Sử dụng một số hệ izozym để nghiên cứu đa dạng di truyền ở một số loài cây dược liệu bản địa ở việt nam

46 15 0
Sử dụng một số hệ izozym để nghiên cứu đa dạng di truyền ở một số loài cây dược liệu bản địa ở việt nam

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN Q SỬ DỤNG M ỘT SỐ HỆ IZOZYM BÊ NGHIÊM cứu ĐA DẠNG D I TRUYỂM ỏ m ộ t s ố LO À I CÂY DƯỢC U Ệ U BẢN B ỊA Ỏ V IỆT MAM • • • MẢ SỐ: QT - 04 -15 CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: THS HỒNG THỊ HỊA Các cán tham gia: TS Đinh Đoàn Long KTV Trần Thị Nhuận ThS Phạm Thanh Huyền HÀ NỘI - 2005 BÁO CÁO TÓM TẮT 1.Tên đề tài: SỬ DỤNG MỘT SỐ HỆ IZOZYM ĐỂ NGHIÊN c ứ u ĐA DẠNG DI TRUYỂN MỘT SỐ LOAI CÂY DƯỢC LIỆU BẢN ĐỊA Ở VIỆT NAM # Mã số: QT - 04 - Chủ trì đề tài:ThS Hồng Thị Hoà Các cán tham gia: TS Đinh Đoàn Long KTV Trần Thị Nhuận ThS Phạm Thanh Huyền Mục đích nội dung nghiên cứu: Mục đích: Góp phần xác định tính đa hình di truyền, dấu chuẩn di truyền phân loại loài mối quan hệ di truyền số loài dược liệu địa Việt Nam Nội dung nghiên cứu: - Chọn thu thập mẫu (Lựa chọn số dược liệu địa Việt Nam cịn nghiên cứu) Đã chọn hai loài thuốc diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.) diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.); thu thập mẫu số vùng miền Bắc Việt Nam) - Xử lý mẫu - Chạy điện di, nhuộm theo phương pháp phân tích hệ izozym Superoxide dismutaza (SOD), Esteraza (EST), peroxidaza (PO), chụp ảnh mẫu - Phân tích số liệu - Viết báo cáo Các kết đạt được: Vê mặt khoa học: - Tổng quan có chọn lọc nghiên cứu nước đối tượng nghiên cứu nghiên cứu izozym số đối tượng khác - Kết cho thấy sử dụng kỹ thuật phân tích izozym SOD, EST PO để đánh giá mức độ đa dạng, khoảng cách di truyền phân loại nhanh loài Phyỉlanthus amarus Phyỉỉanthus urinaria từ nhỏ (đặc biệt hệ izozym SOD) Phát quần thể Phyllanthus urinaria L Nội Bài - Sóc Sơn có phổ izozym SOD mang băng đặc trưng lồi Phylỉanthus amarus Có thể lai lồi Phylìanthus amarus Phỵllơnthus urinaria L Sản phẩm: - Báo cáo tổng kết đề tài - Một phần kết nghiên cứu công bố báo khoa học (1 tiếng Việt tiếng Anh) Vê mặt đào tạo: - Đào tạo cử nhân Sinh học: Sinh viên Cao Lệ Quyên lớp Sinh K46A với đề tài khoá luận liên quan đến nội dung đề tài QT-04-15, bảo vệ tốt nghiệp đạt 9,5 điểm - Khả ứng dụng Kết nghiên cứu sở khoa học góp phần phân loại hai lồi thuốc diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.) diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) thu thập miền Bắc Việt Nam Tình hình kinh phí đề tài: Tổng kinh phí để tài: 16.0Ơ0.000 VNĐ - Chi phí nghiệp vụ chun mơn dụng cụ, hố chất 6,740.000 VNĐ - Chi phí th mướn, thuê lao động 6.000.000 VNĐ - Quản lý phí, hỗ trợ đào tạo nghiên cứu khoa học 1.120.000 VNĐ - Thanh toán điện nước 640.000 VNĐ - Nghiệm thu để tài, in , mua tài liệu 1.500.000 VNĐ Đã toán SUMMARY a) The title of subject: Using some isoenzyme systems to assess the genetic diversity of some Vietnamese native medicinal plants b) Numberical code: QT- 04-15 c) The grant holder: M.Sc Hoang Thi Hoa d) The Participants: Dr Dinh Doan Long M.Sc Pham Thanh Huyen Tech Tran Thi Nhuan e) Objectives and contents: * Objectives: The two native medicinal plant species Phyllanthus amarus Schum Et Thonn and Phyllanthus urinaria L are colecting from different areas in the north of Vietnam * Contents: In Vietnam, Phyllanthus amarus Schum Et Thonn and Phyllanthus urinaria L are the two most well-known medicinal plants among the species belonging to the genus Phyllanthus, family Euphobiaceae These medicinal plants have been used for centuries in the traditional medicine for treatment of sore throat, furunculosis, eczema, hematometra, hepatitis, ophtalmia, arthralgia, snake-bite Recently, numerous pharmaceutical products derived from these two plant species, e.g Livbilnic (Traphaco Co Ltd), VG-5 (Central pharmaceutical company N05), Hepaphyl (Central pharmaceutical company 25), Hepamarin, Livsin-94 (Haphaco) etc have been commercialized and widely used in clinical treatment of liver ailments, including the hepatitis B infection In order to assess the genetic diversity of these medicinal plants and to establish a method for rapid identification of these two plant species, we performed the analysis of some isozyme markers: Izozym Superoxide dismutaza (SOD), Izozym Esteraza (EST), Izozym Peroxidaza (PO) The study revealed that the SOD, EST, PO isozymes profile of the two species are obviously distinct All collected samples of p amarus accessions were specified by electrophoretic markers of SOD isozyme at Rfs that are equal to 0.63; 0.71 and 0.75; EST isozyme at Rfs are 0,09; 0,42; PO isozyme at Rfs are 0,85; 0,87 Whereas, these markers were absent from most of p urinaria samples, except for some seemingly interspecific forms g) The obtained results: In conclusion, our study indicated that the analysis of SOD, EST, PO isozyme markers might be used as a simple and cost-effective technique for assessment of genetic polymorphism and rapid distinction of the two medicinal plant species - Phyllanthus amarus Schum Et Thonn and Phyllanthus urinaria L XÁC NHẬN CỦA BAN CHỦ NHIỆM KHOA CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI ThS Hoàng Thị Hoà PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa XÁC NHẬN CỦA TRƯỜNG PHĨ HiỆb IRƯĨNB PŨS.Ts dí)ù.L ^ỈẰuiL^Ối MỤC LỤC Mở đầu Nội dung đề tài TThương Tổng quan tài liệu Các nghiên cứu Phyllanthus L 1.1 Phân loại học thực vật tên gọi 1.2 Hình thái học, tế bào học phân b ố 1.3 Phân bố sinh thái 1.4 Sử dụng Phylỉanthus L y học cổ truyền 1.5/Thành phẩn hoá học Phyllanthus L 1.6 Các nghiên cứu tác dụng dược lý Phyllanthus L 1.7 Các dược phẩm bào chế từ p amarus vàp urinaria 10 Đại cương izozym 11 2.1 Izozym Superoxide dismutaza (SOD E.c.1.15.1.1) 13 2.2 Izozym Esteraza (EST E.C.3.1.1.2) 14 2.3 Izozym Peroxidaza (PO E.c 1.1.1.17) 14 Chương Vật liệu phương pháp 16 2.1 Vật liệu thực v ậ t 16 2.2 Phương pháp phân tích đa hình izozym 18 2.2.1 Phương pháp thu m ẫ u 18 2.2.2 Phương pháp nghiền m ẫ u 19 2.2.3 Phương pháp điện d i 19 2.2.4 Phương pháp phân tích kết nghiên c ứ u 19 Chương Kết thảo lu ậ n 21 3.1 Phổ điện di hệ izozym SOD c ủ a 21 3.2 Phổ điện di hệ izozym E S T 25 3.3 Phổ điện di hệ izozym P O 27 3.4 Quan hệ di truyền quần th ể 31 Kết L u ận 32 Tài liệu tham k h ả o 33 MỞ ĐẨU Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.) diộp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) ià hai loài thuốc thuộc chi Phyllanthus, họ Ẽuphorbiaceae, phân bố tương đối rộng rãi Việt Nam Hai loài thuốc sử dụng lâu đời y học cổ truyền nước ta nhiều nước khác thuộc vùng Đông Nam Á An độ, Malaysia, Thái Lan, Campuchia, Lào, Trung quốc, Inđônêsia Tuy vậy, việc sản xuất dược phẩm từ hai loài p amarus p urinaria L chủ yếu dựa dược liệu thu hái tự nhiên, phần lớn dạng mọc hoang dại, bộc lộ số nhược điểm sau: - Viêc thu hái quy hoạch dẫn đến nguy nguồn tài nguyên di truyền, - Việc thu hái từ dạng hoang dại không đáp ứng yêu cầu công nghiệp dược nguồn dược liệu ban đầu thường khơng ổn định khơng kiểm sốt mặt hóa học, hoạt tính sinh học - Dược liệu thu thập hoang dại có nguy nhiễm với dạng vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virút ), mang theo nguồn chất độc ngồi ý muốn - Các dạng nguyên liệu hoang dại có nguy nhiễm độc với nguồn hóa chất độc khác nhau, chất diệt cỏ, thuốc trừ sâu, chất thải công nghiệp thu hái từ vùng bị nhiễm thực tế tình hình khổ kiểm sốt Hình Cây Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus L (A) Diệp hạ châu Phyllanthus urinaria L (B) dùng nghiên cứu Ngoài ra, thực tế p amarus p urinaria L hai lồi thuốc có đặc điểm hình thái giống (xem Hình la,b) giống với số lồi Phyllanthus khác có Việt nam, p niruri, p reticulaĩus vốn quan tâm mục đích chế biến dược liệu Việc phân loại xác lồi phyllanthus thực nhờ chuyên gia phân loại thực vật sau phát triển đến giai đoạn trưởng thành Trước thực tế vậy, việc thu thập dược liệu tự phát từ người dân đứng trước nhiều nguy nhầm lẫn khó đảm bảo chất lượng nguồn dược liệu sử dụng cho sản xuất dược phẩm quy mô công nghiệp Trong hồn cảnh đó, báo cáo đề tài chúng tơi nhằm góp phần cung cấp cơng cụ phục vụ cho việc phân loại nhanh hai loài dược liệu dẻ nhầm lẫn Ngoài ra, kỹ thuật cho phép đánh giá mức độ đa hình di truyền quần thể mẫu thu thập từ số địa phương khác miền Bắc nước ta, dẫn liệu cho việc chọn lọc nguồn nguyên liệu phục vụ công tác chọn, tạo giống loài thuốc Việt Nam tương lai Đây nghiên cứu Việt Nam cho thấy khả ứng dụng thị phân tử (molecular fingerprintings) việc phân loại định danh nhanh loài thảo dược nước ta, vốn từ trước đến thực chủ yếu dựa vào thị hình thái (là thị dễ gây nhầm lẫn nhiều trường hợp) số trường hợp thị hóa học NỘI DUNG CHÍNH CỦA ĐỂ TÀI CHƯƠNG TỔ NG Q U A N TÀ I LIỆU 1.1 CÁC NGHIÊN CỨU VỂ PH YLLANTH U S L 1.1.1 Phân loại học thực vật tên gọi Chi Phyllanthus chi lớn họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), thuộc Euphorbiales, phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp Hai mầm (Dicotyledons) Chi gồm 11 phân chi: Isocladus, Kirganelia, Cicca, Emblica, Phyllanthus, Conami, Gomphidium, Phyllanthodendron, Xylophylỉa, Botryanthus, Eriococcus (ưnander et al., 1990) có khoảng gần 700 loài p amarus p urinaria thuộc phân chi Phyllanthus p amarus thuộc nhánh Phyllanthus p urinaria thuộc nhánh Urinaria; phân chi Phyllanthus cịn có nhánh khác Lysiandra Pentandra [25] Trong chi Phyllanthus, nhiều lồi có p amarus p urinaria sử dụng làm thuốc y học dân tộc nước ta số nước nhiệt đới khác giới Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Brazil, Peru, Tanzania, từ cách hàng nghìn năm Nhưng, phải đến năm 1738 chúng Linné mô tả đặt tên (tại Barbados) Mặc dù vậy, tài liệu cổ cho thấy từ lâu loài ghi nhận mô tả [25] Về tên gọi, sử dụng rộng rãi y học dân tộc nhiều quốc gia từ hàng nghìn năm, nên hai lồi p amarus p urinaria gọi nhiều tên địa phương khác nhau, như: herbe du chagrin, petit tamarin rouge, surette (Pháp), Chanca piedra (Peru), quebra-pedra, arranca-pedras, erva pombinha (Braxin), pemilla del pasto (Puerto Rico), Holy Friday (Colombia), gale of wind (Florida Caribe thuộc Anh), Hurricane weed (Bahamas), Creole quinine, arrebentapedra, Paraparaimè (Paraguay), Santa Maria, San Pedro, herb of San Pablo, sampasampalkan (Philippines), zhen chu cao, ye xia zhu, Hsieh-hsia Chu (Trung Quốc), Komikansou (Nhật Bản), Pitirishi, Budhatri (An Độ), Đôi khi, số địa phương, tên thường dùng lẫn lộn để gọi tên hai loài số loài khác thuộc chi Phyllanthus [25] ỏ Việt Nam, thuốc p amarus p urinaria gọi tên tên địa phương khác nhau, chẳng hạn chó đẻ cưa, cam kiềm, vườn kiềm, diệp hạ châu, diệp hoè thái, lão nha châu, trân châu thảo, rút đất, khao ham Và giống số nước, nước ta tên địa phương dùng lẫn lộn cho hai loài Nhưng phổ biến p amarus gọi diệp hạ châu đắng hay chó đẻ chân chim, chó đẻ thân xanh, phân biệt với P urinaria gọi diệp hạ châu hay chó đẻ cưa [1], 1.1.2 Hình thái học, tê bào học Các đặc điểm hình thái p amarus p urinaria mơ tả sau: thân thảo, sống năm nhiều năm, cao trung bình 20-30cm, đơi cao đến 60-70cm; Thân nhẵn, tròn; mọc so le, hình bầu dục, xếp sít thành hai dãy, cành kép hình lồng chim, mặt xanh lục nhạt, mặt màu xanh mốc; phiến thuôn, dài 5-15mm, rộng 3-6mm, đầu nhọn hay tù, mép ngun; gân - phụ mảnh, có 4-6 cặp; khơng có cuống cuống ngắn Hoa mọc nách lá, nhỏ, có cuống ngắn, đơn tính gốc; hoa đực b đầu cành, hoa cuối cành, tiểu nhụy 3, nhị dính nhau; Quả nang, hình cầu đường kính khoảng 2mm, mọc rủ xuống nên gọi diêp hạ châu (nghĩa hạt lá); có hạt hình tam giác, màu nâu nhạt, có vân ngang Cây thường hoa từ tháng đến tháng từ tháng đến tháng [1,7] Ngoài đặc điểm chung trên, hai loài p amarus p urinaria có số điểm khác biệt hình thái như: p amarus thường mọc thẳng, thân mầu xanh, chia nhánh p urinaria lại thường phân nhánh, thân có mầu xanh xẫm tím; p amarus thường có nhẫn, khơng gai cịn p urinaria thường có gai; hoa p amarus có đài, cịn hoa p urinaria có đài (Võ Văn Chi, 1997; Phạm Hoàng Hộ, 1999) Tuy vậy, đặc điểm phân biệt thường rõ rệt đạt đến giai đoạn trưởng thành (ra hoa, kết quả) phân loại nhà phân loại học có kinh nghiêm Trong thực tế trình thu thập chế biến dược liệu nay, khó khăn phân loại dễ dẫn đến việc thu thập nhầm lẫn hai lồi [2,5] Cho đến có nghiên cứu tế bào học Phyllanthus amarus p urinaria Nghiên cứu Bancilhon cộng (1971) cho thấy nhiễm sắc thể lưỡng bội p amarus 2n= 26 2n= 52; Nghiên cứu Rossignol cộng (1987) lại cho thấy nhiễm sắc thể lưỡng bội p urinaria 2n= 50 Một dẫn liệu khác cho nhiễm sắc thể lưỡng bội p amarus 2n=26, p urinaria 2n=14, 2n= 52, 2n= 50 tuỳ theo thứ (Phạm Hoàng Hộ, 1999) Như vậy, nói, đến chưa có nghiên cứu hồn chỉnh số lượng đặc điểm nhiễm sắc thể loài Phyllanthus [5,11,17], 1.1.3 Phân bố sinh thái Ở Việt Nam, chi Phyllanthus L có khoảng 40 lồi Trong có hai lồi Phyllanthus amarus Phylỉanthus urinaria L có hình dáng gần giống nhau, mọc rải rác khắp nơi trừ vùng cao lạnh Trên giới, loài phân bố rộng rãi Campuchia, Lào, Malaysia, Thái lan, Trung quốc, Ấn độ, Brazil, Florida Texas (Mỹ) Phylỉanthus L ưa ẩm ưa sáng chịu bóng, thường mọc lẫn bãi cỏ, ruộng cao ( đất trổng màu), nương rẫy, vườn nhà vùng đồi Cây mọc từ hạt vào cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh mùa hè tàn lụi vào mua thu Do khả hoa kết quả, nhiều hạt giống phát tán gần nên mọc thành đám dày đặc, lấn át cỏ dại trồng khác [1], 1.1.4 Sử dụng Phyllanthus L y học cổ truyền Các tác dụng điều tri biết đến rộng rãi hai loài Phyllanthus amarus Phyllanthus urinaria bao gồm điều trị số rối loạn đường tiêu hóa (đặc biột bệnh lý gan), bệnh tiểu đường, số bệnh thận, đường tiết niệu, (Calixto et al., 1998) Gần đây, số nghiên cứu lâm sàng dược lý chứng minh dịch chiết thành phần hai loài thuốc có tác dụng ức chế q trình chép virút viêm gan B nhiều retrovirút khác (trong có HIV) nhờ tác dụng ức chế hoạt động enzym chép ngược reverse transcriptaza [13,21,22] Ngoài ra, số nghiên cứu khác cho thấy dịch chiết Phyllanthus có hoạt tính ức chế ACE (angiotensin-converting enzym) liên quan đến số biến chứng bệnh tiểu đường [24,25] 1.1.5 Thành phần hoá học Phyllanthus L Các chất hố học Phylanthus L tìm thấy lá, thân rễ gồm số chất như: Lignan : phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin Flavonoid : phyllanthin flavonoid FG-1, phyllanthin flavonoid FG-2 Tannin : repandusinic acid, geraniin Ngồi cịn số thành phần hoá học như: glycoside, alkaloid, elligitannin, phenylpropanoid, lipid, sterol, flavonol, [12] Hypophyllanthin Phyllanthin Niranthin 1.1.6 Các nghiên cứu tác dụng dược lý Phyllanthus L Từ thập niên 60, Phyỉỉanthus L trở thành đề tài nghiên cứu hoá thực vật để xác định phân tử hoạt động hoạt động dược lý chúng Nguổn hố thực vật tìm thấy giống Phyllanthus Nhiều phân tử hoạt động thuộc tính hoạt động sinh học lignan, glycoside, flavonoid, alkaloid, elligitannin, phenylpropanoid tìm thấy lá, thân rễ Các lipid, sterol, flavonol thấy phổ biến [12, 17] Hai chất phyllanthin hypophyllanthin xác định có hoạt tính chống viêm gan [18,20] KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu trên, rút số kết luận sau: Có thể sử dụng kỹ thuật phân tích hệ izozym SOD, EST PO để góp phần phân loại hai loài thuốc Phyllanthus amarus Schum et Thonn.và Phyllanthus urinaria L từ nhỏ (đặc biệt hệ izozym SOD) Các băng điện di phổ izozym SOD đặc trưng riêng quần thể lồi p amarus nghiên cứu có Rf= 0,63; Rf= 0,71 Rf= 0,75 Các băng điện di phổ izozym EST đặc trưng riêng quần thể lồi p amarus có Rf=0,09 Rf=0,42 ằ Các băng điện di phổ izozym PO đặc trưng riêng quần thể lồi p amarus có Rf= 0,85 Rf= 0,87 j C Phát quần thể p.urinaria Nội Bài ,Sóc Sơn (UNB) có phổ điện di izozym SOD, EST mang băng đặc trưng loài p amarus Có thể lai lồi p amarus p urinaria ế Có thể sử dụng hệ izozym SOD, EST PO để đánh giá mức độ đa dạng khoảng cách di truyền loài p amarus p urinaria thu thập miền Bắc Việt Nam, hệ izozym SOD cho độ đa dạng ĐỀ NGHỊ Tiếp rục nghiên cứu, hoàn thiện kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu đa dạng di truyền lồi Phyllanthus spp đối tượng khác, nhằm góp phần vào việc phân loại kiểm định dược liệu Có nghiên cứu sâu vể quần thể Phyllanthus urinaria L Nội Bài, Sóc Sơn để khẳng định xem có lai lồi hay không? 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Huy Bích cs.(1999), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập II, Tr 438, Nxb Khoa học kỹ thuật; Hà Nội Võ Vãn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội Trịnh Đình Đạt cs (1999), “Một số hệ isozym dịng cá rơ phi oreochromis niloticus ni Việt Nam”, Tạp chí sinh học, (23,3a),tr 167169 Hồng Thị Hoà, Đinh Đoàn Long, Nguyễn Thị Biên, Trần Thị Nhuận (2004), “Xác định dòng lúa lai việc sử dụng hệ izozym esteraza”, Tạp chí khoa học ĐHQGHN, T XX, số 2PT Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, Thành phố Hổ Chí Minh Nguyễn Như Khanh, Võ Minh Thứ (1995), “Tính đa hình izozym peroxidaza esteraza số giống lúa chịu hạn mặn” Di Truyền Học ứng dụng, số tr 27-32 Đỗ Tất Lợi (2001), Những thuốc vị thuốc Việt Nơm, Nxb Y học, Hà Nội Chu Văn Mẫn, Trịnh Đình Đạt (1992), “ Tính đa dạng hệ isozyme người Việt Nam ”, Di Truyền Học ứng dụng, số 1, tr 11-14 Đỗ Lê Thăng, Trịnh Đình Đạt (2001), “Hệ isozyme esterase sâu tơ (plutella xylo Stella) kháng thuốc diệt”, Di Truyền Học ứng dụng, số 4, tr 27-30 10 Allbert L and Andrew u s (1968), “Isoenzyme in biology and medicine”, Academic press, London 11 Bancilhon, L (1971) “Contribution a' rétude taxonomique de genre Phyllanthus (Euphorbiacees).” Boissiera 18, 9-81; 22 plates 12 Calixto J.B., Santos A.R., Cechinel F.V., Yunes R.A (1998), A review of the plants of the genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology, and therapeutic potential Med Res Rev, 18(4): 225 - 258 13 Chan H.L., Sung J.J., Fong W.F., Chim A.M., Yung p.p., Hui A.Y., Fung K.p Leung p.c (2003), Double-blinded placebo-controlled study of p urinaris for the treatment of chronic hepatitis B Ailment Pharmacol Ther 18: 339 - 345 14 Glaszmann J c (1987), “Isozyme and classification of Asian rice varieties”, Theor Appl Genet, 74, pp 21-30 32 15 Nguyen V X, Yoshino H., Tahara M (1998), “Genetic control of four enzymes indiphoid Tarro, colocasis eskulenta (L.) schott”, Breeding Science 48, pp 273-280 16 Rohlf F.J.(1993), NTSys-PC numerical taxonomy and multivariable analysis system version 1.80 Exeter software Applied Biostatistics Ins., New York 17 Rossignol L., Rossignol M., Haicour R (1987), “A systematic revision and Phyllanthus Subsection Urinaria (Euphorbiaceae).” American journal and Botany, 74, 12, December, 1853-1862 18 Syamasundar, K.V., Singh, B., Thakur, R.S., Husain, A., Kiso, Y., and Hikino, H (1985), “Antihepatotoxic principles of Phyllanthus niruri herbs.” Journal o f Ethnopharmacology 14, 41-44 19 Tanksley S.D and Orton T.J (1983), Isozymes in plant genetics and breeding Elsevier Science Publ., Amsterdam 20 Taylor L (2003), Chanca piedra “stone breaker" (Phyllanthus niruri) Sage Press Inc 21 Thyagarajan S.P., Subramanian s., Thirunalasundari T., Venkateswaran P.S., Blumberg B.s (1988), Effect of Phyllanthus amarus on chronic carriers of hepatitis B virus Lancet, (8614): 764 -766 22 Venkateswaran P.S., Millman I., and Blumberg B.s (1987), Effects of an extract from p niruri on hepatitis and woodchuck hepatitis viruses: invivo and invitro studies Proceedings o f National Academy o f Science USA, 84: -2 23 Zimmerman W.S., Lumpkin T.A., Watanable I (1989), Isozyme differentiation of Azolla Euphytica 42: 163 - 170 24.ưeno H and et al (1988), “ Chemical and pharmaceutical studies on medicinal plants in Paraguay Geraniin, an angiotensin-converting enzyme inhibitor from ‘paraparai m i,’ Phyllanthus mruri.”, J Nat Prod, 51(2), pp 357-59 25 Unander W.D., Webster L G., Blumberg s B., (1990), “Records of usage or assays in Phyllanthus (Euphorbiaceae) I Subgenus Jsocladus, Kirganelia, Cicca and E m blicaJournal o f Ethopharmacology 30, 233-246 33 Bộ Khoa học Công nghệ HỘI ĐỔNG KHOA HỌC Tự NHIÊN N gành Khoa học Sự sống NHữNG VẤN ĐỂ NGHIÊN CỨU c BẢN TRONG KHOA HỌC s ự SỐNG BÁO CÁO KHOA HỌC, HỘI NGHỊ TOÀN QUỐC 2005 NGHIÊN CỨU Cơ BẢN TRONG KHOA HỌC s ự SỐNG Trường Đại học Y Hà Nội, 03 tháng 11 năm 2005 N H À X U Ấ T BẢ N K H O A H Ọ C VÀ K Ĩ T H U Ậ T HÀ NỘI, 2005 NỌI DUNG ■ N h ữ n g v ấn đ ề n g h iê n u b ản K hoa học Sự sống năm 2004-2005 đ ề xuất n h ữ n g đ ịn h h n g GS.TS N guyễn Bá M ột số h o t đ ộ n g k ết q u ả n g h iê n cứu chủ yếu khoa học công nghệ Trường Đại học Y Hà Nội GS.TS N guyễn Lân Việt M ột số taxon m ới và/hay b ổ su n g cho h ệ thực v ật Việt N am vấn để bảo tồn chúng Phan Kê'Lộc, N guyễn Tiến Hiệp, N guyễn Thị Thanh Hương, Đỗ Tiến Đồn, N guyễn Q uang Hiếu, Tơ Văn Thảo, N guyễn Tiến Vinh, N guyễn Sinh Khang, Phạm Văn Thế, D ương Thị Hoàn, J Regalado Jr., L.v A veryanov, A.L Averyanova D.D Soejarto, K.D Hill, S.K Wu, J Wen, A Farjon, s Swan, N Furey, N guyễn M ạnh Cường, Vũ Ngọc Long T q u a n đặc điểm sin h học chủ yếu gặp b ện h n h â n ung th vòm m ũi họng V iệt N am M ột số ứ n g d ụ n g lâm sàng Phan Thị Phi Phi N h ữ n g k ế t q u ả b ật Đê tài n g h iên cứu vê áp d ụ n g kỹ thuật sinh học p h ầ n tử V iện Công nghệ S in h học, v iệ n KH& CNVN Lê T rần Bình, N ơng Văn Hải, Phan Văn Chi, Lê Q uang Huấn, Trương Nam Hải, Đinh Duy Kháng P a d n g đ ộ n g vật bảo tồn n g u n gen V ườn Quoc gia Xuân Sơn - Phu Thọ T rần M inh Hợi, N guyễn Xuân Đặng, Lê Đ ình Thuỷ, N guyễn Văn Sáng, Lê Xuân Huệ I D A DẠNG SINH HỌC ■ • V À BẢO TỒN NGUỒN GEN K ết q u ả đ iều tra bước đ ầu p h ân b ố khu hệ bò sát k h u bảo tồn thinh iê n Thị n h iêPnhương Bà N àAnh, - N úiTrẩn C húa, th Linh àn h p h ố Đà N ang Đ Duy 331 S d ụ n g h ệ izozym superoxide dism utaza (SOD) tro n g n g h iên cứu đa h ìn h di truyền góp phần phân loại hai loài thuốc Phyllattthus amarus vả Phyllanthus urinaria V iệt N am 1238 H o n g Thị Hịa, Đ inh Đ ồn Long, Cao Lệ Quyên, Trần Thị N huận, Phạm Thanh H uyền 332 N g h iên cử u h a i k ỉế u tái sin h in vitro kh o lang Ipomoea batatas L 1242 N guyễn H ữ u Hổ, N guyễn Văn U yển 333 N g h iên cứu tạo p h â n tử chức n ăn g đ ế ứ n g d ụ n g y học 1246 Lê Q uang H uân, Vũ Thị Bích H ường 334 Đ n h giá đ a dạn g n g u n g en xoài V iệt N am (M angifera) sử d ụ n g kỹ th u ật RAPD 1250 N guyễn Thị Ngọc H uệ, Trần D anh Sửu, Trịnh H ồng Kiên 335 Tách dòng, xác đ ịn h so sán h trìn h tự gen m ã hóa p rotein N ib bốn dòng virus gây b ệ n h đố m vòng trê n đ u đ ủ V iệt Nam 1254 N guyễn M inh H ùng, C hu H ồng Hà, Phạm Thị Vân, Lê Trần Bình, Lê Duy Thành 336 P h ân tích đ a h ìn h di tru y ền tập đồn giống n ấm Linh C hi (G anoderm a) m ức độ p h â n tử n h ằm p h ụ c vụ công tác tu y ển chọn p h â n loại giống nấm 1258 T rần M ạnh H ùng, Đ ặng Trọng Lương, Bùi M ạnh Cường, N guyễn H uỳnh M inh Quyên 337 N g h iên u công n g h ệ lên m en phytase từ vi k h u ẩn Bacillus subtilis 1262 Đỗ Thị N gọc H uyền, Lê Thiên Minh, N guyễn Thuỳ Châu, Trương Nam Hài 338 Biểu gen mã hóa protein vỗ virus gây bệnh viêm túi truyền nhiễm trứng gà 1266 Trần Thị T hanh H uyền, Lê Thanh Hòa, Lê Q uang H uân 339 M ột số k h ác b iệ t hoạt độ enzym , p h ổ băng protein ADN mối M arcrotertnes carbonarius, M g ilvus th u thập M ã Đà Cát Tiên, tin h Đ ông Nai 1270 Đặng Q uang H ưng, Phạm Thị Thanh Vân, Trần Thị H uyẽn Nga, N guyễn Q uang H uy, Phan Tuân Nghĩa 340 H aem ophilus influenzae T yp b: Đặc điểm sin h học p h â n tử, yếu tố n guổn lây m an g tín h gia đ ìn h 1274 Phan Lê T hanh H ương, Đ ặng Đức Anh, Vũ Thị Thu H n g , Lê N hật Minh, N gô Thị Thi, Trần Q uang Cảnh, Tsuguo Sasaki 341 K hảo sát tác đ ộ n g m ột số tác n h â n gây ức chế m iễn dịch lên hệ m iễn dịch ch u ộ t n h ắ t trắn g M us m usculus var A lbino Phan M inh Liêm, Phạm Văn Phúc, N guyễn Thị Thúy Anh, Phan Kim Ngọc, Ngô Kê'Sương 1278 1238 S IN H H Ọ C P H Ả N TỬ, T Ế BẢO VÀ CÁC Đ ỈN H HƯỞNG ỨNG DỤNG Sử dụng hệ izozym superoxide dismutaza (SOD) nghiên cứu đa hình di truyền góp phần phân loại hai lồĩ thuốc Phyllanthus amarus va Phyỉianthus urinaria Viêt Nam ■ Hồng Thị Hịa, Đinh Đồn Long*, Cao Lệ Qun, Trần Thị Nhuận Trưởng Đại học KHTN, Đại học Quốc giá Hà Nội Phạm Thanh Huyền Khoa Tài nguyên Dược Liệu, Viện Dược Liệu, Bộ Y tế MỞ ĐẦU Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.) Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) lả hai loài thuốc thuộc chi Phyllanthus, họ Euphobiaceae, phân bố tương đối rộng rãi nước ta Hai loài thuốc sử dụng từ lâu đời y học cỗ truyền Việt Nam nhiều nước Châu Á Án độ, Malaysia, Thái lan, Campuchia, Lào, Trung Quốc, Indonesia Các tác dụng điều trị biết đến rộng rãi chúng bao gồm điếu trị rối loạn đường tiêu hóa (đặc biệt bệnh lý gan), bệnh tieu đường, số bệnh thận, đường tiết niệu (Calixto et al., 1998) Gần mpt số nghiên cưu dược lý chứng minh dịch chiết Phyllanthus có tác dụng ức chế trình chép virus viêm gan siêu vi B loại retrovirus khác (bao gồm cà HIV) nhờ chế ức chế enzym chép ngược reverse transcriptaza (Thyagarajan et al„ 1988; Venkateswaran et ai., 1987; Chan et al„ 2003) Riêng nước ta, vài năm gần đây, nhiều biệt dược có nguồn gốc từ Phyllanthus amarus p urinaria sản xuất sử dụng rộng rãi Trong đó, có thẻ kề đến Livbilnic®(Cơng ty cổ phần Dược phẩm Traphaco), VG-5® (Cơng ty Dược phẩm TW5), Hepaphyl® (Cơng ty Dược phẩm TW25), Hepamarin®, Livsin-94® (Cơng ty cổ phần Dược phẩm Hà Tây), Tuy vậy, việc sản xuất dược phẩm từ hai loài p amarus p urinaria dựa dược liệu thu hải tự nhiên bộc lộ số nhược điểm sau: (1) Việc thu hái khơng có quy hoạch dễ dẫn đến nguy mắt nguồn tài nguyên di truyền; (2) Việc thu hái từ dạng hoanq dại không đáp ứng yêu cầu công nghiệp dược nguồn nguyên liệu ban đầu thường on định khó kiểm sốt thành phẩn hóa học, hoạt chất sinh học; (3) Dược liệu thu thập hoang dại có nguy nhiễm với dạng vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) tác nhân gây bệnh khác, vi mang theo nguồn chất độc ý muốn; (4) Các dạng nguyên liệu hoang dại có nguy nhiêm độc với nguồn chất độc khác nhau, chẳng hạn chất diệt cỏ, thuốc trừ sâu, chất thải cõng nghiệp Ihu hái từ vùng bị ô nhiễm; (5) Trong thực tế, p amarus p urinaria lả hai lồi thuốc có đặc điểm hình thái giống giống với số lồi Phyllanthus khác cị Việt Nam, p niruri, p reticũlatus vốn quan tâm vi mục đích chế biến dược liệu Trước thực tế đó, việc thu hái dược liệu đứng trước nguy Cữ nhầm lẫn khó có thẻ đảm bảo chất lượng cho trinh sản xuát dược phẩm Nhằm góp phần cung cấp cõng cụ phục vụ cho công tác bảo tồn, định hướng chọn tạo giống phân loại hai loài dược liệu dễ nhầm lẫn này, tiến hành đề tài “Sử dụng hệ izozym superoxide dismutaza (SOD) nghiên cứu đa hinh di truyền góp phằn phân loại h lồi thuốc p amarus P urinaria Việt Nam" VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu thực vật Đẻ thu thập nguyên liệu sử dụng nghiên cửu, chủng tiến hành bốn đợt điều tra xác định vị trí phân bổ tự nhien cua cac quằn thể hai Toài p amarus p urinaria số địa phương thuộc miền Bắc Cụ thể đợt tiến hành ngày 7-8/12/2004, Hà Nội Hà Tây; đợt ngày 3/3/2005 Bắc Giang Hải Dương; đợt ngày - 8/3/2005 ngoại thành Hà nội; đợt từ ngày 24/3 đến ngày 29/3/2005 Hà nội, Hưng Yên, Hà Tây, Hịa Bình Vĩnh Phúc Từ mẫu thu dựa vào khós phân loặi hình thái, chúng tỏi chpn 36 mâu có đặc điem hình thai tương đoi đi6n hình CÙ3 hai lồi thuốc qusn tâm nghiên cứu, có 17 mâu thuộc loai p amarus (được ky * E-mail: lorgdd_ksh@ vnu.edu.vn; ĐT: 0912 150 799 / 04 858 4748 NHỮNG VẤN ĐỂ N G H IÊN cứu c B Ả N TRONG KHOA HỌC SỐNG 1239 hiệu lả A) 19 mẫu thuộc loải p urinaria (được kỷ hiệu U) Danh sách, đja điểm thời gian thu thập mẫu nêu chi tiết Bảng Phân tích đa hình izozym Phương pháp phân tích đa hỉnh izozym thực theo qui trinh Tansklẹy Orton (1983) kết hợp với Zimmerman (1989) cỏ cài tiến, với bước sau: (1) Chọn, cắt lấy phần non rừa fcẳng nước cắt, thắm khô; (2) Cân 500 mg mẫu B ả n g D a n h s c h v đ ịa đ iể m th u th ậ p c c m ẫ u q u ầ n t h ể h a i lo i chuyển vào cối sứ, bổ sung P h y lla n th u s a m a ru s p u rin a ria 500 111 dung dịch đệm Ký hiệu Loài Địa điểm thu mẫu Thời gian nghiền thu Phyllanthus amarus Hoàn Kiếm, Hà Nội Đợt1 A hk dung dịch huyền phù đồng Đ ọi Thanh Xuân, Hà Nội P urinaria Utx (quá trình nghiền Đợt P urinaria Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội Uto giữ đá lạnh); (3) Thu Đ ọi Phyllanthus amarus Ngọc Trực, Từ Liêm, Hà Nội A nt láy dịch đồng Đợt Phyllarìthus amarus Ba Đinh, Hà Nội A bđ chuyển vào ống eppendorf, Đợt P urinaria Ubo ly tâm lạnh (4°C) 14.000 Đợt Phyllanthus amarus Nội Bài, Sóc Sơn, Hà Mội A nb Đợt vịng/phủt, vòng P urinaria Unb Đợt Phyllanthus amarus Thị trấn Đông Anh, Hà Nội phút; (4) Thu phần dịch phía A da Đợt P urinaria Uđa để tiến hảnh phân tích Đ ợ t3 Phyllanthus amarus Cổ Loa, Đỏng Anh, Hà Nội A cl hệ izozym SOD gel điện Đợt P urinaria UcL di polyacrylamid; (5) Điện di Đợt Phyllanthus amarus Hài Bối, Đông Anh, Hà Nội A hb tiến hành gel Đ ợ t3 P urinaria U hB polyacrylamid gồm hai lớp Đợt Phyllanthus amarus Phú Thị, Đông Anh, Hà Nội A pt Đợt (gel cô: 4% acrylamid, gel P urinaria Upt Đợt Phú Lỗ, Sóc Sơn, Hà Nội tách: 12% acrylamid); (6) P urinaria Upl Đọi Phyllanthus amarus Tây Hồ, Hà Nội A th Kết thúc trinh điện di, Đợt Phyllanthus amarus Đống Đa, Hà Nội Aođ gel tách khỏi khuôn Đợt Phyllanthus amarus Ngũ Hiệp, Thanh Trì, Hà Nội A nh tiến hành nhuộm phân tích Đợi Phyllanthus amarus Mao Điền, cẩm Giàng, A md hệ izozym SOD Đ ợ t2 Hải Dương P urinaria Phân tích kết nghiên cứu Tính đa hình hệ izozym SOD mẫu quần thể thuộc hai loài Phyllanthus amarus p urinaria biểu thông qua khác biệt thành phần tốc độ di chuyển tương đối (Rf) bảng điện di trẽn gel phân tích Để phân biệt băng đa hình, độ di chuyển tượng đối Rf xác định tỳ lệ khọảng cách từ đầu gel tách đên vị Umo Phyllanthus amarus A hd P urinaria Uho P urinaria Utk Phyllanthus amarus A vy P urinaria UvY Phyllanthus amarus A ln Phyllanthus amarus A sđ P urinaria Utt P urinaria Uw P urinaria UphL P urinaria UlhT P urinaria Ùls Phyllanthus amarus A yđ P urinaria Urn Đợt 1: ngày 7-8/12/2004; Đợt 2: Đợt 4: ngày 24-29/3/2005 Đ ợ t2 Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Lục Ngạn, Bầc Giang Đợt Sơn Đông, Bắc Giang Đợt Thuận Thành, Băc Ninh Nghĩa Trai, Văn Lãm, Hưng Yên Đợt Đợt Phú Lãm, Hà Đông, Hà Tây Đợt Thường Tín, Hà Tây Đợt Lương Sơn, Hịa Bình Đọt n Định, Thanh Hóa Đợt Tam Đảo, Vĩnh Phúc ngày 2-3/3/2005; Đợt 3: ngáy 7-8/3/2005; Thành Hải Dương, Hải Dương Tứ Kỳ, Hải Dương Việt Yên, Bắc Giang í 'K ĩẹ 0,63 p7 71 75 • ‘# i t - ị f Hlnh P h i điện di hệ izozym S O D cáu mầu quân thể hai loài Và p unnaria (ky hiệu U) thu thập mọt sô địa diem miền Bắc Việt Nam A> 1240 S IN H H Ọ C P H Â N TỬ, T Ế BÀO VÀ CÁC Đ ỈN H HƯỚNG ỨNG DỤNG trí băng điện di so với chiều dải gel tách Các băng đa hinh ghi nhận dựa có mặt vắng mặt cua chúng Các số liệu - _ dựng sơ đõ hinh quan hệ di truyền mẫu quần thẻ thu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phổ izozym SOD hai loài Phyllanthus amarus Phyllanthus urinaria thuốc Kết phận tích băng điện di hệ izozym SOD CÙ3 quằn thể p amarus p urinaria thu thập địa điểm khác ca đợt thu mẫu cho thấy có khác biệt rõ rẹt va kiểu hinh hệ izozym SOD hai loài thuoc Mặc dù mâu hai loài thu thập từ địa phương cách biệt mặt đja lý vào thời điểm khác (từ tháng 12/2004 đến tháng 3/2005), nhìn chung phổ điện cùa quằn thể phạm vi lồi có tính đồng hình ran rtà r h i õ t l rĩAi \ir>í\ m l Ằ n 1UẲ ì : r\ urinaria (ký hiệu U) chĩ cho băng mờ không phát thấy bảng điện (Hình 1), Khi phân tích 17 mẫu lồi p amarus, chủng tơi thu tổng cộng băng đa hình khác tương ứng với giá trị Rf 0,22; 0,40; 0,43; 0,52; 0,60; 0,63; 0,67; 0,71 0,75 Trong số đáng ý hợn có băng đồng hinh rõ nét xuất tât 17 mẫu quần thẻ loài p amarus (Rf = 0,63; Rf = 0,71 vá Rf = 0,75, xem Hệ số tư ng đ ò n g di truyền Hinh 1) Trong đó, việc phân tích 19 mẫu quần Hinh Sơ đồ quan hệ di truyền 36 quần thẻ cùa loài P urinaria thấy xuát băng thể mâu thuộc hại loài p amarus p, urinaria điện di 4/19 mẫu (chiếm ss 20%) Đó mẫu xác định kỹ thuật phân tích chi thị Uvy, Unb, Utht, Uls với tồng sổ băng đa hình izozym SOD (địa điem thu thập mẫu (Rf = 0,45; Rf = 0,48; Rf = 0,63; Rf = 0;71 Rf = nêu bảng 1) 0,75) Đối với 15/19 mẫu p urinaria lại không a i thấy II i a j r băng u a i i y uđiện i y i I U I Một iviyi U I W I I I uđáng a n y V*I I U ý y quan gsát di điềm '«■ l i _ l í A V X » L X , _ + lữa lả số mẫu kẻ (đặc biết rõ hai mẫu Uvy Unb), băng điện di xuát vị :ri Rf 0,63; 0,71 0,75, vậ^ giống với băng đồng hình rõ nét quần thể lồi p amarus ^hưng, có khác biệt đoi với mẫu p, urinaria nảy, băng điện di chì biểu mờ với :ường độ sáng Ví so với mẫu p amarus Ngoài ra, quan sát thực tế, chúng tỏi thấy hai mẫu Jvy va Unb thu thập từ khu vực có phân bổ cùa cà hai loài p amarus p urinaria >hạm vi hẹp Điều dẫn chúng tơi đến giả thiêt răng: mẫu Uvy Unb lã “con lai” hai aài p a m a ru s p urina ria, m ặ c dù hình thái chúng mang đ ặ c điểm giống với lồi p uríanaría (vì fược xếp vào nhóm U) Đây tượng đáng quan tâm, chưa ghi nhận ighiên cứu phân loại loài Phyllanthus Mặc dù trước có số báo cáo cho thấy có ton d ng trung gia n hin h thá i loài thu ộc chi Phyllanthus (Taylor, 2003) 'iệ c tất cà c c m ẫu quần th ể loài p am arus biểu băng đồng hinh rõ nét vị trí R f bang ,63; 0,71 vá ,7 cá c bảng khống xuất phằn lớn m ẵu lồi p rinaria, h o ặ c chì xu ả t m m ột số m âu quần thể đư ợc nghi ngờ lả cá c dạng trung gian, cho lấ y có th ể sử dụng c h ỉ thị SO D đẻ phân loại nhanh hai loài p am a rus p urinaria 'ựa trẽn bảng đồng hinh đa hình phân tích hệ izozym SOD từ 17 mẫu quần thể lối p marus 19 mẫu quần thể lồi p urianaria, xác định hệ số đông dạng di truyền S xây dựng quan hệ di truyền quần thể thu thập hai loài p amarus p n h ữ n g v ấ n đ ể n g h iê n c ứ u c b ả n t r o n g k h o a h ọ c sốn g 1241 urinaria việc sử dụng phần mềm NTSys 2.02h Kết trình bày Hình Từ kết phân tích, có thẻ chia quần thể hai loài p amarus vả p urinaria sử dụng nghiên cứu làm nhỏm Nhóm thứ nhắt bao gồm tồn 17 quần thẻ p amarus với hệ số tương đồng di truyền giao động khoảng từ 0,63 đến 1,00 Nhóm thứ hai gồm 14 quần thể p urinaria (bao gồm quần thẻ Ubđ Utx, Uđa, Ucli Uhb, Upt Utq, Uphi, Umđ, Uhdi Utk Uvl, U tt, Upl) có hệ số tương đồng truyền 1,00 (do hoàn toàn khỏnạ xuất băng điện di hệ izozym SOD) Nhóm cịn lại có thẻ dạng trung gian

Ngày đăng: 18/03/2021, 15:30

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan