Đánh giá di truyền sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)bằng chỉ thị phân tử RAPD

See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/327515407 Đánh giá di truyền sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) thị phân tử RAPD Article · September 2015 CITATIONS READS 770 authors: Tung Thanh Hoang Bui Van The Vinh Tay Nguyen Institute for Scientific Research VAST Ho Chi Minh City University of Technology (HUTECH) 107 PUBLICATIONS   146 CITATIONS    24 PUBLICATIONS   126 CITATIONS    SEE PROFILE SEE PROFILE Nhut Duong Tan Tay nguyen Institute for Scientific Research 178 PUBLICATIONS   2,139 CITATIONS    SEE PROFILE Some of the authors of this publication are also working on these related projects: The role of silver, cobalt and iron nanoparticles overcoming some abnormal phenomena and improving the plant quality of Gerbera jamesonii cultured in vitro View project A participant of Nafosted project: Research on new techniques in micropropagation and Paphiopedilum spp - Code 106-NN.01-2015.02 View project All content following this page was uploaded by Tung Thanh Hoang on 17 September 2018 The user has requested enhancement of the downloaded file Tạp chí Công nghệ Sinh học 13(1): 63-73, 2015 ĐÁNH GIÁ SỰ ỔN ĐỊNH DI TRUYỀN CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) BẰNG CHỈ THỊ RAPD Bùi Văn Thế Vinh1, Vũ Thị Thủy2, Hoàng Thanh Tùng2, Vũ Thị Hiền2, Trần Xuân Tình2, Đỗ Khắc Thịnh3, Dương Tấn Nhựt2 Trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Ngày nhận bài: 15.01.2015 Ngày nhận đăng: 30.3.2015 TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, sử dụng thị phân tử RAPD để phân tích di truyền sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) di thực từ núi Ngọc Linh (thuộc địa phận tỉnh Quảng Nam Kontum) đến khu vực Cổng trời thuộc vườn Quốc gia Bidoup Núi Bà (tỉnh Lâm Đồng) so với địa Trong số 15 thị phân tử RAPD sử dụng, có thị (OPB-13) khơng cho sản phẩm khuếch đại, 14 thị lại tạo 93 băng đồng hình băng đa hình (chiếm tỉ lệ 5,1%) Kết phân loại dựa theo hệ số tương đồng di truyền chia 10 mẫu nghiên cứu thành nhóm chính, nhóm gồm thu nhận từ Lâm Đồng thu nhận từ Quảng Nam có hệ số tương đồng 0,9820 nhóm gồm thu nhận từ Kontum thu nhận từ Quảng Nam có hệ số tương đồng 0,9762 Hình ảnh phân tích điện di sản phẩm RAPD với 12 mồi cho thấy 32 sâm Ngọc Linh in vitro đánh giá cho kết đồng hình Các có nguồn gốc từ phơi vơ tính chuyển vườn ươm trồng thử nghiệm loại giá thể khác cho tỉ lệ sống sót cao (đạt 60%) Kết nghiên cứu cho thấy phương pháp phát sinh phơi vơ tính có khả tạo số lượng lớn sâm Ngọc Linh có ổn định di truyền cao Từ khóa: tương đồng di truyền, sâm Ngọc Linh, Panax vietnamensis, phơi vơ tính, thị RAPD ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm Ngọc Linh hay gọi sâm Khu 5, có tên khoa học Panax vietnamensis Ha et Grushv., thuộc họ nhân Sâm (Araliaceae) Đây lồi dược liệu q đặc hữu Việt Nam có thành phần ginsenoside đánh giá vào loại nhiều so với loài khác chi Panax giới có nhiều cơng dụng việc chữa bệnh chăm sóc sức khỏe người (Dương Tấn Nhựt et al., 2010) Chính nhờ giá trị dược lý to lớn mà nhu cầu sâm Ngọc Linh ngày gia tăng dẫn tới việc khai thác, mua bán, sử dụng kiểm sốt gần khơng cịn tồn tự nhiên Cây sâm Ngọc Linh đưa vào sách đỏ Việt Nam với mức độ đe dọa bậc E, lồi thực vật có giá trị đặc biệt khoa học kinh tế, có số lượng, trữ lượng có nguy bị tuyệt chủng, nghiêm cấm khai thác tự nhiên Trong nỗ lực nghiên cứu di thực sâm Ngọc Linh khỏi vùng phát triển tự nhiên đỉnh núi Ngọc Linh thuộc địa phận tỉnh Quảng Nam Kon tum, tiến hành trồng thử nghiệm 200 khu vực Cổng trời thuộc vườn Quốc gia Bidoup Núi Bà từ năm 2010 Với mục đích bảo tồn phát triển nguồn gen quí Quốc gia đồng thời phát triển vùng trồng để cung cấp nguyên liệu cho ngành dược, từ lâu công tác tạo nguồn giống sâm Ngọc Linh đề cập đến với hai hình thức chủ yếu nhân giống từ hạt tạo giống từ đầu mầm (thân rễ ngầm) kết đạt hạn chế Theo báo cáo quy hoạch bảo tồn phát triển sâm Ngọc Linh giai đoạn 2014-2020 Sở Nông nghiệp Phát triển Nông thôn tỉnh Quảng Nam, sâm Ngọc Linh – năm tuổi bắt đầu hoa kết quả, bình quân cho từ 10 đến 30 hạt, tỉ lệ nảy mầm khoảng gần 70%, mầm phải chăm sóc cẩn thận vườn ươm – năm tuổi đem trồng Đối với phương pháp nhân giống đầu mầm, thu hoạch sâm, cắt lại phần đầu mầm thân rễ dài khoảng – cm, rải giàn vườn ươm tháng cho khô đất bên đem trồng với tỉ lệ sống đâm chồi đạt 65% Tuy nhiên, số 63 Bùi Văn Thế Vinh et al lượng sâm giống tạo chưa đáp ứng nhu cầu trồng trọt hàng năm Thêm vào chủ quan, thiếu kinh nghiệm cơng tác tạo giống làm cho tốn nhân giống sâm Ngọc Linh ngày trở nên khó khăn phức tạp Lai tạo phương pháp chọn giống phổ biến đối tượng trồng, cảnh ăn Tuy nhiên, sâm Ngọc Linh, việc chọn giống phương pháp lai tạo khó xảy suy giảm diện tích vùng sâm tự nhiên với việc sử dụng khơng kiểm sốt dẫn đến suy giảm đáng kể đa dạng di truyền, làm giảm tiềm di truyền quần thể tự nhiên loài đặc hữu quý Điều có nghĩa sâm Ngọc Linh có nguồn gene biết sử dụng cho mục đích lai tạo để tạo giống Do vậy, để đáp ứng nhu cầu nguồn giống ngày gia tăng nay, nhiều nghiên cứu tiến hành nhằm nhân giống vơ tính sâm Ngọc Linh (Nguyễn Ngọc Dung, 1995; Dương Tấn Nhựt et al., 2010) Gần đây, phát triển phương pháp vi nhân giống sâm Ngọc Linh thông qua đường phát sinh phôi vơ tính từ mẫu cấy (Bùi Văn Thế Vinh et al., 2014) Việc ứng dụng phương pháp phát sinh phơi vơ tính sâm Ngọc Linh hứa hẹn mang lại nhiều ưu điểm tạo số lượng lớn có chất lượng tốt thời gian ngắn, tỉ lệ sống sót vườn ươm cao phát triển từ phơi vơ tính theo đường tương tự phơi hữu tính Trong nghiên cứu nhân giống vơ tính lồi dược liệu, xác định mức độ đồng quần thể phương pháp phân tích định lượng hợp chất biến dưỡng thứ cấp Tuy nhiên, phương pháp phân tích cần số lượng mẫu lớn cần thời gian phát triển kéo dài Do đó, nhà khoa học thường sử dụng kỹ thuật phân tích di truyền RAPD để xác nhận mức độ ổn định mặt di truyền nhân giống vơ tính (Rani et al., 1995; Goto et al., 1998; Carvalho et al., 2004; Martins et al., 2004) Phương pháp sử dụng để đánh giá khác biệt mặt địa lý loại dược liệu (Mizukami et al., 1993; Nakai et al., 1996), xác định thuộc chi Panax (Shaw But, 1995) đánh giá quan hệ di truyền loài dược liệu hợp chất biến dưỡng thứ cấp chúng (Yamazaki et al., 1994) Trong nghiên cứu này, sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá ổn định di truyền sâm Ngọc Linh tái sinh thông qua đường 64 phát sinh phơi vơ tính qua trung gian mô sẹo Kết nghiên cứu giúp định hướng thiết lập quy trình nhân giống, giúp sản xuất sâm Ngọc Linh với số lượng lớn thời gian ngắn kỹ thuật vi nhân giống VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Nguồn mẫu ex vitro sử dụng mẫu sâm Ngọc Linh năm tuổi thu nhận từ khu vực di thực sâm Ngọc Linh rừng Quốc gia Bidoup Núi Bà thuộc huyện Lạc Dương, tỉnh Lâm Đồng (ký hiệu LD1, LD2, LD3, LD4); thu nhận từ nông trường sâm Ngọc Linh xã Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum (ký hiệu KT5, KT6); thu nhận từ trại sâm Ngọc Linh xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam (ký hiệu QN7, QN8, QN9, QN10) Nguồn mẫu in vitro sử dụng 32 nhân giống thông qua đường phát sinh phơi vơ tính qua trung gian mơ sẹo (Bùi Văn Thế Vinh et al., 2014) Phòng Sinh học phân tử Chọn tạo giống trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Phương pháp tách chiết DNA Các mẫu sâm Ngọc Linh sau thu nhận tách DNA tổng số theo quy trình kit EZ-10 Spin Column Plant DNA MiniPreps (Biobasics) Nồng độ DNA tổng số ước lượng cách điện di gel agarose 1%, nhuộm sản phẩm DNA gel agarose Edithium bromide nồng độ 10 mg/ml 15 phút Quan sát phân tích vệt băng đèn UV Nếu kết tách chiết tốt, không làm đứt gãy DNA, vệt băng sáng rõ nét ngược lại Phân tích thị RAPD Sử dụng 15 mồi RAPD có trình tự trình bày bảng Phản ứng PCR thực máy PCR Eppendorf với tổng thể tích phản ứng 25 µl gồm thành phần sau: 1,0 µl DNA tổng số (100 ng/µl), 2,5 µl mồi RAPD (0,2 µM), 12,5 µl MyTaq Mix hãng Bioline (1X), 9,0 µl ddH2O Trộn thành phần hỗn hợp chuyển vào máy PCR sau chạy theo chương trình cài đặt sẵn: chu kỳ 94°C phút, theo sau 40 chu kỳ (94°C 30 giây, 35°C phút, 72°C phút) cuối chu kỳ 72°C 10 phút Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(1): 63-73, 2015 Bảng Danh sách mồi RAPD sử dụng nghiên cứu STT Tên mồi Trình tự (5’-3’) Nguồn tham khảo OPA-05 AGGGGTCTTG Shim et al., 2003 OPA-08 GTGACGTAGG Shim et al., 2003 OPB-01 GTTTCGCTCC Shoyama et al., 1997 OPB-05 TGCGCCCTTC Shoyama et al., 1997 OPB-08 GTCCACACGG Shim et al., 2003 OPB-13 TTCCCCCGCT Shim et al., 2003 OPB-14 TCCGCTCTGG Shim et al., 2003 OPC-08 TGGACCGGTG Erin, Marla, 2012 OPC-15 GACGGATCAG Erin, Marla, 2012 10 OPD-11 ACCCGGTCAC Erin, Marla, 2012 11 OPD-20 GAGTCTCAGG Erin, Marla, 2012 12 OPE-11 GAGTCTCAGG Erin, Marla, 2012 13 OPF-05 CCGAATTCCC Erin, Marla, 2012 14 OPM-11 GTCCACTGTG Erin, Marla, 2012 15 OPO-08 CCTCCAGTGT Shoyama et al., 1997 Các băng DNA ghi nhận dựa có mặt chúng điện di mẫu nghiên cứu theo DNA thang chuẩn (DNA marker) Nếu vệt băng DNA (có kích thước cụ thể) xuất mẫu i không xuất mẫu j đồng thời xuất i j khơng xuất mẫu khác vệt băng DNA gọi băng đa hình Ngược lại, vệt băng DNA xuất tất mẫu nghiên cứu gọi băng đơn hình (Nguyễn Mạnh Hoa et al., 2014) Các băng DNA mã hóa dạng nhị phân, xuất băng DNA ký hiệu cịn khơng có ký hiệu Các số liệu sau xử lý phần mềm NTSYSpc 2.1 (Rohlf, 2008) để tính ma trận tương đồng đôi theo phương pháp UPGMA theo mức độ xa gần mặt di truyền vẽ thành sơ đồ hình TREE DISPLAY KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đánh giá di truyền sâm Ngọc Linh có nguồn gốc địa lý khác Sau tách chiết DNA tổng số từ nguồn vật liệu tiến hành điện di sản phẩm, kết hình cho thấy DNA tách chiết có băng vạch đậm, rõ nét không tạo vệt dài, chứng tỏ DNA tách với hàm lượng lớn, không bị đứt gãy, đạt tiêu chuẩn dùng cho phản ứng PCRRAPD Kết quan sát cho thấy có mồi khếch đại băng hình (OPB-13), 14 mồi cho sản phẩm khếch đại tất mẫu, có mồi (OPA-05, OPB-14) cho băng đồng hình (Bảng 2) Kích thước vệt băng khoảng từ 100 đến 2800 bp Kết thu tổng số 98 vệt băng/15 mồi với giá trị trung bình 6,5 vệt băng/1 mồi RAPD thị nhân ngẫu nhiên đoạn DNA genome sở phương pháp PCR dùng đoạn mồi Các mồi bắt cặp cách ngẫu nhiên vào DNA khuôn vị trí mà có trình tự bổ sung với Chỉ thị RAPD phát tính đa dạng đáng tin (sự đoạn nhiễm sắc, thay đổi, thêm bớt nucleotide, xen đoạn,… làm thay đổi kích thước đoạn khuếch đại) (Nguyễn Văn Giang et al., 2013) Tuy nhiên, phương pháp nhạy cảm với yếu tố tham gia phản ứng như: thành phần 65 Bùi Văn Thế Vinh et al phản ứng, điều kiện thí nghiệm, độ lặp lại, khoảng cách thích hợp điểm bắt cặp mồi đặc biệt nhiệt độ gắn mồi cần tuân thủ nghiêm ngặt quy trình (Shim et al., 2003) Hình Ảnh điện di sản phẩm tách chiết DNA 10 mẫu sâm Ngọc Linh   Hình Ảnh điện di sản phẩm RAPD 10 mẫu sâm Ngọc Linh có nguồn gốc khác với mồi OPB-01 (a), OPO-08 (b), OPE-11 (c), OPD-20 (d), OPC-08 (e) OPA-08 (f)   Kết trình bày bảng cho thấy tỉ lệ băng đa hình đạt tương đối thấp (5,1%) Đối với mồi nhân OPB-01, 100% số mẫu cho sản phẩm khuếch đại PCR Kết hình 2a cho thấy có vạch băng tạo với kích 66 thước dao động từ 300 đến 2800 bp, có băng đa hình với kích thước 1800 bp xuất mẫu sâm thu nhận từ Kontum (KT5, KT6) mẫu sâm thu nhận từ Quảng Nam (QN8, QN10) Trong mẫu sâm di thực Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(1): 63-73, 2015 trồng khu vực Cổng trời thuộc vườn Quốc gia Bidoup Núi Bà (Lâm Đồng) xuất vạch băng đa hình Tương tự vậy, mẫu KT5, KT6, QN8, QN10 tạo băng đa hình vị trí 1000 bp 10 mẫu phân tích cho vạch băng đồng hình có kích thước 400 600 bp thực phản ứng RAPD với mồi OPO-08 (Hình 2b) Sự khác số lượng vị trí băng cho biết khác trình tự DNA giống Bên cạnh đó, nhiều mẫu có vệt băng đa hình chúng xuất phát từ giống khác mặt địa lý (Nguyễn Thị Lang et al., 2007) Bảng Kết tổng hợp băng DNA phân tích 10 mẫu sâm Ngọc Linh có nguồn gốc khác thị RAPD với 15 mồi ngẫu nhiên STT Tên mồi Tổng số băng Số băng đa hình Tỉ lệ băng đa hình (%) OPA-05 0 OPA-08 0 OPB-01 16,7 OPB-05 0 OPB-08 0 OPB-13 0 OPB-14 0 OPC-08 12,5 OPC-15 10 0 10 OPD-11 0 11 OPD-20 11,1 12 OPE-11 11 9,1 13 OPF-05 11 0 14 OPM-11 0 15 OPO-08 25 Tổng 98 Trung bình 6,5 0,3 Trong tự nhiên, sâm Ngọc Linh phát triển chủ yếu tán rừng nguyên sinh ẩm, nhiều mùn, có nhiệt độ thích hợp ban ngày từ 20°C - 25°C ban đêm từ 15°C - 18°C độ cao 1700 - 2000 m núi Ngọc Linh thuộc huyện Đăk Tô, tỉnh Kontum huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam Từ năm 2010, tiến hành di thực trồng thử nghiệm sâm Ngọc Linh khu vực Cổng trời thuộc vườn Quốc gia Bidoup Núi Bà với hệ sinh thái rừng thuộc kiểu rừng kín thường xanh, rụng, độ cao trung bình từ 1700 - 1800 m, nhiệt độ 15 - 20°C, độ ẩm 80 90% Mặc dù có điều kiện tự nhiên, địa lý, khí hậu, thổ nhưỡng tương đối giống xét mặt hình thái, sâm Ngọc Linh sau năm phát triển Lâm Đồng có số phát triển (chiều cao cây, số lá, bề rộng lá) thấp so với độ tuổi 5,1 trồng núi Ngọc Linh Bên cạnh đó, màu sắc phản ánh khác biệt di thực (vàng) địa (xanh) (dữ liệu chưa cơng bố) Tuy có khác mặt hình thái kết đánh giá di truyền cho thấy tương đồng lớn nhóm LD1, LD2, LD3, LD4, QN7, QN9 KT5, KT6, QN8, QN10 (Hình 3) Kết bảng cho thấy hệ số di truyền tương đồng cặp cao (trên 92,8%) Hệ số tương đồng cao (đạt 100%) LD1, LD2, LD3, LD4 thu nhận tổng số 200 nhân giống vô tính trồng vườn Quốc gia Bidoup Núi Bà từ năm 2010 Hệ số tương đồng thấp QN8 QN9 (đạt 92,86%) 67 Bùi Văn Thế Vinh et al Xử lý phần mềm NTSYSpc 2.1 thu kết phân loại mẫu nghiên cứu theo phân loại (Hình 3) Theo phân loại dựa theo hệ số tương đồng di truyền chia 10 mẫu nghiên cứu thành nhóm chính, nhóm gồm LD1, LD2, LD3, LD4, QN7, QN9 có hệ số tương đồng 0,9820 nhóm gồm KT5, KT6, QN8, QN10 có hệ số tương đồng 0,9762 Bảng Bảng ma trận tương đồng 10 sâm Ngọc Linh có nguồn gốc khác Rows\Cols LD1 LD2 LD3 LD4 KT5 KT6 QN7 QN8 QN9 LD1 1.00000 LD2 1.00000 1.00000 LD3 1.00000 1.00000 1.00000 LD4 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 KT5 0.95918 0.95918 0.95918 0.95918 1.00000 KT6 0.95918 0.95918 0.95918 0.95918 0.97959 1.00000 QN7 0.97959 0.97959 0.97959 0.97959 0.93878 0.95918 1.00000 QN8 0.94898 0.94898 0.94898 0.94898 0.96939 0.96939 0.94898 1.00000 QN9 0.97959 0.97959 0.97959 0.97959 0.93878 0.93878 0.97959 0.92857 1.00000 QN10 0.96939 0.96939 0.96939 0.96939 0.98980 0.96939 0.94898 0.97959 0.94898 QN10 1.00000 Hình Sơ đồ mối quan hệ di truyền 10 sâm Ngọc Linh có nguồn gốc khác   Artyukova đồng tác giả (2000) phân tích đa dạng di truyền quần thể sâm Hàn Quốc (Panax ginseng) kỹ thuật RAPD kết luận mức độ đa dạng di truyền quần thể sâm tự nhiên (10,6%) cao so với quần thể sâm trồng (7,6%) Trong nghiên cứu khác, Li đồng tác giả (2011) tiến hành phân tích 282 68 thuộc 16 quần thể Nhân sâm khác kết luận mức độ đa dạng di truyền đạt 4,9% Đối với sâm Mỹ (Panax quinquefolius), Erin Marla (2012) tiến hành nghiên cứu đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể tự nhiên phát triển vùng Bắc Mỹ Kết nghiên cứu cho thấy mức độ đa dạng di truyền đạt 11% Mức độ đa dạng di Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(1): 63-73, 2015 truyền sâm Ngọc Linh nói riêng lồi thuộc chi sâm nói chung thấp, điều làm giảm tiềm di truyền quần thể dẫn đến hạn chế việc lai tạo để tạo giống Đánh giá ổn định di truyền sâm Ngọc Linh in vitro có nguồn gốc từ phơi vơ tính Trong nghiên cứu này, sử dụng 12 mồi ngẫu nhiên: OPA-08, OPB-01, OPB-05, OPB-08, OPC-08, OPC-15, OPD-11, OPD-20, OPM-11, OPO-08, OPE-11, OPF-05 để phân tích tính ổn định di truyền 32 in vitro có nguồn gốc từ phơi vơ tính Kết nhận 12 mồi cho biểu băng đồng hình có kích thước 100 - 2800 bp (Hình 4) Tính đồng mặt di truyền yêu cầu tiên kỹ thuật vi nhân giống loại trồng (Carvalho et al., 2004; Martins et al., 2004) Tuy nhiên, vấn đề nuôi cấy in vitro xuất biến dị soma dịng vơ tính có nguồn gốc từ mẹ ban đầu (Larkin Scowcroft, 1981) Dạng biến dị công bố xảy số lồi thực vật cung cấp thêm nguồn tính trạng phục vụ cho công tác chọn tạo giống trồng tương tự dạng đột biến hóa chất vật lý (Skirvin et al., 1993; Jain, 1998; Moghaieb et al., 2010) Các biến dị soma dự đốn trước di truyền khơng A B C D Hình Ảnh điện di sản phẩm RAPD sâm Ngọc Linh in vitro có nguồn gốc từ phơi vơ tính với mồi OPB-01 (A), OPO08 (B) OPB-05 (C, D)   Để phát biến dị soma xảy trình ni cấy mơ tế bào thực vật, nhiều kỹ thuật phân tích di truyền sử dụng thường cho biết thay đổi nhiễm sắc thể mà không đánh giá biến đổi gene riêng biệt (Reda et al., 2011) Các kỹ thuật phân tích isozyme phương pháp thuận lợi để xác định biến đổi mặt sinh hóa phương pháp thường bị giới hạn số lượng thị (Brown et al., 1993) Một kỹ thuật xác định xác thay đổi trình tự gene chuyên biệt RFLP Tuy nhiên, phương pháp đắt tiền tốn thời gian kết giới hạn trình tự gene sử dụng mẫu dò (Brown et al., 1993) Nhiều nhà khoa học khẳng định sử dụng kỹ thuật phân tử dựa vào PCR RAPD, ISSR hay ALFP để đánh giá tính ổn định di truyền nuôi cấy in vitro nhiều loài thực vật khác Prunus dulcis (Martins et al., 2004), Malus domestica (Modgil et al., 2005), Pinus thunbergii (Goto et al., 1998), Brassica oleracea (Leroy et al., 2001), Digitalis obscura (Gavida et al., 1996) Kỹ thuật RAPD sử dụng để xác nhận tính ổn định di truyền vi nhân giống chồi Pinus thunbergii (Goto et al., 1998), nhân chồi nách hạt dẻ (Carvalho et al., 2004) hạnh nhân (Martins et al., 2004) Trong đó, biến dị di truyền báo cáo vi nhân giống 69 Bùi Văn Thế Vinh et al số loài thực vật Pinus tremuloides (Rahman Rajora, 2001) Actinidia deliciosa (Palombi Damiano, 2002) nhờ sử dụng thị RAPD Mặc dù nghiên cứu không phát khác biệt mặt di truyền nhiên số dạng biến dị xảy mà không phát đột biến điểm xảy ngồi vị trí bắt cặp mồi ngẫu nhiên sử dụng Các đột biến tạo thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy, nồng độ tỉ lệ auxin-cytokinin, thời gian nuôi cấy kéo dài, điều kiện không tự nhiên môi trường nuôi cấy gây stress in vitro, nhịp ngày đêm bị thay đổi (Modgil et al., 2005) Các mô thực vật ni cấy phải chịu stress oxi hóa nhiều mức độ khác gốc oxi tự tạo bên tế bào, gốc oxi tự nguyên nhân gây tổn thương DNA (Jackson et al., 1998) Trong nghiên cứu này, khơng có khác biệt băng hình tạo 12 mồi ngẫu nhiên 32 in vitro nhân giống thông qua đường phát sinh phơi vơ tính Bên cạnh đó, kết phân tích mức độ tương đồng di truyền 32 in vitro có nguồn gốc từ phơi vơ tính đạt 99% (Hình 5) Do đó, phương pháp sử dụng để nhân giống sâm Ngọc Linh với số lượng lớn với độ ổn định di truyền cao Cây in vitro chuyển vườn ươm trồng loại giá thể khác (đất mùn đất Dasi) đạt tỉ lệ sống sót tương ứng 62% 57% sau tháng trồng (Hình 6) Hình Sơ đồ mối quan hệ di truyền 32 sâm Ngọc Linh in vitro có nguồn gốc từ phơi vơ tính   Hình Cây sâm Ngọc Linh có nguồn gốc từ phơi vơ tính trồng giá thể đất mùn (a) đất Dasi (b)   70 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(1): 63-73, 2015 KẾT LUẬN Khi sử dụng thị RAPD đánh giá mối quan hệ di truyền 10 sâm Ngọc Linh có nguồn gốc khác cho thấy mức độ tương đồng cao (trên 92,86%) Đối với sâm Ngọc Linh in vitro có nguồn gốc từ phơi vơ tính, mức độ ổn định di truyền đạt 99% Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn Dự án sản xuất thử nghiệm “Ứng dụng hệ thống chiếu sáng đơn sắc (LED) nghiên cứu nhân nhanh Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) với số lượng lớn phục vụ nhu cầu nhân giống tỉnh Quảng Nam.)” (Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam) hỗ trợ kinh phí cho nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Artyukova EV, Kozyrenko MM, Koren OG, Muzarok TI, Reunova GD, Zhuravlev YN (2000) RAPD Analysis of the genome variability of planted Ginseng, Panax ginseng Mol Biol, 34: 297-302 Brown PTH, Lang FD, Kranz E, Lorz H (1993) Analysis of single protoplasts and regenerated plants by PCR and RAPD technology Mol Genet Genomics, 237: 311-317 Bùi Văn Thế Vinh, Vũ Thị Thủy, Thái Thương Hiền, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Phúc Huy, Trịnh Thị Hương, Vũ Thị Hiền, Lê Kim Cương, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt (2014) Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình phát sinh phơi vơ tính sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 12(1): 73-84 Carvalho LC, Goulao L; Oliveira C; Goncalves JC, Amancio S (2004) RAPD assessment for identification of clonal identity and genetic stability of in vitro propagated chestnut hybrids Plant Cell Tiss Org Cult, 77(1): 23-27 Dương Tấn Nhựt, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Trực, Nguyễn Bá Nam, Trần Xuân Tình, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Văn Bình, Vũ Thị Hiền, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Cửu Thành Nhân, Lê Nữ Minh Thùy, Lý Thị Mỹ Nga, Thái Thương Hiền, Nguyễn Thành Hải (2010) Nhân giống vơ tính sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(3B): 1211-1219 Erin MS, Marla SM (2012) RAPD-based assessment of genetic relationships among and within American ginseng (Panax quinquefolius L.) populations and their implications for a future conservation strategy Genet Resour Crop Evol, 59: 1553–1568 Gavida I, Agudo LC, Pérezbermúdez P (1996) Selection and long-term cultures of high-yielding Digitalis obscura plants: RAPD markers for analysis of genetic stability Plant Sci, 121(2): 197-205 Goto S, Thakur RC, Ishii K (1998) Determination of genetic stability in long-term micropropagated shoots of Pinus thunbergii Parl using RAPD markers Plant Cell Rep, 18(3-4): 193-197 Jackson AL, Chen RU, Lawrence LA (1998) Induction of Microsatellite instability by oxidative DNA damage Proc National Academy Sci Uni States America, 95 (21): 1246812473 Jain SM (1998) Plant biotechnology and mutagenesis for sustainable crop improvement Crop Improvement for Stress Tolerance (Eds Behl et al.) CCSHAU, New Delhi, India: 218-232 Larkin PJ, Scowcroft WR (1981) Somaclonal variation – a novel source of variability from cell cultures for plant improvement Theor Appl Genet, 60: 197-214 Leroy XJ, Leon K, Hily JM, Chaumeil P, Branchard M (2001) Detection of in vitro culture induced instability through inter-simple sequence repeat analysis Theo App Gen, 102(6-7): 885-891 Li S, Li J, Yang XL, Cheng Z, Zhang WJ (2011) Genetic diversity and differentiation of cultivated ginseng (Panax ginseng C A Meyer) populations in North-east China revealed by inter-simple sequence repeat (ISSR) markers Genet Resour Crop Evol, 58: 815-824 Martins M, Sarmento D, Oliveira MM (2004) Genetic stability of micropropagated almond plantlets as assessed by RAPD and ISSR markers Plant Cell Rep, 23(7): 492-496 Mizukami H, Ohbayashi K, Umetsu K, Hiraoka N (1993) Restriction fragment length polymorphisms of medicinal plants and crude drugs II Analysis of Glehnia littoralis of different geographical origin Biol Pharm Bull, 16: 611612 Modgil M, Mahajan K, Chakrabarti SK, Sharma DR, Sobti RC (2005) Molecular analysis of genetic stability in micropropagated apple rootstock MM106 Sci Hort, 104(2): 151-160 Moghaieb REA, Abdel-Hadi AA, Ahmed MRA, Hassan AGM (2010) Genetic diversity and sex determination in date palms (Phoenix dactylifera L.) based on DNA markers Arab J Biotechnol, 13(2): 143-156 Nakai R, Shoyama Y, Shiraishi S (1996) Genetic characterization of Epimedium species using random amplified polymorhic DNA (RAPD) and PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) diagnosis Biol Pharm Bull, 19(1): 67-70 Nguyễn Mạnh Hoa, Bùi Thị Thu Hương, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn (2014) Đánh giá đa dạng di truyền số 71 Bùi Văn Thế Vinh et al dòng, giống hoa chi Lan Huệ (Hippeastrum herb.) thị phân tử RAPD Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 30(1): 18-25 Nguyễn Ngọc Dung (1995), Nhân giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) đường sinh học NXB Nông nghiệp: 43-100 Nguyễn Thị Lang, Nguyễn Đức Thuận, Bùi Chí Bửu (2007) Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống đậu nành thị phân tử RAPD SSR Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 5(2): 233-245 Nguyễn Văn Giang, Vũ Ngọc Lan, Tống Văn Hải (2013) Nghiên cứu đa dạng di truyền khoai môn - sọ thị phân tử DNA Tạp chí Khoa học Phát triển, 11(1): 1-6 Palombi MA, Damiano C (2002) Comparison between RAPD and SSR molecular markers in detecting genetic variation in kiwifruit (Actinidia deliciosa A Chev) Plant Cell Rep, 20(11): 1061-1066 Rahman MH, Rajora OP (2001) Microsatellite DNA somaclonal variation in micropropagated trembling aspen (Populus tremuloides) Plant Cell Rep, 20(6): 531-536 Rani V, Parida A, Raina SN (1995) Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers for genetic analysis in micropropagated plants of Populus deltoids Marsh Plant Cell Rep, 14: 459-462 Reda EAM, Abdel-Hadi AAH, Mohamed RAA (2011) Genetic stability among date palm plantlets regenerated from petiole explants African J Biotechnol, 10(65): 14311-14318 Rohlf FJ (2008) NTSYSpc: Numerical Taxonomy System, ver 2.10 Exeter Publishing, Ltd: Setauket, NY Shaw PC, But PPH (1995) Authentication of Panax species and their adulterants by random-primed polymerase chain reaction Planta Med, 61: 393-492 Shim YH, Choi JH, Park CD, Lim CJ, Cho JH, Kim HJ (2003) Molecular Differentiation of Panax Species by RAPD Analysis Arch Pharm Res, 26(8): 601-605 Shoyama Y, Zhu XX, Nakai R, Shiraishi S, Kohda H (1997) Micropropagation of Panax notoginseng by somatic embryogenesis and RAPD analysis of regenerated plantlets Plant Cell Rep, 16: 450-453 Skirvin RM, Norton M, McPheeters KD (1993) Somaclonal variation: has it proved useful for plant improvement Acta Hort, 336: 333-340 Sở Nông nghiệp Phát triển Nông thôn tỉnh Quảng Nam (2015) Quy hoạch bảo tồn phát triển sâm Ngọc Linh địa bàn huyện Nam Trà My tỉnh Quảng Nam giai đoạn 2014-2020 Yamazaki MA, Sato A, Shimomura K, Saito K, Murakoshi I (1994) Genetic relationships among Glycyrrhiza plants determined by RAPD and RFLP analyses Biol Pharm Bull, 17: 1529-1531 ANALYSIS OF THE GENETIC STABILITY OF NGOC LINH GINSENG (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) USING RAPD MARKERS Bui Van The Vinh1, Vu Thi Thuy2, Hoang Thanh Tung2, Vu Thi Hien2, Tran Xuan Tinh2, Do Khac Thinh3, Duong Tan Nhut2, * Ho Chi Minh City University of Technology Tay Nguyen Institute for Scientific Research, Vietnam Academy of Science and Technology Institute of Agricultural Science for Southern Vietnam, Vietnam Academy of Agricultural Sciences SUMMARY In the current paper, random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers were used to evaluate genetic of native Ngoc Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) derived from Ngoc Linh mountain (area of Kontum and Quang Nam provinces) and acclimatized plants cultured in Bidoup national park (area of Lam Dong province) PCR products were electrophoresed on a 1.5% agarose gel and showed 93 monophorphic bands and polymorphic bands (5.1 %) Out of 15 primers screened, OPA-05 and OPB-14 produced a single monomorphic band whereas OPA-13 resulted in no band pattern The electrophoresis of PCR products of RAPD markers were scrored in a binary matrix and then used to generate genetic matrix using NTSYSpc 2.1 software This similarity matrix was then used for clustering of the genotypes by SAHN of the software by UPGMA (unweighted pair group with arithmetic mean) The results indicated that 10 plants were grouped into clusters: group included plants (LD1, LD2, LD3, LD4 derived from Lam Dong and QN7, QN9 derived from Quang Nam), group included plants (KT5, KT6 derived from Kontum and QN8, QN10 derived from Quang Nam) with similarity coefficient of 0.9820 and 0.9762, respectively 12 remain primers were used to                                                                                                                         *  Author for correspondence:Tel:+84-63-3831056; Fax:+84-63-3831028;E-mail: duongtannhut@gmail.com 72 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(1): 63-73, 2015 evaluate genetic stability of regenerants obtained through somatic embryogenesis The data showed that there were no visually detectable differences in phenotype were observed between 32 somatic embryo derived plantlets The plantlets were successully transferred to the nursery garden with the survival rate above 60 % The results indicated the usefulness of somatic embryogenesis in mass propagation of this precious and economic medical herbal with high genetic stability Keywords: Genetic stability, Ngoc Linh ginseng, Panax vietnamensis, RAPD marker, somatic embryos 73 View publication stats