Đánh giá tính đa dạng di truyền nhờ chỉ thị phân tử rapd pcr và khả năng sinh tổng hợp sinensetin ở loài cây thuốc có tiềm năng xuất khẩu ở việt nam orthosiphon stamineus benth

Đ Ạ I H Ọ C Q U Ố C G IA H À N Ộ I TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HOC Tự NHIÊN Q ĐỀ TÀI NGHIÊN c ú u KHOA HỌC ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỂN n h c h ỉ t h i p h â n t RAPD-PCR VÀ KHẢ NĂNG SINH T ổN G HỢP SINENSETIN LỒI CÂY THUỐC CĨ TIỀM NĂNG XT KHAL v i ệ t n a m ORTHOSIPHON STAMINEƯS BENTH (BÁO CÁO TỔNG HỢP) Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Lê Duy Thành Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Hà Nội, - 2007 Để tài hoàn thành với sư tài trợ cua Đại hoc Quốc gia Hà Nội (Mã sỏ: QG.04.28) DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THựC HIỆN ĐỂ TÀI PGS.TS Lê D uy T hành, Trường Đ ại học K h o a học Tự nhiên, Đ H Q G H N TS Đ inh Đ oàn Long, Trường Đại học K ho a học T ự nhiên, Đ H Q G H N T h.s H ồn g Thị H ịa, Trường Đại học K h o a học T ự nhiên, Đ H Q G H N PGS.TS Trịnh Đ ình Đạt, Trường Đại học K h o a học Tự nhiên, Đ H Q G H N TS N g uy ễn V ăn Tập, V iện Dược liệu, Bộ Y tế ThS P hạm T h a n h H uy ền, V iện Dược liệu, Bộ Y tế TS N g u yễn Bích T hu, V iện Dược liệu, Bộ Y tế LỜI CẢM ƠN Đ ề tài h o àn th àn h với tài trợ Đ ại họ c Q u ố c gia H Nội, thuộc diện Đ ề tài đặc biệt, m ã số: Q G 04 N h ân dịp này, tập thể cán thực đề tài xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ủng hộ giú p đ ỡ củ a Đ ại học Q u ố c gia Hà Nội Trong qu trình thực đề tài, cán củ a Ban chức n ăng thuộc Đại học Q uốc gia Hà N ội tạo m ọi điều kiện thuận lợi đê ch ú n g tơi hồn thành công việc đ ả m nhận Chúng xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến lãnh đạo Trường Đại học K hoa học Tự nhiên, P h òn g ban chức n h trường, Ban nhiệm K hoa Sinh học, Ban g iám đốc T run g tâm Sinh học P hân tử C ôn g ng h ệ T ế bào luồn tạo điều kiện ủng hộ để đề tài triển khai thuận lợi Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn đến cán củ a Bộ m ô n Di truyền học, Trường Đại học K h o a học T ự nhiên; K hoa Tài n g u y ên Dược liệu K ho a Phân tích tiêu chuấn, V iện Dược liệu úng hộ hợp tác với c h ú n e tơi chu n q trình thực đề tài Thay mặt nhóm nghiên cứu PGS.TS Lé Duy Thành TÓM TẮT ĐỂ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Tên Đề tài: "Đ ánh giá tính đa dạng di truyền n hờ chí thị phân tử RA PD -PCR khả sinh tổng hợp sinensetin lồi thuốc có tiềm xuất Việt N am Orthosiphon stamineus Benth." C hủ nh iệm đ ề tà i: PGS.TS Lê Duy Thành C quan chủ trì đ ề tài: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN C quan p h ố i hợp thực hiện: Viện Dược Liệu, Bộ Y tế Mục tiêu nội dung Để tài Đ ề tài thực với mục tiêu sau: (1) Thu thập 10 dịng Râu m èo từ m ột số địa phương khác Việt Nam; (2) X ác định k ho ản g cách (mối qu an hệ) di truyền quần thể m ẫu việc phân tích chí thị R A P D -P C R ; (3) Phân tích biến độn g thành phần hợp chất có ho ạt tính sinh học sinensetin từ m ẫu thu thập n hằm chọn d ò n g R âu m èo có h àm lượng dược chất sinensetin cao phục vụ công tác bảo tồn phát triển nguồn n g uy ên liệu làm thuốc; (4) Bước đầu đề xu ất m ột số phư ơng án bảo tổn, chọn, tạo g iốn g n h ằm phát triển n g u n n g u y ên liệu làm thuốc từ Râu m èo V iệt N a m sở kết q uả đ án h giá tính đa dạng di truyền nhờ sử dụn g thị R A P D -P C R C c nội dụng nghiên cứu đ ề tài gồm có: (1) Đ iều tra thu thập m ẫu thực vật từ quần R âu m èo 0O ríhosiphon stam ìneus Benth.) từ m ột số địa phương khác Việt N a m phục vụ cho nghiên cứu phân tích cấu trúc A D N th àn h phần hó a học, (2) N s h iê n cứu hoàn thiện q u y trình tách chiết A D N , p hán tích chi thị R A P D -P C R loài th u ố c R âu m èo Việt N am (3) N g h ién cứu h ồn thiên quy trình chiết x uất phân tích thành p hần sin ensetin từ Orthosiphon sĩam ineus Benth kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp R P -H P L C (4) Xác đ ịnh m ứ c độ k hác biệt (đa dạng) vể m ặt di tru y ề n thành phần sinensetin quần thể Orthosiphon stam ỉneus Benth củ a Việt N am n h ằ m định hướng bảo tổn, chọn, tạo g iố ng phát triển loài thuốc q uý Việt N am tương lai Kết - K ế t q u ả k h o a h ọ c : Đ ã thu thập 10 d ò ng Râu m èo (Orthosiphon stamineus Benth.) trồng địa phương khác Việt N am (H Nội, Thanh Hóa, Phú Thọ, Q u ản g Nam ) K ết q uả p hân tích R P -H P L C cho thấy dược chất sinensetin có m ật dịch chiết củ a tất dò n g R âu m èo thu thập Tuy vậy, hàm lượng hợp chất dao độn g, từ 0,00 % đến ,1 88 % (hàm lượng chất khô) Sinensetin có thân, hàm lượng vết (thấp k ho ản g 30 lần so với lá) Trên sở kết phân tích R P -H P L C chọn lọc dòng T H (thu T h a n h H óa) có hàm lượng sinensetin cao - Đ ã xây dựng q uy trình tách chiết A D N p hân tích thị R A P D -P C R nhằm đánh giá tính đa d ạng di truyền xác định k h o án g cách di truyền d ò n g R âu M èo khác thu thập n g h iên cứu K ết phân tích cho thấy dịn g R âu M èo có m iền Bắc nước ta có tính đa dạng di truyền k h ô n g cao tương q uan với vị trí phân b ố địa phương - K h ơn g có tương q u an chặt biến đ ộ n g h m lượng sinensetin khác biệt m ặt di truy ền dòn g R âu M èo k h ác n h au cho thấy có thê yếu tố m i trường có ảnh hưởng trực tiếp (bên cạn h yếu tố kiểu gen) đến k n ăn g tổn g hợp tích lũy sinen setin R âu M èo Kết q u ả n g h iên cứu đề tài thời k h ẳn g định: m hình sử dụng kỹ thuật p hân tích thị phân tử (A D N ), h ó a học m ộ t số biện pháp công nghệ sinh học, nh ni cấy m thực vật in vitro áp dung n h ằm m ục đích bảo tồn phát triển n e u n gen dược liệu tiêu chuẩn hóa nguồn n g u y ên liệu làm thuốc từ loài th áo dược Việt N am tương lai - K ế t q u ả ứ n g d ụ n g : T hiết lập 01 q u y trình kỹ th uật chiết xuất phán tích dược chất sin en setin từ dòn g R âu m èo V iệt N am 01 quv trình IV p hân tích thị A D N từ dò n g R âu m èo Việt N a m bàng phương pháp R A P D -P C R - K ế t q u ả đ o tạo: Đ tạo 01 Cử n hân hệ Đ tạo Cứ nhân K hoa học Tài (SV T rần T uấn Tú, K hoá 7, tốt n g h iệp n ăm 2006) Đ ang tiếp tục đào tạo m ột NC S T iến sĩ (ThS V ũ H oài Sâm, K h o a Sinh học Trường Đ ại học K h oa học Tự nhiên) - K ế t q u ả cô n g bố: Đ ã công b ố 01 b áo T iến g A nh Tạp chí K hoa học, Đ ại học Q u ốc gia H Nội; 02 b áo Tiếng A n h khác cơng b ố Tạp ch í K ho a học, Đại học Q uốc gia H N ội có m ột phần nội dung liên quan đến đề tài Tình hình sử dụng kinh phí: - Số kinh phí cấp: 60 0 0 0 đồng (Sáu mươi triệu đồng) - Số kinh phí sử dụng : 60.000.000 đổn g (Sáu mươi triệu đồnạ) Đã toán Khoa quản lý Chủ nhiệm đề tài PGS.TS Lê Duy Thành T R Ư Ờ N G Đ A I H Ọ C K H O A H O C TI T ự N H IÊ N V SUMMARY SCIENTIFIC RESEARCH PROJECT Title o f project : “A ssessm en t o f genetic p o ly m o rp h ism o f V ietnam ese exportable m edicinal plant Orthosiphon stam ineus Benth using R A P D -P C R m arkers in relation with the biosynthesis o f sinesetine” Number code: QG.04.28 Grant holder: Prof Dr Le Duy Thanh Instỉtutỉon: Hanoi University o f Science, Vietnam National ưniversity Associated institution: Vietnam Institute o f Medicinal Materials, Ministry o f Health Objects and contents of project O b ịe c ts : (1) collection o f at least ten accessions o f O rthosiphon stam ineus Benth from different locations in V ietnam ; (2) determ in atio n o f genetic distance o f the population sam ples using R A P D -P C R m arkers; (3) analysis o f variation o f the content o f bioactive c o m p o u n d - sinensetin fro m the collected sam ples, in order to find the accession s w hich have high ten t o f sinensetin and use for conservation and d ev elo p m en t of m edical m aterials resource; (4) first proposition o f som e m eth o d s for conservation, selection and breeding, aim ed for the dev elo pm en t the m ed ical m aterials from O rthosiphơn stam ìneus in V ietnam and evaluation o f the genetic diversity using R A P D -P C R C o n ten ts: (1) Investigation and collection o f plant sam ples fro m populations of Orthosiphon stam ineus Benth in different locations oí' V ietnam w hich used for analysis o f D N A ch aracterizatio n and ch em ical com p o sitio n s; (2) Study for co m pletion o f D N A extraction procedure, an aly sis o f R A P D -P C R m ark ers from O rthosiphon stam in eu s Benth.; (3) Study for co m p letio n o f extractio n procedure and co m p o sitio n an aly sis o f sinensetin from O rtliosiphon stam ineus Benth using R P -H P L C m ethod; (4) Identification o f gen etic d iv ersity and variaties of VI sinensetin ten t in Orthosiphon stamineus Benth fro m different populations in V ietnam , aim in g to the direction o f conservation, selection, breeding and d evelop m ent o f this valuable m edicinal plant in V ietn am in future Results - Scientific results : (1) Collected ten accessions o f O rthosiphon stamineus Benth., w hich are plated at different areas in V ietn am (H anoi, T hanh Hoa, Phu T ho and Q u an g N am ) The results o f R P -H P L C analysis shovved that sinensetin exists in extract from leaves o f all collected accession s o f Orthosiphon stamineus Benth H ow ever, these contents are variable, fro m 0 % to 0.18 8% (dry m aterials) Sinensetin presents in stem, but in trace co n ten t (low er 30 times than that in leaves) Based on results o f R P -H P L C analysis, we have collected the accession T H (collected from T hanh H oa), w hich has h ig h est sinensetin content (2) D esigned the D N A extraction and R A P D -P C R analysis procedure, used for assessm ent o f genetic diversity and identification o f genetic distance of different accessions o f Orthosiphon stam ineus Benth The results show that accessions o f O rthosiphon stam ineus Benth p resenting in N othern o f V ietnam have low genetic diversity and co rresponding to locations o f their distibution (3) T here is no close c o rresp o n d en ce betv/een the variation o f tent o f sinensetin and difference o f gen etic characteristics o f d ifferent accesstion s o f Orthosiphon stamineus, w hich reflects the direct affection o f e n v iro n m e n ta l factors to potential o f syn thesis and acu m m u latio n o f sinensetin in O rthosiphon stamineus The results co n firm e d that the m od el o f an aly sis te c h n iq u e s using m olecular m ark er (D N A ), ch em ical m ark ers and b io tech n o lo g y as in vitro plant tissue propagation could be used for conservation, d ev elo p m en t gene pool o f m edicinal plants and stan dardization o f m aterials from m edicinal plants in V ietnam - A p p lie d results: E stab lism en t o f 01 proced ure o f ex tractio n and analysis of sinensetin from V ietn am Orthosiphon stam ineus, 01 p ro ced u re o f analysis D N A m a rk e r from O rthosiph on stam ineus u sin s R A P D -P C R m eth od - Training resu lts: 01 Bachelor (H o no r B achelor T rain in g P rog ram in Biological Sciences - T ran T u a n Tu, lh Course, 2006), 01 PhD student in progress - Publications: 01 paper (in English) publised in the Jounal o f Science, V N U (2006); 02 o ther related papers published also in the Jounal o f Science, V N U (2005 and 2006) Grant holder Assc Prof Dr Le Duy Thanh V 111 M Ụ C LỤC T rang Mở đ ầ u 1 Tổng quan tình hình nghiên cứu n c 1.1 Tổng quan Râu mèo (Orthosiphon stamineus B en th ) 1.1.1 Phân loại học thực vật, phân bố tên g ọ i 1.1.2 Hình thái học thực v ậ t 1.1.3 Trồng t r ọ t 1.1.4 Công dụng y học cổ tr u y ề n 1.1.5 Các hợp chất sinh học b i ế t 1.1.5.1 Các hợp chất íla v o n o id 1.1.5.2 Các hợp chất d ite rp e n 1.1.5.3 Các hợp chất k h c 1.1.6 Các nghiên cứu dược lý học lâm s n g 10 1.1.7 Các định sử dụng chữa b ệ n h 13 1.2 Sử dụng thị ADN (RAPD-PCR) hóa học nghiên cứu phát triển loài dược l i ệ u 15 1.2.1 Giới thiệu c h u n g 15 1.2.2 Chỉ thị ADN hóa học công tác kiểm định dược l i ệ u 17 1.2.3 Chỉ thị ADN nghiên cứu đa dạng di truyền th u ô c s 19 1.2.4 Sử dụng chi thị RAPD-PCR hóa học chọn, tạo giống t h u ố c 19 1.2.2 Chi thị ADN hóa học công tác kiểm định dược l i ệ u 17 1.3 Các nội dung nghiên cứu đề t i 20 Thời gian, địa điểm phương pháp nghiên cứu 22 2.1 Thời gian n g h iê n c ứ u 22 2.2 Đ ịa điểm n g h iê n c ứ u 22 2.3 Phương pháp nghiên c ứ u 22 2.3.1 Chuẩn bị mẫu thực v ậ t 22 2.3.2 Các hợp chất sử dụng nghiên c ứ u 23 2.3.3 Chiết xuất phân tích thành phần sinensetin băng R P - H P L C 23 2.3.4 Các thí nghiệm phân tích thị R A P D -P C R 26 Kết bàn l u ậ n 28 3.1 Kết điều tra thu thập Râu Mèo địa p h n s 28 3.2 Phân tích thành phđn sinensetin dòng Râu mèo Việt N a m 31 IX /itro p r o p a g a tio n o f V i e t n a m e x e m e d i c i n a l plant 139 om PhytoPharm ica® , USA) and Kim Tien Thao - Rau Meo™ (from Fidofarm, etnam) h as been com m erciahzed and commonly used in treatm en t of kidney stones ìnary trac t and ren al diseases U ntil today, however, in Vietnam except for a few ;asional studies on th e distribution of Orthosiphon stam ineus Benth no ĩurther ort has been done to establish an effìcient protocol for conservation and production of is valuable m edicinal p lan t species U nder these circum stances, our study was subjected to establish a protocol for in,ro propagation of Vietnamese Orthosiphon stamineus genotypes Such a protocol could utilized not only for the production and conservation of this medicinal plant species, it also as an adjunct m ethod for the improvement and standardization of its herbal oducts M a te ria ls a n d m e th o d s P l a n t m a t e r i a l s In order to collect sam ples for the study, several trips of field survey were carried it in order to investigate the distribution sites of Orthosiphon stam ineus Benth These irveys resulted in the íìnding of several populations scattering in Hanoi and Thanh oa provinces The species identiíĩcation of collected specimens was performed by )tamsts a t the V ietnam N ational Institute of Medicinal M aterials (NIMM), and their mchers were deposited to the Herbarium in the same institute Some plants selected om each populat.ion were then transferred to the laboratory, and used as donor plants r plant tissue culture experim ents M e t h o d s The m eristem atic tissues of shoot tips and axillary buds vvere excised ừom the Dnor p lants by sterile scalpels, and then thoroughly \vashed for 5-10 m inutes under le tap-w ater They were soaked in a mild detergent solution for 1-2 minutes, and nsed under the tap-w ater until all detergent residues were removed For the purpose : surface-sterilization, the p lan t materials were immersed in 70% ethanol for about 30 ĩconds and then treated \vith 5% NaOCl solution or HgClọ solutions (0.1 and %) for 0-20 m inutes Finally, they were washed thoroughly for several tim es in sterile istilled w ater, beĩore cutting ìnto sections of o.õ to l.Ocm as explants, and inoculated Ito a regeneration medium The surface-stenlization and inoculation of explants were eríormed in a sterile flow cabinet The m edia used in the study vvere mainly based on the basal MS medium V lurashige a n d S k o o g , ) s u p p l e m e n t e d w it h g r o w th r e g u la t o r s a n d s o m e o th e r ompounđs according to ainís of experim ents The explants after inoculation were l a i n t a i n e d in t h e c u l t u r e r o o m u n d e r c o n t ro l le d c o n d i t i o n s ( t e m p e r a t u r e : : , h hotopenod and photo intensity of ca 1500 - 20000 lux) Every four weeks the - f -—XI unless mentioned othenvise 140 Tran Tuan Tu, Tran Du Chi Le H ong Dicp Results an d d is c u s s io n 3.1 Decontamination of in itia l explants All of the p la n t m a te ria ls were generally disinfected before transíernng intc culture m edia In our study, th e surĩace sterilization of plant m aterials was períormec in sodium hypochlorite solution (5% for 20 m inutes) and/or m ercunc chlorite soiution: (0.1 and % for 15 or 20 m inutes) The data shown on Table mdicate th a t'th i efficiency of obtaim ng s te n le p lan t m aterials depended on disinfectant reagents thei concentrations, and d u ratio n of treatm ent In th is study, the 5% NaOCl solution appeared ineffĩcient in decontaminating thi explants of O rthosiphon stam ineus plants After weeks, all the explants treated b' this tre a tm e n t w ere íound still contam inated with either fungi and/or bacteria Whereas, th e H gC l solutions seemed to be more effective as stenle explants wer successfully achieved from two of the three treatm ents using HgCl2 Accordingly in th treatm ent u sin g the % HgCl solution for 20 m inutes, totally 46.4% explants wer decontam inated successĩully and become regenerable under culture condition a revealed by la te r experim ents This treatm ent was found the best among the differen treatm ents which were tested in this study The use of a higher concentration of HgC! solution, i.e %, resu lted in a lower efficiencv, mainly because more dead explant were observed a fte r few days of treatm ent Tab/e Efficacy of different disiníectant reagents in decontaminating Orthosiphon stamineus explants for in-vitro propagation Disinỉectant reagents NaOCI HgCI2 Percentage of Concentration (%) Duration of treatment Number of treated contaminated and dead (minutes) explants explants (%) Percentage of sterile explantí (%) 5.0 10 60 100.0 ũ.ũ 0.1 20 56 53.6 46.4 0.2 15 54 77.8 22.2 0.2 20 40 100.0 0.0 Regeneration o f shoots in-vitro As we know, invitro propagation of a plant species can be achieved via three pathways: (i) in-vitro nultiplication of apical ihoots or ax illary buds m eristem atic tissues), ii) form ation of ■dventitious shoots Via allusing or directly from xplanted tissu es, and ư: 6,0 5.0 c 4,0 c co ,0 ú c "3 2,0 1.0 Day D ay D a y 14 D a y 21 D a y 2S C u ltu re tim e — ỊBAP) = ,0 mg/1 [BAP] = 0.10 m&T I - [BAPJ = 0,50 mg/1 [BAP] = 0,70 mgT —A— ỊBAP) = mg/] Fig 1, Effects of BAP on the regeneration rate of Orthosiphon in-vitro (medium supplemented wi!h ũ.05 •vitro p r o p a g a t io n o f V i c t n a m e s e m e d i c i n a l plant 141 ii) íbrm ation of adventitious som atic embryos or embrycnlike structures Hovvever the ỉnetic and phenotypic v ariatio n of regenerated plants usually depends on the method re g en e tio n employed The two la tte r pathw ays hold a higher possibility of iriatio n (George, 1993) Therefore, when a large-scale production of uniform plants is ìsired, the approach of in-vitro propagation from shoot-tips and axillary buds is icommendable T hereíore, for the purpose of this study, we selected this pathway of ant regeneration for in-vitro propagation of Orthosiphon stam ineus Benth In the íìrst experim ents, we investigated the effects of the two growth regulators, ĩ auxin NAA and cytokinin BAP, on the regeneration of shoots in-vitro Different incentrations of the compounds (i.e 0.10, 0.25, 0.50, and 0.70 mgíì as for BAP; and 05, 0.10, 0.15, 0.20 g/1 as for NAA) were T3 ìpplem ented to the 'Õ isal MS containing )g/l sucrose, 5.Õ-6.0 g/1 Ịar in separated C eatm ents These uĩ eatm ents vvere then impared to the control hich was the )rmone-free MS basal 0.0 D a y 21 D a y 23 D a y 14 Day D ay edium C u ltu re tim e R esults presented [NAA] = 0 mg/1 - o - [NAA] = ,0 mg/1 -o—[XAA] = 0,10 mg/1 I Figures , and [NAA] = ,1 mg/1 - X - [NAA1 = mg/1 dicate th a t the Fig.2 Effects of NAA on the regeneration rate of Oĩlhosiphon rmation and growth stamineusbènìh shoots in-vitro (medium supplemented Orthosiphon with 0.1 mg/lBAP) amincus shoots in tro vvere obviously regulated by the 'esence of NAA and BAP in the cultuie edium The best rate s of shoot 'oliíeration and growth \vere observed r the m edium containing 0.1 mg/1 BAP ìd 0.0Õ mg/1 NAA th a t perm úted a ultiplication te of — after e\er> eeks \vith vigorous shoots An incrcase of the BAP 'Hcentration fr o m mg/1 to 0.1 a n d 0.2o g/1 c o r r e s p o n d i n g l v enhanced the /erage of re g e n e tc d shoots However, \vhen BAP_ •‘r e x p.1l a n t Đcentrấtion Nvas fu rth er elevated to 0_^_ num ber 0 0 ,1 0,1 0.2 N"AA c o n c e n t r a t i o n (mg/1) L g Effects of NAA on the grov,1h of stamineus ch n n fc in -ư itm 142 Tran T uìui Tu Tran D u Chi, Le H o n g D|C| a n d mg/1 i t a p p e a r e d to i n h i b i t t h e g r o w t h r a t e of r e g e n e r a t e d shoots, a n d produ less ax illary bu d s, a n d co n seq u en tly lower m ultiplication te s (Figure 1) Supplem enting NAA (0 05 mg/1) to the BAP-containing media improved the shc elongation and vigor G enerally, we obtained higher num ber of elongated shoots a raore effìcient m ultiplication rates when 0.05 mg/1 NAA was supplem ented to t culture m edia (Figures and 3) However, a higher concentration of NAA (0.10 ' and 0.20 mg/1) ìnduced callusing in some explants and reduced the shoot proliferatio' ^In conclusion, we found t h a t the basal MS medium (containing 30 g/1 sucro solidiíĩed by 5.5-5 g/1 agar-agar, pH 5.8) supplem ented with 0.1 mg/1 BAP and mg/1 NAA was the m ost efficient medium for Orthosiphon stam ineus shoot inducti from aseptic shoot-tip and axillary bud explants This medium allowed a shi prohferation te of Hpproximately —5 after every weeks R o o t i n g o f r e g e n e r a t e d s h o o t s in -v itro After weeks in the shoot proliíeration medium, the clusters of shoots Orthosiphon stam ineus reached around to cm in height, commonly beanng V leaves per shoot These shoots were then separated from the clusters and transferrec rooting media In dt horm one-free medium, most Orthosiphon stam ineus shoots (84.5 developed roots in vitro spontaneously after weeks However, the supplem ent of N at a low concentration (i.e 0.05 mg/1) considerably accelerated the root initiation £ improved the root qualitv, i.e the num ber of roots per shoot and the root length (Ta 2) In th is m edium , 100 % shoots produced roots within weeks Hovvever, when concentration of NAA fu rth er incseased (i.e 0.10, 0.15 and 0.20 mg/1), the r initiation and elongation were drastically delayed Table Effect of NAA on the rooting stage of stamineus Benth shoots in-vitro Root íormation after vveeks in rooting media Medium NAA concentration (mg/l) Numberoí explants 0R1 0.00 0R2 Percentage of rooted shoots (%) Number oí roots per shool Root length (mm) 50 84.5 ±1.42 3-4 14.46 ± 1.34 0.05 50 100 ±0.00 3-4 14.95 ± 1.73 0R3 0.10 50 83.4 ± 1.01 4-5 12.74 ± 1.18 0R4 0.15 50 82.9 + 1.09 4-5 10.21 ± 1.71 0R5 0.20 50 81.3 ± 1.34 4-5 9.84 ± 1.52 In reg ard to the stren g th of basal medium, another expenm ent ìndicated th at h a l f - s t r e n g t h M S m e d i u m (MS/2) was superior to the íull-strength (MS) and quar strength (MS/4 ) m edia for rooting induction as it obviously ìmproved the root qua (data n o t show n) In conclusion, our study indicated th a t 0.05 mg/1 NAA incorporated in the h stren g th MS m edium was the most efficient combination for the root ìnduction r - fr pnuency o f respondin^ explants a n d sta - — - — ■ ! vitro p r o p a g a t i o n o í V i e t n a m e s e m e d i c i n a l plant 143 ot q u ality W ith th is m ed iu m , 100% of the explants íorm ed roots w ithin the ĩirst two ĩeks R egarding the ad atib ility of the regenerated plants to ex-vitro conditions our ter e x p en m en t revealed th a t no m ajor problem was encountered when they were ansferred to n u rsery and the íĩeld, despite occasionally we observed slight effects of ỉmidity and soil com ponents on the survival rate of the plantlets C o n c lu sio n s O ur experim ents on in-vitro propagation of Vietnam ese Orthosiphon stamineus ĩnth genotypes via direct pathw ay of plant regeneration from m eristem atic tissues, ỉ shoot tip s and axillary buds, led to the following m ain conclusions: - Orthosiphon stam ineus explants could be surface-sterilized after a routine sinfection protocol using % HgCl solution By this treatm ent, a rate of 46.4 % ìeptic an d vigorous explants was obtained for plant tissue culture process - MS b asal m edium supplem ented with 0.1 mg/1 BAP and 0.05 mg/1 NAA was the ost effective shoot induction medium , perm ittm g a m ultiplication rate of about - /ery weeks - MS/2 m edium supplem ented with NAA (0.1 mg/1) was the most efficient rooting iedium, inducing 100 % shoots to form roots in vitro w ithin weeks of culture litiation No m ajor problem was seen for Orthosiphon stam ineus Benth when the ỉ g e n e r a t e d p l a n t s w e r e t r a n s p l a n t e d to ex v i t r o c o n d i t i o n s Based on the study, we suggest a complete protocol for in-vitro propagation of ietnam ese Orthosiphoĩĩ stữm iĩĩcus Benth gsnotypes from shoot-tips and axillar) buds described in Figure S u rfa c e -ste riliza tio n of explants d i s i n f e c t e d ỏ v 0.1% H g C Ỉ2 for l õ m in u te s jp In d u c tio n of sh o o t initiation M S I + 30 g / l sucrose -r 5.5 - 6.0 gII agar •\veek 'V-ÌV' R a p i d p r o l i f e r a t i o n o f s h o o ts in v itr o M S + g l l s u c ro se + 5 ■ 6.0 g /1 agar, + 0.05 mg / / NAA + 0.1 mg Ị l BẢP H '.veeK ■! R o o tin g ind u ctio n g ỉl agur-ugui agar-agar M SII? 2+ + 30 g /l l sucrose + + 5.5 ỡ.ồ ■6.0 b.u giL k6 + 0 m g / l N A A ế A d a p t a t i o n to ex v itro c o n d itio n week ĩ*v/ F ie ld ìese Orthosiphon stamineus Benth genotypes 144 Tran Tuan Tu, Tran Du Chi Le H ong Dicp Acknowledgements The a u th o rs w ould like to express our sincere thanks to the Korean Funds f Advanced S tu d ie s (Korea), a n d the Asia Research Center (VNU-Hanoi Vietnam.) f, funding the project We are also grateful to Dr Nguyen Tap and MSc Pham Thar Huyen (V ietnam In stitu te o f M edicinal Materials) for their help in collecting the pla m atenals, a n d to Prof Vu Van Vu (VNU-Hanoi) for his expertise support and proc reading the manuscript R E FE R E N C E S Đo H u y B i c h a n d c o - w o r k e r s , 1000 Vietnamese medicinal p la n ts a n d a n im a ls , Te ch ni c and scientiĩic pub lish in g house, Hanoi, Vol II: 623 (in Vietnamese), 2004 Bajaj YPS, m edicinal Furm anow a and arom atic M, 01szowska plants, I n: 0, Biotechnology Bajaj Y P S of t h e micropropagation (ed.) Biotechnology in Agriculture Forestry, V o l u m e 4: M e d i c m a l a n d A r o m a t i c p l a n t s I, S r i n g e r , 19 88 , p p 60- 10 3 E n g l e r t J , H a r n i s c h í e g e r G, Diuretic action o fa qu eou s Orthosiphon extract in r a ts , P l a n Med., N°58(1991), 237-238 G e o r g e E F , P la n t P ro p a g a tio n by Tissue Culture , P a r t 1: T h e t e c h n o l o g y , E x e g e t ỉ c s L i m i t (Publ.), 1993 M u r a s h i g e T, S k o o g F , A revised m edium for rapid groiuth and bioassaỵs with tobacco tiss cultures P h y sio lo g ic P la n ta r u m , 15, 1962, p p - 97 O lah N K R a d u L, M o g o s a n c , H a n g a n u D, G o c a n s P h y t o c h e m i c a l a n d p h a r m a c o l o g i c s t u d i e s o n O r t h o s i p h o n s t a m i n e u s B e n t h ( L a m i n a c e a e ) h y d r o a l c o h o l i c e x t r a c t s J Phan Biom ed A n a ly s is , N° 3 ( 0 ) , p p 1 -123 Tezuka Y S t a m p o u l i s p , B a n s k o t t a A H , A w a l e s , T r a n K Q , S a i k i I, K a d o t a s (199' C o n stitu e n ts o f V ie tn am ese m edicin al plants Orthosiphon s ta m in e u s , C h e m P h a r m Bu 48, 1999, pp.1711 -1719 TẠP CHÌ K H O A H O C Đ H Q G H N , KHTN & CN, T.XXI SỐ4PT., 2005 NHÂN NHANH LỒI CÂY THC RÂU MÈO (ORTHOSỊPHON STAM IN EU S BENTH.) VIỆT NAM BẢNG PHƯƠNG PHAP NƯOI CẤY MÔ THỰC VẬT IN-VITRO T rầ n T u ấ n T ú , T r ầ n D ụ C hi, Lê H ổ n g Đ iệp, H o àn g T hị H òa, Đ in h Đ oàn Lonị Khoa S in h học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Ha A'ội :Địa chi liên hệ tác giả Tel: 04-8584748, Fax: 04-8582069, E-mail: long dd_ksh®vnu.edu.vn Cây R âu mèo (O rthosiphon stam ineus Benth.) lồi thc phân bố rải r trAn mót số v ù n g ỏ nưóc ta G ần đây, loài thuốc thu h ú t đươc quan ta v ■ ác n h a u tr ẽ n th ế giâi Theo y học cô truy, -v it r o p r o p a g a t i o n o f V i c t n a m e x c m c d i c i n a l pỉant 145 lột số nước C hâu Á (T rung Quốc, Ấn Độ, Malaysia, Thái Lan, Việt Nam), loài 1UÔC sử dụ n g điều trị sô rôi loạn đường tiết niệu, bệnh sỏi thận ệnh đái th áo đường cao huyết áp châu Âu N hật Bản, Râu mèo sử ụng cho mục đích lợi tiểu Trong vài năm gần đây, nhu cầu dược liệu từ Râu mèo gày tă n g lên, đặc b iệt số thị trường Châu Âu Bắc Mỹ Trong đó, ay Inđơnêsia nước có sản lượng xuất Râu mèo lớn n h ấ t sang thị trường Châu u N hằm cung cấp biện pháp cơng nghệ sinh học để góp phần bảo quản nhân hanh lồi thuốc có tiềm xuất Việt Nam, tiến hành hực đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình ni cấy mơ tế bào ìn-vitro nhằm hân n h an h loài thuổc Orthosiphon stamineus Benth Việt Nam” Kết nghiên cứu cho thấy th àn h phần môi trường nuôi cấy tổ hợp ác ch ất điều hịa sinh trưởng có vai trị định đên hiệu q trình ni Mơi trường có th àn h phần MS, bổ sung 0,05 mg/L NAA 0,1 mg/L BAP nôi trường phù hợp n h ấ t cho giai đoạn nhân chồi in-vitro Trong đó, mơi trường iíS/2 bổ sung 0,05 mg/L NAA tỏ hiệu cho giai đoạn tạo rễ chồi Râu mèo 'rên sở đó, chúng tơi th iế t lập quy trình nhân giơng in-vitro hồn chỉnh hiệu đơi với dịng Râu mèo có Việt Nam Quy trình có thê dược áp l ụ n g m ụ c đ í c h n h â n g i ô n g v b ả o t n n g u n g e n c â y dược l i ệ u q u ý n y nước t a rong tương lai ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự N H IẺ N KHOA SINH HỌC Trần Tuấn Tú N G H IÊN c ứ u XÂY DỤNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH IN VITRO DỊNG CÂY THUỐC RÂU M ÈO (ORTHOSIPHON STAMINEUS BENTH.) CỦA VIỆT NAM C Ó H À M LƯỢNG DƯỢC CHẤT SINENSETTN CAO K H Ó A LUẬN TỐT N G H IỆP H Ệ Đ À O T Ạ O C Ử N H Â N K H O A H Ọ C TÀI N À N G N aành: Sinh học C n h n s d ẫ n : TS Đ in h Đ ĩ)àn L ong T hS T r ầ n Du Chi Ha Nội - 2006 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TựNHIẺN k h o a sin h HOC Trần Tuấn Tú NGHIÊN c ứ u XÂY DỤNG QUY TRINH NHÂN NHANH ! IN VITRO DÒNG CÂY THUỐC RÂU MÈO 0ORTHOSIPHON STAMINEUS BENTH.) CỦA M Ệ T NAM C Ó H À M LƯỢNG DƯỢC CHẮT SINI.NSI I IN CAO K H Ó A LUẬN TỐ T N G H IỆP H Ệ Đ À O T Ạ O C Ừ N H Â N K H O A HOC TÀI N Ă N G N gành: Sinh học C n h n g d ẫ n : TS Đ in h Đt)àn L ong T hS T r ầ n Du Chi Ha Nội - 2006 ( n u () \ (; f)AI H Ọ C KHOA 1I Ọ< I I M 1) \ ( , \ \ \ I I Ọ I C I I I \ ( , i i | \ -v jj I >"1 1.1 p - I II d " - ll.uili p h i u II I \ Số: , ! f /Sh)l I l ỉ ( ) H a ;\ ('!, H” ù\ Ci) i l u í n ^ Ỷ nam ỌUYHT ĐỊNH CỦA llllìu TRI ỒNG TKIONG DẠ! 1IỌC KriOA IIỌC II \ I I I Í : \ V /v : cổng nhận dề tài lu án án liến sĩ cán hò hướnu dẫn 11» ! cứu sinh năm 20(16 H I Ệ U T R Ư Ở N G T R Ư Ờ N G ĐẠI H Ọ C KHOA H Ọ C T Ị' M I Ì;.\ - C ă n c ứ Q u y (l ị nl i vẽ l ổ c l i ứ r h oại clộii" i m i i Ị Ị D i học Quo c yia H N ộ i chíơc ban hành th e o Q 11 vết (lịnh sơ '600.í I C C lì n y y 01! 10/21)01 Giủĩìì clò’(’ Dại hoe Quốc ỊỊi'a Hở Nội; - Căn Quy chê Đào 1(10 sau dại học dược ban hành ilìco Quyếỉ clịnl: sị' I2 0 IQ D -B G D & Đ I ỉìiỊcty 081612000 ( lìa Bơ trường Bị Giáo chu vù Dàn lạo; - Cân cử Oiiy chê Đào tạo sau dại lìoc Dại học Ouổc ỈỊÌU Ilà Nội chíực hiitì hành theo Quvếl clịnlì sơ I5/ĐT //!>hiên cứu sinh ỉìãììì 2006 trìíờìi'* D a i hoe K h o a hoe Ti í i il ìi rn >1 Dụi học Oc ỳ a Hù Nội; - Theo cíê ỉiĩịlìị ơìi'j: TrướỉỉiỊ phịiỉ'1 S(ỈII Jụi hoe chu uhỉcỉìi Klìthi >;///:’ học, Q U Y Ế T ĐỊ NH Điều : Cóns nhận đề tài luận án tiến sĩ người hướng dẫn cua nghiên cứu s:; \: Vũ Hoài Sâm, sau: Tên đề tài: ứns dụng kv thuật nuôi câv in-vitro nhân giong thu nhân sị nhóm chât có hoạt lính sinh học từ V Râu mèo (O rĩliosiplìotỉ s ỉ t i ỉ ì i i lít us l ỉ ưnỉ l ỉ ì Việt Nai;] n h i c n - ĐI IQ(jl 1N: IIDP: TS Đinh Đua:: Tư nhiịn - ĐI ỈỌ C i! IN I lình thức cỉào tạo: \'nùuvi KhônLi lập trung ^ II S; '1 ỉ í) \ í; / ( ( ) \ ( | I I U A Ỉ)iư Hù Nội dược ban hành tlieo Quyết cỉịnli số600/TCCB H}Ịày 0111012001 ciía Giám iloc Dại liọc Quốc 'ịiu Hà Nội: - Căn Quy chê Dào lạo sau dại học ílưực ban lìàn/i theo Quyết cỉịnli sổ 18/2000/QĐ-BGD&ĐĨ nỵàv 081612000 Bơ l/ 11'ónạ Bộ Giáo (lục Dào lạo: - Căn Oiiv chê Đào lạo sau dại học Dại học Ouõc lỊÍa ỉ Nội ihíực bíiii hành theo Quyết clịnh s ố 15/ĐT Iii>ày 0910212004 aici Giám dốc Đại học Onổc ■’/:fi yidc Tóm tắt kết nghiên cứu: Kết q u ả k h o a học: - K ế t q u ả p h n tích R P - H P L C c h o t hấ y d ơc chất s i nensetin có mã dịch c hi ế t c ủ a tất c ả 10 d ò n g R â u m è o (Ortlìosiplĩon stamineus Benth.) thu t hậ p Ha Nội, T h a n h H ó a , P h ú T h ọ v Q u n g N a m , n hi ê n h m lượng c hấ t nà y d a o đón« (từ 0 % đến 0,188%) - Đã xây dựng quy trình tách chi ết A D N bước đ áu xác định khoảng c c h di t r u y ề n g i ữ a c c m ẫ u R â u m è o đ ã thu thập n h kỹ thuật R A P D - PCR Kết phân tích c h o t h ấ y c c d ò n g R â u M è o h iệ n có m i ề n Bấc nước ta có tính đa d n g di truyền không c a o t n g q u a n với vị trí p h n bố c ác địa phương K h o n g c o tương q u a n chặt g iữa sư bién đ ộ n g vé h m lượng sinensetin va k h a c bict ve m t di t r u y ê n c u a c c d ò n g R â u M è o c h o thủy c ó thẻ c ác yêu tỏ mòi trường có ảnh h n g đ ê n k h ả n ă n g t ố n g h ợ p tích lũy sinenseti n lồi c â y Két qua ứ n g dụng' T h i ẽ t l ậ p đ ược 01 q u y trình kỹ thuật c hiê t xuất, phán tích dược chát sinensetin 01 q u y t rì nh p h â n tí ch chí thị R A P D - P CR từ c ác d ò n g câ y Râ u m è o Viét Nam Kết q u ả đ o tạo: Đ o t o đ ợ c 01 C N H ệ Đ o t o C ứ n hâ n K h o a h o c Tài n ăng (SV Trán Tuâ n Tú, K h ó a 6, tốt n g h i ệ p n ă m 0 ) Đ a n g tiếp tục đ o tạo m ộ t NCS Kết q u ả c ô n g bô: Đ ã c ô n g b ố b o t i ế n g A n h T p chí K h o a học, Đ H Ọ G Hà Nội Kiến nghị quy mô đối tượng áp dụng nghién cứu: - Đề nghị c h o p d ụ n g q u y t r ình p h â n tích chi thị R A P D - PC R R P - H P L C thiết lập vào công tác b ả o t n v đ ị n h h n g c h ọ n , t ạo n h â n g i ố n g c â y R â u m è o nước ta tương lai - Nên lựa c h ọ n , n h â n n h a n h v đ a v o s ản x uấ t d òn g R ã u m è o TH d ị n g có h m lượng sinensetin c a o h n c ả ( , 8 % ) t r o n g s ố c c d ò n g thu t h ậ p t r on g n gh i ê n cứu Họ tên Học hàm học vị Ký t ên Đóng dấu T h ủ trướng cư quan T hu trưưng cư quan tr ì đé tài quan IV de tai ... HỌC Tên Đề tài: "Đ ánh giá tính đa dạng di truyền n hờ chí thị phân tử RA PD -PCR khả sinh tổng hợp sinensetin loài thuốc có tiềm xuất Việt N am Orthosiphon stamineus Benth. " C hủ nh iệm đ ề... thị phân tử RAPD- PCR khả sinh tổng hợp sinensetin loài thuốc có tiềm xuất Việt Nam Orthosiphon stam ineus B en th ” TỔNG QUAN TÌN H HÌNH NGHIÊN c ứ u TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 1.1 TổNG QUAN VỂ CÂY... triển loài thuốc Vì để xác định mức độ đa dạng di truyền khả sinh tổng hợp sinensetin m ột số quần thể thuốc Orthosiphon stamineus có Việt Nam làm sở cho việc định hướng bảo tồn chọn, tạo giống loài