Ứng Dụng Kỹ Thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Để Nghiên Cứu Đa Dạng Di Truyền Virus Đốm Trắng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) ĐỂ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VIRUS ĐỐM TRẮNG (WHITE SPOT SYNDROME VIRUS) TRÊN TÔM BẠC (Fenneropenaeus merguiensis), TÉP TRẤU (Macrobrachium lanchesteri) VÀ TÔM SÚ (Penaeus monodon) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS BÙI THỊ MINH DIỆU VIỆN NC&PT CNSH SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN THÁI HỌC MSSV: 3064388 LỚP:CNSH K32 Cần Thơ, Tháng 5/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) Bùi Thị Minh Diệu Nguyễn Thái Học DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Trước tiên em xin bày tỏ lịng biết ơn đển tất q thầy trường Đại học Cần Thơ hỗ trợ em suốt bốn năm dài đường tìm tri thức Em xin cám ơn thầy, cô, anh, chị Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ hỗ trợ tạo kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập rèn luyện trình thực luận văn Đặc biệt em xin chân thành cám ơn cô cố vấn Trần Thị Xuân Mai cô Bùi Thị Minh Diệu- người trực tiếp hướng dẫn tận tình, ln động viên cung cấp nhiều tài liệu, kiến thức quý báu, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi tốt để em hoàn thành luận văn Em xin chân thành cám ơn thầy Nguyễn Thanh Phương- Khoa Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ; cô Kim Hường- Khoa Nông Nghiệp & Thủy Sản, trường Đại học Trà Vinh anh Phạm Văn Mười- Cà Mau tất bà nơng dân nhiệt tình giúp đỡ em suốt trình thu mẫu thực đề tài luận văn tốt nghiệp Cám ơn bạn lớp Công Nghệ Sinh Học K32 bên cạnh em em chia sẻ buồn vui ngày sống xa nhà Cám ơn bạn cho nhiều kỉ niệm đẹp suốt quãng đời sinh viên Và cuối em vô biết ơn Ba mẹ hi sinh thầm lặng để nuôi dưỡng, che chở cho đến ngày khôn lớn tất anh chị em gia đình yêu thương, thông cảm cho miệt mài suốt chặng đường dài Em xin chân thành cám ơn! Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT TÓM TẮT Qua số nghiên cứu cho thấy virus đốm trắng (White Spot Syndrome VirusWSSV) có biến đổi gen theo vị trí địa lý, thay đổi ký chủ khác có thay đổi số kiểu gen có khả lây nhiểm trở lại tơm sú (Penaeus monodon) gây bùng phát dịch bệnh diện rộng…, gây thiệt hại nặng nề cho nghành ni tơm Do vấn đề đặt cần phải tìm hiểu biến đổi di truyền virus đốm trắng ký chủ khác để từ làm tiền đề định hướng cho phương pháp ngăn ngừa phòng trị đạt hiệu cao góp phần tăng giá trị kinh tế tôm sú Nội dung đề tài tìm thị phân tử thể khác biệt di truyền ORF thuộc vùng gen VNTRs (variable number tandem repeats) chủng WSSV (White Spot Syndrome Virus) trích tơm sú, tôm bạc (Fenneropenaeus merguiensis) tép trấu (Macrobrachium lanchesteri) huyện Hồng Dân, Đông Hải thuộc tỉnh Bạc Liêu huyện Đầm Dơi tỉnh Cà Mau Kết thu sử dụng ORF75 để so sánh khác biệt di truyền chủng WSSV tôm sú phạm vi ao ORF125 để so sánh khác biệt di truyền WSSV tôm sú, tép trấu ao với thông qua kiểu gen đặc trưng ao Với tỉ lệ giống cao thông tin di truyền mẫu WSSV tôm sú tôm bạc ORF khảo sát cho tơm bạc nguồn lây nhiễm WSSV cho tôm sú ao Chuyên nghành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v CÁC TỪ VIẾT TẮT vi CHƢƠNG GIỚI THIỆU CHƢƠNG LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc tình hình ni tơm bệnh tôm nƣớc ta 2.1.1 Diện tích sản lượng tơm ni .3 2.1.2 Tình hình dịch bệnh tơm sú .4 2.2 Sơ lƣợc ký chủ trung gian 2.3 Bệnh đốm trắng 2.3.1 Dấu hiệu bệnh lý .6 2.3.2 Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) .6 2.4 Các nghiên cứu liên quan vấn đề phát virus gây bệnh đốm trắng ký chủ 12 2.5 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)……………………………… 13 2.5.1 Phản ứng PCR .13 2.5.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến sản phẩm PCR 14 2.5.3 Ứng dụng kỹ thuật PCR 15 CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP 16 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu .16 3.2 Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ hóa chất 16 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu .16 3.2.2 Dụng cụ 16 Chuyên nghành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT 3.2.2 Mồi, hóa chất 16 3.3 Phƣơng pháp tiến hành 17 3.3.1 Thu bảo quản mẫu tôm ký chủ 17 3.3.2 Ly trích kiểm tra chất lượng ADN 17 3.3.3 Thực phản ứng PCR điện di .18 3.3.4 Xác định số đơn vị lặp lại ORF94 ORF125 19 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 4.1 Đa dạng sinh học WSSV tôm sú tép trấu huyện Hồng Dân 20 4.1.1 Đa dạng WSSV tôm sú huyện Hồng Dân 20 4.1.2 Đa dạng WSSV tép trấu huyện Hồng Dân 21 4.1.3 Mối liên hệ di truyền WSSV tôm sú tép trấu huyện Hồng Dân 22 4.2 Đa dạng sinh học WSSV tôm sú, tôm bạc tép trấu huyện Đông Hải tỉnh Bạc Liêu huyện Đầm Dơi tỉnh Cà mau 24 4.2.1 Đa dạng WSSV tôm sú huyện Đông Hải Đầm Dơi 25 4.2.2 Đa dạng di truyền WSSV tép trấu tôm bạc Đông Hải Đầm Dơi 26 4.2.3 Mối liên hệ di truyền mẫu WSSV tép trấu, tôm bạc tôm sú huyện Đông Hải Đầm Dơi 26 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 28 5.1 Kết luận .28 5.2 Đề nghị 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 PHỤ LỤC Phụ lục Thông tin mẫu thí nghiệm Phụ lục Số liệu đo OD mẫu phân tích Phụ lục Kết hình gel mẫu thí nghiệm Chun nghành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng Diện tích vùng ni tơm năm 2001 2003 Bảng So sánh đơn vị lặp lại ORF mang lặp lại có định hướng, thuộc vùng khơng tương đồng ba chủng WSSV Bảng Danh sách mẫu sử dụng nghiên cứu Dieu et al., 2004 11 Bảng Các primer sử dụng nghiên cứu 16 Bảng Kiểu gen VNTRs mẫu WSSV tôm sú tép trấu huyện Hồng Dân 22 Bảng Kiểu gen VNTRs mẫu WSSV tôm sú, tôm bạc tép trấu huyện Đông Hải Đầm Dơi 24 Bảng Nguồn gốc ký hiệu mẫu dùng phân tích thí nghiệm Bảng Kết OD mẫu phân tích Chuyên nghành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình Phân tích bootstrap (100 sao) phát sinh lồi khơng rễ protein ADN polymerase tạo nên thuật toán phân tích PAUP Đường đậm giống đến 70% (giá trị bootstrap >70) (van Hulten et al., 2001a) Hình Mơ hình virion WSSV (Mark, 2005) Hình Chu kì gia nhiệt phản ứng PCR primer VP26 18 Hình Kết PCR với ORF75 mẫu WSSV tôm sú 20 Hình Kết PCR với ORF125 mẫu WSSV tơm bạc tép trấu 25 Hình Kết PCR với ORF75 mẫu WSSV tơm sú Hình Kết PCR với ORF75 mẫu WSSV tôm bạc tép trấu Hình Kết PCR với ORF94 mẫu WSSV tôm sú Hình Kết PCR với ORF94 mẫu WSSV tôm bạc tép trấu Hình 10a Kết PCR với ORF125 mẫu WSSV tơm sú Hình 10b Kết PCR với ORF125 mẫu WSSV tôm sú Chuyên nghành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT CBV Chinese baculovirus ĐBSCL Đồng sông Cửu Long FAO Food and Agriculture Organization HHNBV Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Baculovirus ICTV the International Committee on Taxonomy for Viruses OIE Office International des Epizooties ORF125 Open Reading Frame 125 ORF75 Open Reading Frame 75 ORF94 Open Reading Frame 94 PCR Polymerase chain reaction OD Optical Density PRDV Penaid rod-shaped DNA virus RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms RU Repeat Unit RV-PJ Rod-shaped nuclear virus of Penaeus japonicus SEMBV Systemic ectodermal and mesodermal baculovirus VNTRs Variable number tandem repeats TH-96-II Chủng WSSV có ly trích từ mẫu tôm thu Thái Lan vào năm 1996 WSBV White Spot Baculovirus WSD White Spot Disease WSSV White Spot Syndrome Virus WSSV-CN Chủng WSSV ly trích từ mẫu tơm thu Trung Quốc WSSV-TH Chủng WSSV ly trích từ mẫu tôm thu Thái Lan WSSV-TW Chủng WSSV ly trích từ mẫu tơm thu Đài Loan WSSV-VN Chủng WSSV ly trích từ mẫu tôm thu Việt Nam YHD Yellow Head Virus Chuyên nghành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT CHƢƠNG GIỚI THIỆU Ngày ngành nuôi trồng thủy hải sản phát triển rộng khắp tồn giới nhằm góp phần đáng kể vào tăng trưởng kinh tế đồng thời đáp ứng nhu cầu tiêu dùng gia tăng, bên cạnh cịn ngăn ngừa tượng khai thác q mức nguồn tài nguyên thiên nhiên có nguy cạn kiệt Trong đó, tơm sú lồi trọng phù hợp với thị hiếu vị người tiên dùng tôm sú mang lại giá trị lợi nhuận đáng kể cho người nuôi, tăng thu nhâp cho kinh tế quốc dân Tuy nhiên,trong khoảng thời gian gần tượng nuôi bùng phát thiếu kiểm sốt, người ni khơng đủ trình độ kỹ thuật gây nên nhiều vấn đề nghiêm trọng khơng rà sốt hết nguồn gốc tơm giống khơng đảm bảo tính ổn định chất lượng, sử dụng loại nhiều loại hóa chất gây ô nhiễm môi trường nuôi trầm trọng,… Từ loại dịch bệnh có hội bùng phát lây lan nhanh chóng thành dịch gây nên nhiều khó khăn cho nhà quản lý thiệt hại lớn kinh tế cho người nuôi - thời vàng son tơm sú từ trơi qua Trong phải kể đến bệnh virus vi khuẩn gây ra, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến ổn định lợi nhuận cơng nghiệp ni tơm tồn giới (van Hulten et al., 2001) Hiện nay, người ta biết có 20 loại virus tác nhân gây bệnh tôm (Walker et al., 2009), hầu hết loại virus thành viên họ Pavorividae, Baculoviridae, Picornaviridae, Togaviridae số họ khác Phổ biến phải kể đến virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV), virus đầu vàng (YHV), Baculovirus (MBV) IHHNV (virus nhiễm vỏ gây hoại tử quan tạo máu) Trong số virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) tác nhân gây thiệt hại nghiêm trọng (Rosenberry, 2004 ),… Một số nghiên cứu cho thấy chủng WSSV vị trí địa lý khác có khác biệt gen (Nadala and Loh, 1998; Lo et al., 1999; Wang et al., 2000; Marks et al., 2004; Dieu et al., 2004), chủng WSSV chuyển qua kí chủ khác thay đổi số kiểu gen (Dieu et al., 2004) WSSV tồn nhiều kí chủ khác cua, tép tạp số loài giáp xác khác (Lo et al., 1996a; Wang et al., 1998) theo ký chủ lây lan từ ao sang ao khác, vùng sang vùng khác,… khó kiểm sốt gây bùng phát dịch diện rộng Do vấn đề cấp thiết đặt cần phải tìm hiểu thơng tin di truyền virus đốm trắng ký chủ Chuyên nghành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT tồn khơng thể dùng ORF94 để phân biệt chủng WSSV đặc trưng tép trấu c ORF125 Kết PCR với ORF125 mẫu WSSV tép trấu cho thấy có ổn định kiểu gen mẫu WSSV ao khác huyện Hồng Dân (bảng 5) Như ORF125 dấu phân tử thích hơp để nghiên cứu dịch tể WSSV phạm vi huyện Bảng Kiểu gen VNTRs mẫu WSSV tôm sú tép trấu huyện Hồng Dân Tôm sú S-HD1a05 S-HD1b05 S-HD2a07 S-HD2b07 S-HD3a07 S-HD3b07 S-HD3c07 S-HD3d07 S-HD4a07 S-HD4b07 S-HD4c07 S-HD4d07 Tép trấu TT-HD105 TT-HD207 TT-HD3a07 TT-HD3b07 TT-HD3c07 TT-HD407 ORF75(bp) 500 500 500 460 460 500 500 500 500 460 460 460 ORF94(RUs) * 12 10 12 * 10 * 10 10 10 10 ORF125(RUs) 6 * * 6 6 500 500 400 500 500 400 * 6 * 7 7 7 In đậm: kiểu gen (*): khơng rõ kết PCR S-HD108: mẫu tôm sú (S) thu ao số 1( 1) huyện Hồng Dân( DH) vào tháng 8/2009(08) a, b, c : mẫu ao TT-: tép trấu 4.1.3 Mối liên hệ di truyền WSSV tôm sú tép trấu huyện Hồng Dân a ORF75 Kết PCR ORF75 mẫu WSSV tơm sú tép trấu thể kiểu kích thước PCR khác nhau, mẫu WSSV tôm sú tép trấu Chuyên nghành Công nghệ Sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT xuất kích thước 500 bp có khác biệt mẫu WSSV tơm sú có kích thước 460 bp cịn mẫu WSSV tép trấu lại có kích thước 400 bp (bảng 5) Từ cho thấy biến đổi WSSV tơm sú tép trấu mang tính ngẫu nhiên cao, ORF75 khác biệt đặc trưng chủng WSSV loại ký chủ nên ta sử dụng ORF75 để phân biệt mẫu WSSV tôm sú tép trấu b ORF94 Kết PCR với ORF94 mẫu WSSV tôm sú tép trấu cho thấy có kiểu gen khác (bảng 5) Và khác biệt kiểu gen ORF94 mẫu WSSV tôm sú tép trấu 100% cho thấy biến đổi mang tính ngẫu nhiên ORF94 mẫu WSSV tôm sú tép trấu huyện Hồng Dân Vì ta khơng thể sử dụng ORF94 để tìm liên hệ di truyền chủng WSSV tôm sú tép trấu huyện c ORF125 So sánh mẫu WSSV trích tơm sú tép trấu ta nhận thấy có khác biệt đặc trưng thể mẫu WSSV tép trấu Theo kết bảng ta thấy có biến đổi kiểu gen ORF125 mẫu WSSV tôm sú kiểu gen đa số mẫu hay khác ao RUs Nhưng với mẫu WSSV tép trấu ta thấy kiểu gen đặc trưng RUs cho tất mẫu phân tích Do ORF125 đề nghị dấu phân tử thích hợp để nghiên cứu khác biệt di truyền chủng WSSV ký chủ khác mà thể tôm sú tép trấu Hầu hết mẫu WSSV tép trấu thể tính đa hình (một mẫu WSSV cá thể tép trấu cho nhiều kiểu gen khác nhau) ORF125 điều giải thích thân tép trấu khơng bị ảnh hưởng WSSV cá thể tép trấu ao sống sót qua dịch bệnh mang nhiểu chủng WSSV khác chủng có mật số cao cho sản phẩm PCR rõ Theo Wang et al (1998) WSSV tồn ký chủ khác lây lan trở lại cho tôm sú, mà mẫu WSSV tôm sú huyện Hồng Dân thể kết PCR với kiểu gen có khác biệt so với kiểu gen mẫu WSSV tép trấu ao ao khác huyện Theo tài liệu cá nhân Dieu et al., điều cho thấy có biến đổi gen WSSV thay đổi ký chủ, khả có chủng tép trấu lan truyền sang tôm lại có Chun nghành Cơng nghệ Sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT kiểu gen chủng WSSV cho thấy có lan truyền mà cịn mang tính chon lọc có thay đổi kiểu gen 4.2 Đa dạng sinh học WSSV tôm sú, tôm bạc tép trấu huyện Đông Hải tỉnh Bạc Liêu huyện Đầm Dơi tỉnh Cà mau Theo Dieu et al (2004) vùng VNTRs gen WSSV xác định liên hệ di truyền phạm vi không gian nhỏ ( ~ 10 km) huyện Đông Hải Đầm Dơi cách ~6 km quy lại thành nhóm để khảo sát đa dạng WSSV ký chủ Bảng Kiểu gen VNTRs mẫu WSSV tôm sú, tôm bạc tép trấu huyện Đông Hải Đầm Dơi Tôm sú S-DH108 S-DH208 S-DH308 S-DD1a10 S-DD1b10 S-DD310 S-DD4a10 S-DD4b10 S-DD4c10 S-DD4d10 S-DD4e10 Tôm bạc TB-DD1a10 TB-DD1b10 TB-DD210 TB-DD310 TB-DD410 Tép trấu TT-DH108 TT-DH308 ORF75(bp) 360 460 460 400 400 400 460 400 500 500 500 ORF94(RUs) ORF125(RUs) 6 4 4 * 4 4 10 * 400 400 400 * 400 4 * 360 500 * * In đậm: kiểu gen (*): khơng rõ kết PCR S-DH108: mẫu tôm sú (S) thu ao số 1( 1) huyện Đông Hải( DH) vào tháng 8/2009(08) S-DD1a10: mẫu tôm sú (S) thứ (a) thu ao số (1) huyện Đầm Dơi (DD) vào tháng 10/2009 (10) TB- : tôm bạc TT-: tép trấu Chuyên nghành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT 4.2.1 Đa dạng WSSV tôm sú huyện Đông Hải Đầm Dơi a ORF75 Theo kết PCR thể kích thước PCR thể bảng mẫu WSSV trích từ mẫu tơm sú huyện Đơng Hải Đầm Dơi ta thấy có khác biệt lớn kiểu gen mẫu WSSV tôm sú ao khác khảo sát huyện Nhưng ta chia nhỏ mức độ ao ta thấy ao có kiểu gen đặc trưng Vì ta sử dụng ORF75 để nghiên cứu khác biệt di truyền chủng WSSV tôm sú ao nuôi b ORF94 Các mẫu WSSV trích tơm sú huyện Đơng Hải Đầm Dơi cho thấy có biến đổi lớn ngẫu nhiên kiểu gen, mẫu WSSV ao thể hiên khác biệt kiểu gen (bảng 6) Điều cho thấy biến đổi ORF94 mẫu WSSV tôm sú mạnh mẽ, ngẫu nhiên không ổn định nên sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền WSSV tôm sú huyện Đông Hải Đầm Dơi c ORF125 500 bp Hình Kết PCR với ORF125 mẫu WSSV tôm bạc tép trấu M: thang chuẩn 1kb Ở ORF125 mẫu WSSV từ tơm sú huyện Đơng Hải Đầm Dơi có ổn định tương đối cao thể qua giống kiểu gen mẫu WSSV ao khác thuộc huyện Tuy nhiên ta thấy ổn định phạm vi hẹp hơn, tức mẫu huyện giống khác huyện thi có Chun nghành Cơng nghệ Sinh học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT khác (bảng 6) Cụ thể huyện Đầm Dơi ta thấy có ổn định cao ORF125 với giống kiểu gen mẫu WSSV thu tôm sú RUs ao mà ao khác huyện (phạm vi khoảng km) Như ORF125 dấu phân tử thích hơp để nghiên cứu dịch tể WSSV phạm vi huyện 4.2.2 Đa dạng di truyền WSSV tép trấu tôm bạc Đông Hải Đầm Dơi a Đa dạng WSSV tép trấu Đông Hải Sự biến đổi ORF75 ORF125 mẫu WSSV trích tép trấu Đơng Hải cho thấy có khác biệt kiểu gen ao khác (bảng 6) Ngoài mẫu WSSV tép trấu Đông Hải thể tính đa hình (mỗi mẫu WSSV cá thể tép trấu cho nhiều kiểu gen khác nhau), tép trấu có khả nguồn lây nhiễm WSSV lớn cho tôm sú ao nuôi b Đa dạng WSSV tôm bạc Đầm Dơi Ở ORF75 ta thấy kết PCR mẫu WSSV từ tôm bạc Đầm Dơi (bảng 6) kiểu gen đặc trưng WSSV tơm bạc Ở ORF94 ta thấy có biến đổi mạnh mẽ kiểu gen mẫu WSSV tôm bạc thuộc khác ao (bảng 6) Sự biến đổi mạnh mẽ giống biến đổi mẫu WSSV tôm sú huyện Đầm Dơi, góp phần khẳng định tỉ lệ biến đổi cao ORF94 gen WSSV Ở ORF125 ta thấy biến đổi mẫu WSSV tôm bạc lớn (bảng 6) Kết kiểu gen WSSV tôm bạc Vì ORF125 khơng hữu dụng làm dấu phân tử để phân biêt mẫu WSSV ký chủ mà cụ thể tôm sú tôm bạc Tuy nhiên, ký chủ ORF125 mẫu ao khác huyện thể kiểu gen khác Do đề nghị dấu phân tử phù hợp để nghiên cứu dịch tể học WSSV ký chủ riêng biệt phạm vi huyện 4.2.3 Mối liên hệ di truyền mẫu WSSV tép trấu, tôm bạc tôm sú huyện Đông Hải Đầm Dơi a Mối liên hệ di truyền tép trấu tôm sú huyện Đông Hải Ở ORF75 ta thấy có giống kích thước PCR mẫu WSSV tép trấu tôm sú ao DH1 mẫu ao, bên cạnh mẫu ao Chuyên nghành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT DH3 mẫu ao lại cho kết PCR khác (bảng 6) Kết cho ta thấy ORF75 có tính biến đổi cao, ORF75 khơng thích hợp để sử dụng làm dấu phân tử nghiên cứu dịch tể học WSSV phạm vi huyện mà có lẽ thích hợp để sử dụng phạm vi nhỏ (giữa chủng ao) Ở ORF125 ta thấy có ổn định mẫu WSSV ao tôm sú tép trấu Mẫu WSSV ao DH1 DH3 cho kết giống kiểu gen ORF125 (bảng 6) Như ta thấy sử dụng ORF125 khảo sát mối liên hệ di truyền mẫu WSSV tôm sú tép trấu phạm vi ao b Mối liên hệ di truyền mẫu WSSV trích từ tơm sú tôm bạc huyện Đông Hải Đầm Dơi Ở ORF75 ta thấy có giống kích thước PCR mẫu WSSV tôm sú tôm bạc (bảng 6) Đều khác biệt di truyền hay biến đổi kích thước PCR ORF75 mẫu WSSV tơm sú tơm bạc hay có lan truyền trực tiếp WSSV từ tôm sú qua tơm bạc ngược lại mà khơng có chon lọc có giống thơng tin di truyền chủng WSSV tôm sú tơm bạc ORF75 ORF94: Qua kết trình bày bảng ta nhận thấy khác biêt mẫu WSSV tôm sú tôm bạc tương đối lớn có giống kiểu gen ao DD1 Như biến đổi ORF94 mẫu WSSV trích tơm sú so với mẫu WSSV trích tơm bạc lớn, khơng thể sử dụng ORF94 để nghiên cứu mối liên hệ di truyền WSSV trích từ tơm sú tơm bạc phạm vi huyện hay ao ORF125: Sự biến động ORF125 mẫu WSSV tôm sú tương đối ổn định khơng có nhiều khác biệt tơm bạc có biến đổi lớn kiểu gen ORF125 (bảng 6) Do ta sử dụng ORF125 để nghiên cứu khác biệt đặc trưng mẫu WSSV tôm sú tôm bạc huyện Đầm Dơi tỉnh Cà Mau Ta thấy có tương đồng kiểu gen vùng VNTRs WSSV tôm sú tôm bạc nên nguồn lây nhễm WSSV ao tôm tôm bạc Chuyên nghành Công nghệ Sinh học 27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Xác định mối liên hệ di truyền kích thước sản phẩm PCR ORF75 kiểu gen ORF94 ORF125 mẫu WSSV trích từ mẫu tôm sú, tôm bạc tép trấu thu huyện Hồng Dân, Đông Hải huyện Đầm Dơi Có thể sử dụng ORF75 để so sánh khác biệt di truyền chủng WSSV tôm sú tép trấu phạm vi ao, ORF125 dùng để so sánh khác biệt di truyền WSSV tôm sú, tép trấu ao huyện thông qua kiểu gen đặc trưng cho ao Riêng tôm bạc kiểu gen đặc trưng ORF75 nên sử dụng ORF nầy để khảo sát đa dạng di truyền WSSV tôm bạc Sự biến đổi ORF94 WSSV tôm sú, tôm bạc tép trấu mạnh mang tính ngẫu nhiên Có giống lớn thông tin di truyền WSSV tôm sú tôm bạc ORF khảo sát, giống ORF75 nên tơm bạc nguồn lây lan WSSV trực tiếp sang tôm sú Sự đa hình mẫu WSSV tép trấu đặt giả thuyết có nhiều chủng WSSV tồn phát triển cá thể ký chủ 5.2 Đề nghị Tiếp tục khảo sát vùng biến đổi khác ORF14/15, ORF23/24… nhiều mẫu ký chủ khác thu ao tăng số lượng mẫu nghiên cứu để đánh giá xác khác biệt di truyền WSSV tôm sú nhiều ký chủ khác Khảo sát tính độc chủng WSSV ký chủ khác nhau, tìm mối liên hệ có với biến đổi vùng gen VNTRs tìm nguồn lây nhiễm cho tơm sú loại ký chủ Tiến hành khảo sát biến đổi vùng biến đổi gen WSSV chuyển qua nhiều hệ ký chủ tôm nuôi khác nhau, đồng thời nghiên cứu biểu vùng gen qua hệ khác để tìm mối liên hệ di truyền biểu vùng gen (có thể có) để từ góp phần định hướng tìm giả pháp phòng ngừa điều trị đặt hiệu tương lai Chuyên nghành Công nghệ Sinh học 28 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH Dieu, B.T.M., Hendrik, M., Siebenga, J., Rob, W., Goldbach, Douwe, Z., Duong, T.P and J.M Vlak 2004 Molecular epidemiology of white spot syndrome virus within Vietnam J Gen Virol, 85, 3607-3618 C H & G.H Kou 1996 White spot syndrome baculovirus (WSBV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other arthropods Dis Aquat Org, 27, 215-225 Chang, P.S., Lo, C.F., Wang, Y.C and G.H Kou 1996 Identification of white spot syndrome associated baculovirus (WSBV) target organs in the shrimp Penaeus monodon by in situ hybridization Dis Aquat Org 27, 131-139 Durand, S., Lightner, D.V., Redman, R.M and J.R Bonami 1997 Ultrastructure and morphogenesis of white spot syndrome baculovirus (WSSV) Dis Aquat Org 29, 205–211 Flegel, T.W 1997 Major viral diseases of the black tiger prawn (Penaeus monodon) in Thailand Microbiol Biotechnol 13, 433-442 Gusheinzed, W., John, K.R., George, M.R and P Jeyaseelan 2006 Differential host passaging alters pathogenicity and induces genomic variation in white spot syndrome virus Aquaculture 261, 54-63 Lan, Y., Lu, W and X Xu 2002 Genomic instability of prawn white spot bacilliform virus (WSBV) and its association to virus virulence Virus Res 90, 269–274 Lightner, D.V 1996 A handbook of pathology and diagnostic procedures for diseases of penaeid shrimp In Special publication of the World Aquaculture Society LA: Baton Rouge Lo, C.F., Hsu, H.C., Tsai, M.F., Ho, C.H., Peng, S.E., Kou, G.H and D.V Lightner 1999 Specific genomic ADN fragment analysis of different geographical clinical samples of shrimp White spot syndrome virus Dis Aquat Org 35, 175-185 Lo, C.F., Ho, C.H., Peng, S.E., Chen, C.H., Hsu, H.C., Chiu, Y.L., Chang, C.F., Liu, K.F., Su, M.S., Wang, C.H and G.H Kou 1996 White spot syndrome baculovirus (WSBV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other arthropods Dis Aquat Org 27, 215-225 Chuyên nghành Công nghệ Sinh học 29 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Lo, C.F., Ho, C.H., Chen, C.H., Liu, K.F., Chiu, Y.L., Yeh, P.Y., Peng, S.E., Hsu, H.C., Liu, H.C., Chang,C.F., Su, M.S., Wang, C.H and G.H Kou 1997 Detection and tissue tropism of White spot syndrome baculovirus (WSBV) in captured brooders of Penaeus monodon with a special emphasis on reproductive organs Dis Aquat Org 30, 53-72 Marielle, C.W van Hulten, Marcel, W., Goodall, S.D and J.M Vlak 2000 Identification of two major virion protein genes of white spot syndrome virus of shrimp Virology 266, 227-236 Marielle C.W., van Hulten, Jeroen, W., Marjolein, S and J.M Vlak 2001., White spot syndrome virus envelop protein VP28 is involved in the systemic infection of shrimp Virology 285, 228-233 Marks, H., Goldbach, R.W., Vlak, J.M & M.C.V Hulten 2004 Genetic variation among isolates of White spot syndrome virus Arch Virol 149, 673-697 Marks, H., Ren, X., Witteveldt, J., Sandbrink, H., Vlak, J.M and M.C.V Hulten 2004 Transcription regulation and genomics of White spot syndrome virus In Diseases in Asian Aquaculture V Edited by P J.Walker Mayo, M.A 2002 A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV Arch Virol 147, 1655–1663 Musthaq S.S., Sudhakaran R., Ahmed, V.P.I., Balasubramanian, G and A.S.S .Hameed 2006 Variability in the tandem repetitive ADN sequences of VP28 gene to detect different isolates of WSSV from India 256, 1-4 Nadala, E.C.B., Jr & P.C Loh 1998 A comparative study of three different isolates of white spot virus Dis Aquat Org 33, 231–234 Nadala, E.C.B., Tapay, L.M & P C Loh 1998 Characterization of a non occluded baculovirus-like agent pathogenic to penaeid shrimp Dis Aquat Org 33, 221– 229 Nakano, H., Koube, H., Umezaea, S., Momoyama, K., Hiraoka, M., Inouye, K and N Oseko 1994 Mass Mortalities Of Cultured Kuruma Shrimp Penaeus Japonicus, In Japan In 1993: Epizootiological Survey And Infection Trials Fish Path 29, 135-139 Peter J.W and C V Mohan 2009 Viral disease emergence in shrimp aquaculture: origins, impact and the effectiveness of health management strategies 1, 125-153 Chuyên nghành Công nghệ Sinh học 30 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Pradeep, B., Shekar, M and I Karunasagar 2008 Characterization of variable genomic region of Indian white spot syndrome virus J Virol, 360, 24-30 Pradeep, B., Shekar, M., Gudkovs, N and I Karunasagar 2008 Genotyping of white spot syndrome virus prevalent in shrimp farms of India Dis Aquat Org,78, 189-198 Rajendran, K.V., Vijayan, K.K., Santiago, T.C and R.M Krol 1999 Experimental host range and histopathology of white spot syndrome virus (WSSV) infection in shrimp, prawns, crabs and lobsters from India J Fish Dis 22, 183-191 Rosenberry, B., 1996 World shrimp farming 1996 In Shrimp News International San Diego, California, USA Rosenberry, B 2000 World shrimp farming 2000 In Shrimp News International San Diego, California, USA Rosenberry, B 2002 World shrimp farming 2002 In Shrimp News International San Diego, California, USA Rosenberry, B 2004 World shrimp farming 2004 In Shrimp News International San Diego, California, USA van Hulten, M.C.W., Witteveldt, J., Peters, S., Kloosterboer, N., Tarchini, R., Fiers, M., Sandbrink, H., Klein Lankhorst, R and J.M Vlak 2001 The white spot syndrome virus ADN genome sequence Virology 286, 7–22 Yang, F., He, J., Lin, X.H., Li, Q., Pan, D., Zhang, X.B and X Xu 2001 Complete genome sequence of the shrimp white spot bacilliform virus J Virol 75, 11811– 11820 Yang, F., He, J., Lin, X.H., Li, Q., Pan, D., Zhang, X.B and X Xu 2001 Complete genome sequence of the shrimp White spot bacilliform virus J Virol 75, 1181111820 Wang, Q., Nunan, L.M and D.V Lightner 2000 Identification of genomic variations among geographic isolates of White spot syndrome virus using restriction analysis and Southern blot hybridization Dis Aquat Org 43, 175-181 Wang, Y.C., Lo, C.F., Chang, P.S and G.H Kou 1998 Experimental infection of white spot baculovirus in some cultured and wild decapods in Taiwan Aquaculture 164, 221–231 Chuyên nghành Công nghệ Sinh học 31 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Wang, Q., White, B.L., Redman, R.M and D.V Lightner 1999 Per os challenge of Litopenaeus vannamei postlarvae and Farfantepenaeus duorarum juveniles with six geographic isolates of White spot syndrome virus Aquaculture 170, 179-194 Wongteerasupaya, C., Vickers, J.E., Sriurairatana, S & other authors 1995 A nonoccluded, systemic baculovirus that occurs in cells of ectodermal and mesodermal origin and causes high mortality in the black tiger prawn Penaeus monodon Dis Aquat Org 21, 69–77 TIẾNG VIỆT Bùi Quang Tề 2003 Bệnh tôm nuôi bện pháp phịng trị NXB Nơng Nghiệp Cao Phong, Đình Cảnh 2006 Đồng Bằng Sông Cửu Long: mùa tôm bệnh cũ Báo Sài Gịn Giải Phóng, 14/06/2006 Đặng Thị Hồng Oanh, Nguyễn Thanh Phương 2002 Giáo trình bệnh tôm Tài liệu lưu hành nội - Đại học Cần Thơ Hà Anh 2004 Bệnh tôm nuôi đơi lời bàn Tạp chí thủy sản số 3/ 2004 Nguyễn Văn Hảo 2004 Một số bệnh thường gặp tơm sú – Các phương pháp chuẩn đốn biện pháp phịng trị NXB Nơng Nghiệp Quyền Đình Thi, Nơng Văn Hải 2008 Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích ADN (tập II) NXB Khoa Học Tự Nhiên Công Nghệ Trần Thị Tuyết Hoa 2004 Bài giảng bệnh virus động vật thủy sản Trịnh Đình Đạt 2007 Công nghệ di truyền NXB Giáo Dục TRANG WEB http://www.fistenet.gov.vn, ngày 20/05/2009 http://www.monre.gov.vn, ngày 12/08/2009 http://www.pubmedcentral.nih.gov, ngày 12/08/2009 http://www.sciencedirect.com, ngày 12/08/2009 http://www.sinhhocvietnam.com.vn, ngày 13/08/2009 http://www.thitruong.vnn.vn, ngày 22/05/2009 http://vovnews.vn/, ngày 12/03/2009 Chuyên nghành Công nghệ Sinh học 32 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT PHỤ LỤC Phụ lục Thơng tin mẫu thí nghiệm Bảng Nguồn gốc ký hiệu mẫu dùng phân tích thí nghiệm Ao thu mẫu Địa Bành Út Ba Hồng DânBạc Liêu Bác Khiêm Đông HảiBạc Liêu Đông HảiBạc Liêu Đông HảiBạc Liêu Hồng DânBạc Liêu Dượng Út Điền Bác Tám Mãnh Nguyễn Văn Cận Dượng Hai Hồng DânBạc Liêu Anh Tư Hồng DânBạc Liêu Anh Hai Lanh Đầm DơiCà Mau Chú Tư An Đầm DơiCà Mau Đầm DơiCà Mau Đầm DơiCà Mau Anh Tư Long Phạm Văn Mười Chuyên nghành Công nghệ Sinh học Ký hiệu số 16 17 18 Ký hiệu phân tích TT-HD105 S-HD1a05 S-HD1b05 TT-DH108 S-DH108 S-DH208 Tép trấu - Macrobrachium lanchesteri Tôm sú - Penaeus monodon Tôm sú - Penaeus monodon Tép trấu - Macrobrachium lanchesteri Tôm sú - Penaeus monodon Tôm sú - Penaeus monodon 32 30 37 35 36 39 40 41 42 43 44 45 54 56 57 58 59 90 91 88 89 99 TT-DH308 S-DH308 TT-HD207 S-HD2a07 S-HD2b07 TT-HD3a07 TT-HD3b07 TT-HD3c07 S-HD3a07 S-HD3b07 S-HD3c07 S-HD3d07 TT-HD407 S-HD4a07 S-HD4b07 S-HD4c07 S-HD4d07 TB-DD1a10 TB-DD1b10 S-DD1a10 S-DD1b10 TB-DD210 Tép trấu - Macrobrachium lanchesteri Tôm sú - Penaeus monodon Tép trấu - Macrobrachium lanchesteri Tôm sú - Penaeus monodon Tôm sú - Penaeus monodon Tép trấu - Macrobrachium lanchesteri Tép trấu - Macrobrachium lanchesteri Tép trấu - Macrobrachium lanchesteri Tôm sú - Penaeus monodon Tôm sú - Penaeus monodon Tôm sú - Penaeus monodon Tôm sú - Penaeus monodon Tép trấu - Macrobrachium lanchesteri Tôm sú - Penaeus monodon Tôm sú - Penaeus monodon Tôm sú - Penaeus monodon Tôm sú - Penaeus monodon Tôm bạc - Fenneropenaeus merguiensis Tôm bạc - Fenneropenaeus merguiensis Tôm sú - Penaeus monodon Tôm sú - Penaeus monodon Tôm bạc - Fenneropenaeus merguiensis 108 112 113 C3 115 116 117 118 To1 TB-DD310 S-DD310 TB-DD410 Tôm bạc - Fenneropenaeus merguiensis Penaeus monodon Tôm bạc - Fenneropenaeus merguiensis Cua biển - Scylla paramamosain Tôm sú - Penaeus monodon Tôm sú - Penaeus monodon Tôm sú - Penaeus monodon Tôm sú - Penaeus monodon Tôm sú - Penaeus monodon S-DD4a10 S-DD4b10 S-DD4c10 S-DD4d10 S-DD4e10 Loại mẫu Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Phụ lục Số liệu đo OD mẫu phân tích Bảng Kết OD mẫu phân tích ký kiệu phân tích TT-HD105 S-HD1a05 S-HD1b05 TT-DH108 S-DH108 S-DH208 TT-DH308 S-DH308 TT-HD207 S-HD2a07 S-HD2b07 TT-HD3a07 TT-HD3b07 TT-HD3c07 S-HD3a07 S-HD3b07 S-HD3c07 S-HD3d07 TT-HD407 S-HD4a07 S-HD4b07 S-HD4c07 S-HD4d07 TB-DD1a10 TB-DD1b10 S-DD1a10 S-DD1b10 TB-DD210 TB-DD310 S-DD310 TB-DD410 S-DD4a10 S-DD4b10 S-DD4c10 S-DD4d10 S-DD4e10 260 (nm) 2,3593 2,1242 1,9367 2,5630 1,8630 1,0155 1,3477 2,3593 2,2245 1,4520 2,4456 2,4465 2,1241 2,0015 1,7469 1,9969 2,1344 1,4466 1,8679 1,2122 2,6477 2,1343 2,9961 2,5242 2,4325 2,4556 2,8578 2,9961 2,6588 1,8814 2,8649 2,1314 1,6097 1,5847 1,0668 1,9936 Chuyên nghành Công nghệ Sinh học 280 (nm) 2,1448 1,7270 1,7554 2,3113 1,4066 0,6723 0,9394 2,0990 1,6519 1,1394 2,2188 2,1928 1,7895 1,6663 1,3350 1,5078 1,7077 1,0113 1,8657 0,8785 2,1602 1,5891 2,6801 2,2812 1,9878 2,2257 2,5827 2,7058 2,0124 1,8652 2,5908 1,7312 1,2859 1,4898 1,1047 1,3986 260 (nm)/280 (nm) 1,1000 1,2300 1,1033 1,1089 1,3245 1,5104 1,4347 1,1240 1,3466 1,2743 1,1022 1,1157 1,1870 1,2012 1,3085 1,3244 1,2499 1,4304 1,0012 1,3799 1,2257 1,3431 1,1179 1,1065 1,2237 1,1033 1,1065 1,1073 1,3212 1,0087 1,1058 1,2312 1,2518 1,0637 0,9657 1,4254 280 (nm)/260 (nm) 0,4662 0,5790 0,5697 0,4327 0,7110 1,4873 1,0646 0,4764 0,6053 0,8776 0,4507 0,4560 0,5588 0,6001 0,7490 0,6632 0,5856 0,9888 0,5360 1,1383 0,4629 0,6293 0,3731 0,4384 0,5031 0,4493 0,3872 0,3696 0,4969 0,5361 0,3860 0,5776 0,7777 0,6712 0,9052 0,7150 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Phụ lục Kết hình gel mẫu thí nghiệm 500 bp Hình Kết PCR với ORF75 mẫu WSSV tôm sú 500 bp 400 bp 400 bp Hình Kết PCR với ORF75 mẫu WSSV tôm bạc tép trấu 500 bp 500 bp Hình Kết PCR với ORF94 mẫu WSSV tôm sú Chuyên nghành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT 500 bp 500 bp Hình Kết PCR với ORF94 mẫu WSSV tôm bạc tép trấu 500 bp Hình 10a Kết PCR với ORF125 mẫu WSSV tơm sú 600 bp 500 bp Hình 10b Kết PCR với ORF125 mẫu WSSV tôm sú Chuyên nghành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học ... .6 2.3.2 Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) .6 2.4 Các nghiên cứu liên quan vấn đề phát virus gây bệnh đốm trắng ký chủ 12 2.5 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)? ??……………………………... ĐHCT khác để từ hiểu mối liên hệ di truyền chúng hầu làm tiền đề định hướng cho phương pháp ngăn ngừa lan truyền virus Vì đề tài “ đa dạng di truyền virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus) tôm... tái nhiễm WSSV vụ nuôi, biện pháp để hạn chế ảnh hưởng WSSV lên đối tượng ni tơm sú 2.5 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Kỹ thuật PCR kỹ thuật in vitro để tổng hợp ADN dựa khuôn trình tự