cho thấy băng vạch thể rõ nét, chiều dài loại phân đoạn có kích thƣớc dao động từ 190bp - 1500bp (tại vị trí 190, 250, 480, 800, 1000, 1200, 1300, 1500 bp) so với thang DNA chuẩn 100 bp Tiến hành mã hóa số liệu từ hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi CP4 theo nguyên tắc: xuất băng DNA đánh số 1, không xuất băng DNA đánh số thu đƣợc kết trình bày nhƣ bảng 3.2 Mồi CP4 có tổng cộng loại phân đoạn DNA xuất với kích thƣớc khác nhau, tổng số băng DNA xuất mẫu Lan phi điệp với mồi CP4 45 băng, với tỷ lệ băng đa hình 100% Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi CP7 mẫu Lan phi điệp Ghi chú: M: thang DNA chuẩn 100bp; giếng từ – tƣơng ứng với mẫu M1 – M8 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu Lan phi điệp với mồi CP7 xuất loại phân đoạn DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên cho mẫu Lan phi điệp băng vạch thể rõ nét, chiều dài loại phân đoạn có kích thƣớc dao động từ 180bp - 1200bp (tại vị trí 180, 190, 300, 380, 440, 580, 900, 1200bp) so với thang DNA chuẩn 100bp Tiến hành mã hóa số từ hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi CP7 (hình 3.3) thu đƣợc kết trình bày nhƣ bảng 3.3 Mồi CP7 có tổng cộng loại phân đoạn DNA xuất với kích thƣớc khác phân đoạn phân đoạn đa hình chiếm tỷ lệ 26 100% Tổng số băng DNA xuất mẫu Lan phi điệp với mồi CP7 40 băng, với tỷ lệ băng đa hình 89% Bảng 3.3 Các phân đoạn DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên với mồi CP7 đƣợc mã hóa thành kí hiệu Mồi C.P7 Băng Mẫu M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 180 1 1 1 190 0 0 0 300 1 1 1 1 380 1 1 0 1 440 1 0 580 0 0 1 900 0 1 0 1200 0 0 0 Hình 3.4 Kết băng DNA mẫu Lan phi điệp đƣợc khuếch đại với mồi CP8 Ghi chú: M thang DNA chuẩn 100bp; giếng từ 1-8 tƣơng ứng với mẫu M1-M8 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu Lan phi điệp với mồi CP8 xuất loại phân đoạn DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên cho mẫu Lan phi điệp băng vạch thể rõ nét, chiều dài loại phân đoạn có kích thƣớc dao động từ 15bp đến 750bp (tại vị trí 150, 220, 450, 530, 620, 750bp) so với thang DNA marker 100 Trong có phân đoạn vị trí 530 630bp phân đoạn đơn hình, tỷ lệ phân đoạn đa hình 100% Tiến hành mã 27 hóa số từ hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi CP8 (hình 3.4) thu đƣợc kết trình bày nhƣ bảng 3.4 Mồi CP8 có tổng cộng loại phân đoạn DNA xuất với kích thƣớc khác nhau, tổng số băng DNA xuất mẫu Lan phi điệp với mồi CP8 36 băng, có băng vị trí phân đoạn 530 620 bp băng đơn hình, tỷ lệ băng đa hình 67% Bảng 3.4 Các phân đoạn DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên với mồi CP8 đƣợc mã hóa thành kí hiệu Mồi CP8 Băng Mẫu M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 150 220 450 530 620 750 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Hình 3.5 Kết băng DNA mẫu Lan phi điệp đƣợc khuếch đại với mồi CP17 Ghi chú: M thang DNA chuẩn 100bp; giếng từ 1-8 tƣơng ứng với mẫu M1-M8 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu Lan phi điệp với mồi CP17 xuất số băng vạch nhiều với loại phân đoạn DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên cho mẫu Lan băng vạch thể rõ nét, chiều dài loại 28 phân đoạn có kích thƣớc dao động từ 300bp đến 1500bp (tại vị trí 300, 580, 720, 1000, 1200, 1500bp) so với thang DNA marker 100 Tiến hành mã hóa số từ hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi CP17 (hình 3.5) thu đƣợc kết trình bày nhƣ bảng 3.5 Mồi CP17 có tổng cộng loại phân đoạn DNA xuất với kích thƣớc khác nhau, tổng số băng DNA xuất mẫu Lan phi điệp với mồi CP17 23 băng, tỷ lệ băng đa hình 83% Bảng 3.5 Các phân đoạn DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên với mồi CP17 đƣợc mã hóa thành kí hiệu CP17 Băng Mẫu 300 580 720 1000 0 1 M1 0 M2 0 1 M3 0 1 M4 0 1 M5 0 M6 1 1 M7 0 M8 1200 0 0 1 1 1500 0 1 Hình 3.6 Kết băng DNA mẫu Lan phi điệp đƣợc khuếch đại với mồi OPB10 Ghi chú: M thang DNA chuẩn 100bp; giếng từ 1-8 tƣơng ứng với mẫu M1-M8 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu Lan phi điệp với mồi OPB10 xuất số băng vạch nhiều với loại phân đoạn DNA đƣợc nhân 29 ngẫu nhiên cho mẫu Lan phi điệp băng vạch thể rõ nét, chiều dài loại phân đoạn có kích thƣớc dao động từ 250 bp đến 1500 bp (tại vị trí 250, 320, 580, 650, 780, 1000, 1200, 1400, 1500 bp) so với thang DNA marker 100 Tiến hành mã hóa số từ hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi OPB10 (hình 3.5) thu đƣợc kết trình bày nhƣ bảng 3.5 Mồi OPB10 có tổng cộng loại phân đoạn DNA xuất với kích thƣớc khác nhau, tổng số băng DNA xuất mẫu Lan phi điệp với mồi OPB10 38 băng, tỷ lệ băng đa hình 89% Bảng 3.6 Các phân đoạn DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên với mồi OPB10 đƣợc mã hóa thành kí hiệu Băng Mẫu M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 250 320 580 0 0 0 0 0 0 0 0 1 OPB10 650 780 1 1 1 0 0 1 1 1000 1200 1400 1500 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 3.3 Kết phân tích mối quan hệ di truyền mẫu nghiên cứu Để xác định đƣợc khoảng cách di truyền mẫu Lan phi điệp thông qua hệ số tƣơng đồng di truyền biểu đồ hình cách sau: từ hình ảnh số liệu PCR - RAPD đƣợc thống kê băng điện di (xuất = 1, không xuất = 0) xử lý phân tích chƣơng trình NTSYSpc version 2.1 ta xác định đƣợc khoảng cách di truyền mẫu Lan nghiên cứu Để kiểm tra phƣơng pháp phân nhóm, chúng tơi tiến hành xác định giá trị tƣơng quan kiểu hình theo phƣơng pháp tính hệ số di truyền giống Jaccard Biểu đồ hình đƣợc thiết lập dựa giá trị tƣơng quan cao với giá trị r >= 0.9: tƣơng quan chặt, r = 0.8 - 0.9: tƣơng quan chặt, r = 0.7 - 0.8: tƣơng quan tƣơng đối chặt, r >= 0.7: tƣơng quan không chặt 30 Hệ số tƣơng đồng di truyền Jaccard cho biết mối quan hệ mặt di truyền mẫu cần phân tích Trị số Jaccard tiến mức độ tƣơng đồng di truyền mẫu thấp ngƣợc lại, tiến mức độ tƣơng đồng di truyền cao Với cách tính hệ số di truyền giống phản ánh mối tƣơng quan kiểu hình mẫu Lan phi điệp dao động lớn từ 0.5 đến 0.7804878 Trong đó, giá trị tƣơng quan kiểu hình 0.7804878 (r) lớn tính theo hệ số di truyển Jaccard Bảng 3.6 cho biết tƣơng đồng di truyền cặp mẫu Lan phi điệp nghiên cứu Kết cho thấy có cặp sau có hệ số di truyền thấp: cặp M1 M8 với hệ số di truyền 0.5, mẫu M1 thu Quảng Bình mẫu M8 Phú Thọ, khu vực nằm xa mặt địa lý; cặp M1 M6, cặp M1 M7 có hệ số tƣơng đồng lần lƣợt 0.5243902, 0.5121951 cặp mẫu đƣợc thu thập vị trí cách xa Qua thấy cặp có quan hệ di truyền xa hay nói cách khác cặp có đa dạng di truyền cao Chúng ta tiếp tục sử dụng kết để tiếp tục cho thí nghiệm tiếp theo, ví dụ dùng cặp để tiến hành lai tạo giống thu đƣợc nhiều gen trội giúp cho sinh trƣởng phát triển tốt so với cặp khác lai tạo với Bảng 3.7 Hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu Lan nghiên cứu M1 1.0000000 M2 M1 M3 M4 M2 0.6341463 1.0000000 M3 0.6707317 0.7439024 1.0000000 M4 0.6829268 0.6829268 0.7682927 1.0000000 M5 0.5487805 0.5975610 0.6585366 0.6707317 1.0000000 M6 0.5243902 0.5731707 0.6341463 0.6463415 0.7804878 1.0000000 M7 0.5121951 0.6097561 0.6219512 0.6829268 0.7439024 0.7439024 1.0000000 M8 0.5000000 0.5731707 0.5853659 0.6219512 0.7560976 0.6585366 0.7195122 31 M5 M6 M7 M8 1.0000000 Giản đồ phả hệ di truyền hay sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền mẫu Lan nghiên cứu (hình 3.6) Sơ đồ hình tính theo hệ số Jaccard kiểu phân nhóm UPGMA mức độ sai khác di truyền mẫu Lan thu thập xuất xứ Mức độ khác đƣợc biểu hệ số sai khác mẫu Các mẫu có hệ số di truyền giống tƣơng tự đƣợc xếp thành nhóm, nhóm lại có liên hệ với Qua giản đồ thể hình 3.6 cho thấy mẫu Lan nghiên cứu đƣợc phân thành nhóm A B mức tƣơng đồng di truyền 0.6 Trong đó, nhóm A gồm mẫu M1, M2, M3 M4 có tƣơng đồng di truyền 0.66 đƣợc chia thành nhóm nhỏ A1 có mẫu M1 nhóm A2 (gồm M2, M3, M4) mẫu cịn lại nhóm B mức tƣơng đồng di truyền 0.71 tiếp tục đƣợc chia thành nhóm nhỏ B1 (gồm mẫu: M1, M2, M3) B2 có mẫu m8 Nhóm nhỏ B1 mức tƣơng đồng di truyền 0.74 đƣợc chia thành nhánh nhỏ B1.1 gồm mẫu M5 M6 mức tƣơng đồng di truyền 0.7804878 có tƣơng đồng di truyền cao B1.2 mẫu M7,; Nhóm nhỏ B2 mẫu M8 mức tƣơng đồng di truyền 0,71 Các kết thu đƣợc nghiên cứu tiền đề quan trọng giúp cho công tác bảo tồn, lai tạo giống phát triển Lan phi điệp M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 Hình 3.7 Sơ đồ biểu diễn mối quan hệ di truyền mẫu Lan phi điệp nghiên cứu 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1) Tách chiết thành công DNA tổng số từ mẫu Lan phi điệp, cho kết tốt, băng DNA tổng số nét, đủ hàm lƣợng chất lƣợng để thực phản ứng RAPD 2) Trong 11 mồi RAPD sử dụng, phản ứng PCR - RAPD cho kết nhân đƣợc 82 phân đoạn DNA, có 74 phân đoạn đa hình, tỷ lệ phân đoạn đa hình chiếm 86,1% Kết thu đƣợc tổng số 345 băng DNA mẫu Lan phi điệp, có 297 băng đa hình, tỷ lệ băng đa hình chiếm 86,1% 3) Đã xác định đƣợc mối quan hệ di truyền mẫu Lan phi điệp nghiên cứu thấp nằm khoảng từ 0.5 đến 0.78; tức mẫu Lan phi điệp nghiên cứu có mức độ đa dạng cao 4) Đã xây dựng đƣợc phát sinh mẫu Lan phi; phát sinh phân thành nhóm A B mức tƣơng đồng di truyền 0.6 Nhóm A gồm mẫu M1, M2, M3 M4 có tƣơng đồng di truyền 0.66 đƣợc chia thành nhóm nhỏ A1 có mẫu M1 nhóm A2 (gồm M2, M3, M4) mẫu cịn lại nhóm B mức tƣơng đồng di truyền 0.71 tiếp tục đƣợc chia thành nhóm nhỏ B1 (gồm mẫu: M1, M2, M3) B2 có mẫu M8 Kiến nghị Tiếp tục thị phân tử khác để đánh giá cách xác mối quan hệ di truyền thêm số xuất xứ Lan phi điệp để tạo sở liệu hoàn chỉnh 33 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Trƣơng Minh Dũng (2007), Đánh giá đa dạng di truyền giống lan rừng Dendrobium thu thập thành phố Hồ Chí Minh rừng Nam Cát Tiên kỹ thuật RADP, trƣờng Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh [2] Lê Đình Lƣơng, Nguyễn Đình Thi (2002), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội [3] Lê Đình Lƣơng, Nguyễn Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 134-146 [4] Chu Hoàng Mậu, Nơng Thị Man, Lê Xn Đắc, Đinh Thị Phịng, Lê Trần Bình (2002), Đánh giá genome số dịng đậu tương đột biến kỹ thuật phân tích đa hình DNA nhân ngẫu nhiên, Tạp chí sinh học 22, tr 21-27 [5] Phạm Bình Quyền, Nguyễn Nghĩa Thìn (2002), Đa dạng sinh học, NXB Hà Nội, tr 9-85 [6] Trƣơng Quang Vinh, Nguyễn Thị Tâm, Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Thanh Danh (2008) Đánh giá đa hình DNA số giống khoai tây (solanum tuberosum L.) kỹ thuật RAPD Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng Thơn, số 1:20-25 [7] Nguyễn Hồng Nghĩa, Nguyễn Đức Thành, Trần Thùy Linh (2007) kết phân tích đa dạng di truyền lồi Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz)) thị phân tử RAPD Tạp chí Nơng nghiệp &PTNT, 14/2007 [8] Trƣơng Quang Vinh, Nguyễn Thị Tâm, Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Thanh Danh (2008) Đánh giá đa hình DNA số giống khoai tây (solanum tuberosum L.) kỹ thuật RAPD Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn [9] Chu Hồng Mậu, Nguyễn Thị Hoa Lan (2005), “Đa dạng di truyền số giống lạc trồng (Archis hypogaea L.)”, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Nxb KH&KT Hà Nội, tr.1304 - 1307 [11] Nguyễn Văn Giang, Vũ Ngọc Lan, Tống Văn Hải (2013), “Nghiên cứu đa dạng di truyền Khoai Môn – Sọ thị phân tử DNA”, Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 11, số 1: 1-6 [12] Trần Đức Vƣợng, Bùi Ngọc Quang, Lƣơng Văn Tiến, Hoàng Văn Thắng, Trần Hồ Quang (2014), “Đánh giá đa dạng di truyền xuất xứ Lai (Aleurites moluccana (L.) Willd) thị RAPD”, Tạp chí KHLN 3/2014 (3382 - 3389) [13] Hà Văn Huân, “Phân tích quan hệ di truyền quần thể Long Não (Cinnamomum camphora L.Presl) kỹ thuật PCR-RAPD”, Tạp chí khoa học cơng nghệ Lâm Nghiệp số năm 2015 [14] Hoàng Đăng Hiếu, Chu Thị Thu Hà, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Chu Hoàng Hà (2016), “Sử dụng thị ISSR việc đánh giá đa dạng di truyền quần thể Ba Kích Quảng Ninh”, Tạp chí Sinh học (2016), 38(1): 89-95 [15] Báo điện tử phủ, Nhà khoa học trẻ theo đuổi ước mơ làm giàu cho người nông dân (02/09/2017) TÀI LIỆU TIẾNG ANH [10] Nei, M and Li, W.H.1979 Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases Proc Natl Acad Sci USA 76, 5269–5273 [16] Kumar R S., Parthiban K.T., Rao M G (2009), “Molecular characterization of Jatropha genetic resources through inter-simple sequence repeat (ISSR) markers”, Mol Biol Rep,36, 1951-1956 [17] E Chisha-Kasumu, S Woodward, A Price (2009), “RAPD markers demonstrate genetic diversity in Pterocarpus angolensis from Zimbabwe and Zambia”E Chisha-Kasumu , S Woodward & A Price [18] Z Mahmood, F Raheel, A Dasti, S Shahzadi, M Athar, M Qayyum (2009), “Genetic diversity analysis of the species of Gossypium by using RAPD markers”, African Journal of Biotechnology, Vol 8, No 16 [19] R Basheer-Salimia, M Shtaya, M Awad, J.Abdallah DNA Y.Hamdan (2013),”Genetic diversity of Palestine lDNAraces of faba bean (Vicia faba) [20] Xingfeng Zhao, Yongpeng Ma, Weibang Sun, Xiangying Wen, DNA Richard Milne (2012), “High Genetic Diversity DNA Low Differentiation of Michelia coriacea (Magnoliaceae), a Critically Endangered Endemic in Southeast Yunnan, China”, Int J Mol Sci 13, 4396-4411; doi:10.3390/ijms13044396 [21] Kamran Ashraf, Altaf Ahmad, Anis Chaudhary, Mohd Mujeeb, Sayeed Ahmad, Mohd Amir, DNA N Mallicka (2014), “Genetic diversity analysis of Zingiber Officinale Roscoe by RAPD collected from subcontinent of India”, Saudi J Biol Sci 21(2): 159–165 [22] Sylwia Okoń, Edyta Paczos-Grzęda, Magdalena Łoboda, Danuta Sugier (2014), “Indentifiacion of genetic diversity among Arnica montana L genoypes RAPD markers”, Acta Sci Pol., Hortorum Cultus, 13(4), 63-71 [23] Yadav J P, SDNAeep Kumar, Manila Yadav, Sangeeta, Sanjay Yadav (2014), “Assessment of genetic diversity using RAPD marker among different accessions of Salvadora oleoides of North-West India” May 1, Volume 4; Issue [24] Muhammad Faisal Anwar Malik, Kaleem Tariq, Afsari S Qureshi, Muhammad Rashid Khan, Muhammad Ashraf, Gul Naz & Asad Ali (2017), “Analysis of genetic diversity of soybean germplasm from five different origins [25] Miranda oliveria K, Rios Laborda P, Augusto F Gacia A, Zagatto Paterniani ME, De Souza AP (2004), Evaluting genetic relationships between tropical maize inbred lines by means of AFLP profiling [26] Zhao X., Kochert G (1993), Phylogenetic distribution and genetic mapping of a (GGC)n microsatellite from rice (Oryza Sativa L), Plant Mol Biol, 21 [27] Welsh J., McClelland M (1990), Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primer, Nucl Acid Res, 18 ... khoa học cho việc bảo tồn phát triển nguồn gen Xuất phát từ thực tế này, thực đề tài: ? ?Nghiên cứu đa dạng nguồn gen Lan phi điệp (Dendrobium anosmum) thị phân tử RAPD? ?? nhằm cung cấp sở khoa học liệu... thị dùng nghiên cứu đa dạng sinh học 1.2.1 Khái niệm đa dạng sinh học 1.2.2 Một số thị dùng đa dạng sinh học 1.3 Một số ứng dụng kĩ thuật sinh học phân tử nghiên cứu đa dạng di... di truyền mẫu Lan phi điệp nghiên cứu thấp nằm khoảng từ 0.5 đến 0.78; tức mẫu Lan phi điệp nghiên cứu có mức độ đa dạng cao 4) Đã xây dựng đƣợc phát sinh mẫu Lan phi; phát sinh phân thành nhóm