Ứng Dụng Kỹ Thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Phát Hiện Nhanh Thực Phẩm Chứa GMO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) PHÁT HIỆN NHANH THỰC PHẨM CHỨA GMO CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TRẦN THỊ XUÂN MAI PHAN HỮU THÔNG MSSV: 3064418 LỚP: CNSH K32 Cần Thơ, Tháng 04/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) Trần Thị Xuân Mai Phan Hữu Thông DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ biết ơn sâu sắc đến cô Trần Thị Xuân Mai tận tình hướng dẫn, truyền thụ tri thức khoa học bổ ích, tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi làm tốt luận văn tốt nghiệp Xin cảm ơn Nguyễn Thị Liên Nguyễn Thị Pha phịng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử Thực Vật - Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực đề tài Xin cảm ơn tất Thầy, Cô Viện NC&PT Công nghệ Sinh học tận tình giảng dạy cung cấp kiến thức quý báu cho năm học trường Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bạn Hà Minh Luân, Trương Quỳnh Trang, Trần Thị Hoàng Yến, Lý Tiến, Nguyễn Thị Hoàng Nhung, Danh Xuyên, Nguyễn Thị Hồng Ngọc hết lịng giúp đỡ, chia sẻ khó khăn q trình hồn thành luận văn Xin cảm ơn tất bạn lớp Công Nghệ Sinh Học K32 động viên giúp đỡ suốt trình học tập thực đề tài Phan Hữu Thông Cần Thơ, ngày 08 tháng 05 năm 2010 TĨM LƯỢC Q trình ly trích DNA nhiều loại thực phẩm cịn gặp nhiều khó khăn có chứa nhiều tạp chất polysaccharid, protein, lipid… làm ảnh hưởng đến chất lượng số lượng DNA, điều gây trở ngại lớn trongquá trình thực phản ứng PCR Vì vậy, qui trình phát thực phẩm chứa GMO kỹ thuật PCR cần phải khắc phục khó khăn Trong nghiên cứu chúng tơi, qui trình phát thực phẩm chứa GMO xác định Có hai qui trình trích DNA sử dụng tùy theo loại nguyên liệu Việc xử lý mẫu trước trích DNA tùy theo dạng nguyên liệu thành công Cặp mồi chuyên biệt sử dụng phản ứng PCR thiết kế dựa trình tự 35S promoter có nguồn gốc từ virus Cauliflower mosaic Sản phẩm PCR 200 bp 528 bp khuếch đại từ vùng 35S promoter Có tất 16 mẫu thực phẩm sử dụng để phát GMO, có 10 mẫu xác nhận có chứa GMO bao gồm: Bắp hạt dùng thức ăn gia súc, đậu nành xay thô dùng cho gia súc, bắp xay thô dùng cho gia súc, thức ăn gia súc hỗn hợp, thức ăn gia súc đậm đặc, bắp hạt cấp đông, bột sữa dinh dưỡng bắp, đậu nành hạt (chợ Bình Thủy, Cần Thơ), đậu nành hạt (chợ Xuân Khánh, cần Thơ), bột sữa dinh dưỡng đậu nành Từ khóa: PCR, 35S promoter, GMO… i MỤC LỤC KÝ TÊN HỘI ĐỒNG CẢM TẠ TÓM LƯỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi TỪ VIẾT TẮT .vii CHƯƠNG 1.GIỚI THIỆU CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Hiện trạng trồng chuyển gen 2.1 Hiện trạng trồng chuyển gen giới (từ năm 1996 – 2008) 2.1.2 Hiện trạng trồng chuyển gen nước 2.2 Phương pháp chuyển gen (biến nạp gen) vào thực vật 11 2.2.1 Điều kiện cho chuyển gen thực vật .11 2.2.2 Các phương pháp biến nạp gen 12 2.3 Phương pháp phân tích thực vật mang gen biến nạp 15 2.3.1 Phương pháp phân tích tính kháng thuốc 16 2.3.2 Phương pháp phân tích hố tế bào .16 2.3.3 Phương pháp phân tích kỹ thuật phân tích di truyền 17 2.3.4 Phương pháp phân tích chức sinh học gen chuyển 19 2.4 Các đề tài nghiên cứu có liên quan .20 2.4.1 Các đề tài nghiên cứu nước 20 2.4.2 Các đề tài nghiên cứu nước 20 2.5 Sơ lược kỹ thuật PCR 21 2.5.1 Khái niệm chung PCR .21 2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 22 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 ii 3.1 Thời gian địa điểm 26 3.1.1 Thời gian .26 3.1.2.Địa điểm .26 3.2 Phương tiện 26 3.2.1 Thiết bị 26 3.2.2 Hóa chất 26 3.2.3 Vật liệu 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu .27 3.3.1 Thu thập mẫu 27 3.3.2 Chuẩn bị mẫu 27 3.3.3 Trích DNA .27 3.3.4 Kiểm tra sản phẩm DNA .29 3.3.5 Thiết kế đoạn mồi – Thực phản ứng PCR 30 3.3.6 Kiểm tra sản phẩm PCR .31 3.4 Bố trí thí nghiệm 32 3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát qui trình ly trích DNA 32 3.4.2 Thí nghiệm 2: Thiết kế mồi kiểm tra tính đặc hiệu mồi 32 3.4.3 Thí nghiệm 3: Ứng dụng cặp mồi để phát thực phẩm có chứa GMO 32 3.4.4 Cải thiện điều kiện PCR .33 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát qui trình ly trích DNA 34 4.2 Thí nghiệm 2: Thiết kế mồi kiểm tra tính đặc hiệu mồi .36 4.3 Thí nghiệm 3: Ứng dụng cặp mồi để phát thực phẩm có chứa GMO 37 4.4 Thí nghiệm 4: Cải thiện điều kiện PCR .39 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Đề nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 Phụ lục Thành phần nồng độ hoá chất sử dụng nghiên cứu iii Phụ lục Môi trường nuôi cấy Murashige & Skoog (1962) Phụ lục Các hình ảnh số thiết bị chủ yếu phục vụ cho đề tài iv DANH SÁCH BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1 Diện tích trồng chuyển gen tồn cầu năm 2008 phân theo nước (triệu ha) Bảng 1.Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR trình tự 35S promoter (25 µl) .31 Bảng Tổng số mẫu DNA ly trích .34 Bảng Kết đo độ hấp phụ tử ngoại mẫu DNA ly trích 36 Bảng Kết kiểm tra GMO PCR mẫu DNA ly trích .38 v DANH SÁCH HÌNH Tên hình Trang Hình Bản đồ phân bố nước trồng chuyển gen & nước có diện tích trồng lớn năm 2008 Hình 2 Thiết bị xung điện Gen Pulser Hãng BioRad (a) sơ đồ nguyên lý hoạt động (b) 13 Hình Sơ đồ nguyên lý hoạt động súng bắn gen 14 Hình Tạo thực vật chuyển gen phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium 15 Hình Các giai đoạn phản ứng PCR 22 Hình Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIA1380 27 Hình Kết điện di sản phẩm PCR thử tính đặc hiệu cặp mồi 37 Hình Điện di gel Agarose 1,5% sản phẩm PCR với cặp mồi Sense - Antiense .38 Hình Kết cải thiện điều kiện PCR 40 Hình 4.4 Máy PCR Hình 4.5 Máy ủ lắc Hình 4.6 Máy chụp hình gel BioRad UV 2000 Hình 4.7 Bồn điện di vi TỪ VIẾT TẮT A rhizogenes : Agrobacterium rhizogenes A tumefaciens : Agrobacterium tumefaciens ABA : Abscisic acid Bar : Gen kháng thuốc diệt cỏ BiH2O : Nước cất hai lần bp : Cặp bazơ Bt : Bacillus thuringiensis BSA : Bovine serum albumin CPR : Chlorophenol Red Cry : Gen kiểm soát sâu đục thân, sâu CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide DEAE-dextran : Diethylaminoethyl-dextran dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate DNA : Deoxyribonucleic acid DOPE : L-dioleoyl phosphatidylethanolamine E.coli : Escherichia coli EDTA : Ethylenediamine-tetraacetic acid GM : Genetically modified GMO : Genetically modified organism GMP : Genetically modified plant LB : Left border NAA : α-napthalen acetic acid OD : Optical density PCR : Polymerase chain reaction PEG : Polyethylene glycol PGI : Phosphogluco isomerase vii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT Sử dụng cặp mồi thiết kế để thực phản ứng PCR với mẫu DNA thu thập xem có phải thực phẩm có chứa GMO hay khơng * Thí nghiệm tiến hành sau: - Thực phản ứng PCR với mẫu DNA ly trích thí nghiệm 1, sử dụng cặp mồi thiết kế thử tính đặc hiệu thí nghiệm - Kiểm tra sản phẩm DNA gel Agarose 1,5% có bổ sung EtBr, điện di với buffer TBE 100V 80 phút - Chụp hình gel máy chụp hình gel BIO-RAD UV 2000 3.4.4 Cải thiện điều kiện PCR * Mục đích: Do sản phẩm PCR cịn xuất nhiều band phụ nên thí nghiệm nhằm mục đích làm giảm bớt số band phụ * Thí nghiệm tiến hành sau: - Thực phản ứng PCR với chu kỳ nhiệt sau: 950: 4’ 950: 30” 650: 30” 35 chu kỳ 720: 1’ 720: 10’ 100: ∞ - Phân tích kết dựa vào sản phẩm PCR Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 33 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát qui trình ly trích DNA Tổng số mẫu dùng để ly trích DNA 16 mẫu , phân thành dạng: Hạt non, hạt giống, thực phẩm chế biến (Bảng 4.1) Sử dụng qui trình ly trích DNA Bảng Tổng số mẫu DNA ly trích STT Mẫu Qui trình ly trích Địa điểm thu mẫu Bắp trái Qui trình Ninh Kiều- Cần Thơ Bắp thức ăn gia súc (hạt) Qui trình Ninh Kiều- Cần Thơ Đậu nành xay thô Qui trình Ninh Kiều- Cần Thơ Sữa bột đậu nành Qui trình Ninh Kiều- Cần Thơ Bắp xay thơ Qui trình Ninh Kiều- Cần Thơ Sữa bột bắp Qui trình Ninh Kiều- Cần Thơ Bột bắp thức ăn gia súc Qui trình Ơ Mơn – Cần Thơ Thức ăn gia súc hỗn hợp Qui trình Ơ Mơn – Cần Thơ Thức ăn gia súc đậm đặc Qui trình Ơ Mơn – Cần Thơ 10 Bắp Mỹ Qui trình Ninh Kiều- Cần Thơ 11 Bắp hộp crystal Qui trình Ninh Kiều- Cần Thơ 12 Bắp hạt cấp đơng Qui trình Ninh Kiều- Cần Thơ 13 Bột bắp chợ sinh viên Qui trình Ninh Kiều- Cần Thơ 14 Bột bắp chợ Cần Thơ Qui trình Ninh Kiều- Cần Thơ 15 Đậu nành hạt Qui trình Ninh Kiều- Cần Thơ 16 Đậu nành hạt Qui trình Bình Thủy- Cần Thơ Thí nghiệm nhằm kiểm tra chất lượng nồng độ DNA mẫu thực phẩm thu thập Kết từ bảng 4.2 cho thấy phương pháp trích DNA theo qui trình (mẫu 1, 2, 15 16) cho kết tốt chất lượng lẫn số lượng Trong DNA trích theo qui trình 12 mẫu trích có mẫu (7, 9, 10 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 34 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT 12) đạt chất lượng lẫn số lượng, mẫu (3, 4, 6) đạt chất lượng số lượng thấp Theo Viljoen et al., 2005, Lin et al., 2000 sử dụng qui trình trích DNA Lipp et al., 1999 để phát sản phẩm chế biến dùng cho người có nguồn gốc từ đậu nành bắp chứa GMO Qui trình có ưu điểm giai đoạn loại bỏ tạp chất chlorofrom CTAB làm hai lần, nhờ mà mẫu DNA từ thực phẩm đạt chất lượng nồng độ DNA bị giảm Còn tác giả Cazzola Maria Lauura Silvana Petruccelli (2006) sử dụng qui trình trích DNA từ Dellaporta ctv., (1983) để phát GMO diện sản phẩm chế biến có nguồn gốc từ đậu nành bắp Trong thí nghiệm chúng tơi, mẫu trích theo qui trình (qui trình chuẩn Rogers and Bendich, 1988) mẫu hạt cịn ngun vẹn phơi cho nẩy mầm để thu lấy trích DNA, nguồn trích DNA tươi nên thao tác xử lý mẫu dễ dàng lượng DNA cao Đối với mẫu trích theo qui trình (Lipp et al., 1999) thực phẩm qua chế biến nghiền thô, nghiền mịn, xử lý nhiệt (bắp hộp), pha trộn với tinh bột (bột bắp dùng chế biến thức ăn người) nhiều làm biến tính DNA, giảm nồng độ DNA (vì loại hạt, thành phần chủ yếu protein lipid, DNA chiếm nhiều phơi) Cũng mà phần lớn nồng độ DNA thường thấp mẫu trích DNA từ hạt nghiền thơ hay nghiền mịn, mẫu trích DNA từ phơi thường có nồng độ DNA cao Chun ngành Cơng nghệ Sinh học 35 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT Bảng Kết đo độ hấp phụ tử ngoại mẫu DNA ly trích Mẫu Tên Mẫu 260 nm 260nm/280nm Nồng độ DNA ng/μl Bắp trái 1,5841 1,8326 792,05 Bắp thức ăn gia súc (hạt) 3,0576 1,9490 1528,80 Đậu nành xay thô 0,158 1,.8973 79,00 Sữa bột đậu nành 0,1901 2,0513 95,05 Bắp xay thô 0,0128 2,1640 6,40 Sữa bột bắp 0,0118 2,0255 5,90 Bột bắp thức ăn gia súc 1,5525 1,9958 776,00 Thức ăn gia súc hỗn hợp 2,9898 1,3445 1494,00 Thức ăn gia súc đậm đặc 1,6453 1,9158 822,00 10 Bắp Mỹ 1,7090 1,8602 854,00 11 Bắp hộp crystal 0,2565 1,6297 128,00 12 Bắp hạt cấp đông 3,1940 1,7855 1597,00 13 Bột bắp chợ sinh viên 0,0988 1,4694 49,40 14 Bột bắp chợ Cần Thơ 0,0975 1,4438 48,75 15 Đậu nành hạt 3,0576 1,857 1528,80 16 Đậu nành hạt 0,8460 1,9080 423,00 4.2 Thí nghiệm 2: Thiết kế mồi kiểm tra tính đặc hiệu mồi Trình tự nucleotide 35S promoter 816 bp 781 bp sẵn có từ GenBank (mã số accession number EF451822 35S promoter 816 bp AF234301 35S promoter 781 bp) Các đoạn mồi thiết kế với phần mềm DNAMAN dựa vào vùng đồng hình hai trình tự Trình tự mồi là: Primer 35S Sense: 5’ GCG AAG GAT AGT GGG ATT GTG C 3’ Primer 35S Antisense: 5’ GCA CCT ACA AAT GCC ATC A 3’ Sử dụng cặp mồi này, sản phẩm PCR sản xuất band 200 bp (khuếch đại từ vị trí vùng 44 bp→244 bp) 35S promoter 816 bp Sản phẩm PCR sản Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 36 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT xuất band 200 bp (khuếch đại từ vị trí vùng 84 bp→284 bp) band 528 bp (khuếch đại từ vị trí vùng 84 bp → 612 bp) 35S promoter 781 bp Hầu hết trồng chuyển gen phát triển quảng cáo thị trường sử dụng 35S promoter từ 35S RNA virus Cauliflower mosaic (Steinbrecher R A, 2002) Tuy nhiên khơng phải có trình tự 35S promoter nhất, thí nghiệm chúng tơi, chọn hai loại 35S promoter thường sử dụng nghiên cứu để thiết kế mồi Nếu chuyển gen sử dụng 35S promoter 781bp từ vector pCAMBIA thấy xuất 02 band 200 bp 528 bp Nếu chuyển gen xuất band 200 bp sử dụng 35S promoter 816 bp Band phụ 500bp 528bp Band 200bp Hình Kết điện di sản phẩm PCR thử tính đặc hiệu cặp mồi thiết kế (Giếng 1: thang chuẩn 100bp; giếng 2: bắp ăn không chứa GMO, giếng 3: bắp hạt dùng chăn nuôi, giếng: 4-5: đối chứng dương pCAMBIA1380; giếng 6: Nước) Kết thí nghiệm cho thấy (Hình 4.1), cặp mồi khuếch đại trình tự 200 bp 528 bp 35S promoter chứa vector pCAMBIA1380, mẫu bắp không chứa GMO không khuếch đại band nào, mẫu bắp hột mua cửa hàng thức ăn gia súc có xuất band 200 bp Kết cho thấy cặp mồi chuyên biệt 4.3 Thí nghiệm 3: Ứng dụng cặp mồi để phát thực phẩm có chứa GMO Từ 16 mẫu DNA ly trích tiến hành thực phản ứng PCR với cặp mồi thiết kế thí nghiệm 2, thành phần phản ứng PCR bảng 3.1 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 37 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 M 21 p1301 Trường ĐHCT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 3 p1301 10 11 12 13 14 15 16 21 p1301 Hình Điện di gel Agarose 1,5% sản phẩm PCR với cặp mồi 35S Sense-Antisense Giếng 1, 9: thang chuẩn 100bp; giếng 2: bắp dùng chăn nuôi; giếng 3: đậu nành xay thô dùng cho gia súc; giếng 4: sữa bột đậu nành; giếng 5: sữa bột bắp; giếng 6: bột bắp xay thô dùng cho gia súc; giếng 7, 21 22: đối chứng dương pCAMBIA1380; giếng 23: mẫu nước; giếng 10: bắp trái; giếng 11: bột bắp thức ăn gia súc; giếng 12: thức ăn gia súc hỗn hợp; giếng 13: thức ăn gia súc đậm đặc; giếng 14: bắp Mỹ ngọt; giếng 15: bắp hộp crystal; giếng 16: bắp hạt cấp đông; giếng 17: bột bắp chợ sinh viên; giếng 18: bột bắp Tân Ngọc Phượng; giếng 19: đậu nành hạt; giếng 20: đậu nành hạt Bảng Kết kiểm tra GMO PCR mẫu DNA ly trích STT Giếng Mẫu Có GMO Khơng có GMO Bắp thức ăn gia súc (hạt) + - Đậu nành xay thô + - Sữa bột đậu nành + - Sữa bột bắp + - Bắp xay thô + - 10 Bắp trái - + 11 Bột bắp thức ăn gia súc * * 12 Thức ăn gia súc hỗn hợp + - 13 Thức ăn gia súc đậm đặc + - 14 Bắp Mỹ - + 15 Bắp hộp crystal - + 16 Bắp hạt cấp đông + - 17 Bột bắp chợ sinh viên * * 18 Bột bắp chợ Cần Thơ * * 19 Đậu nành hạt + - 20 Đậu nành hạt + - Chú thích: + Sản phẩm PCR có khuếch đại; - Sản phẩm PCR khơng khuếch đại; *: nghi ngờ có GMO Kết từ hình 4.2 bảng 4.3 cho thấy tổng số 16 mẫu thu được, có 10 mẫu chứa GMO, mẫu khơng chứa GMO mẫu nghi ngờ có chứa GMO Đa số mẫu có GMO thức ăn cho gia súc, thực phẩm cho người Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 38 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT có mẫu có phối trộn thành phần đậu nành hay bắp thêm vào không ghi rõ xuất xứ (sữa bột đậu nành mẫu số 4, sữa bột bắp mẫu số 6) có chứa GMO Trái bắp Mỹ thường thấy bày bán đường phố bắp hộp thường bán siêu thị xác nhận không chứa GMO Tuy nhiên có mẫu bắp đơng lạnh dùng cho người phát thực phẩm GM Ba mẫu có đánh dấu (*), thí nghiệm không thấy xuất band 200 bp hay 528 bp Tuy nhiên chúng tơi cịn nghi ngờ mẫu số bột bắp dùng thức ăn gia súc, hai mẫu lại bột bắp dùng chế biến thức ăn cho người có hàm lượng DNA thấp Do sản phẩm PCR xuất nhiều band phụ nên cần phải tiến hành cải thiện điều kiện PCR 4.4 Thí nghiệm 4: Cải thiện điều kiện PCR Thí nghiệm nhằm mục đích giảm bớt xuất band phụ vector pCAMBIA1380 xem hình 4.1 Chu kỳ nhiệt hiệu chỉnh Nhiệt độ 95 Thời gian 35 chu kỳ 95 720 4’:00 30” 720 650 1’:00 10’:00 100 30” ∞ Sử dụng chu kỳ nhiệt hiệu chỉnh thực phản ứng PCR với thành phần không đổi, sử dụng cặp mồi 35S ( bảng 3.1- Chương 3) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 39 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT 528bp 200bp 500bp Hình Kết cải thiện điều kiện PCR Giếng 1: thang chuẩn 100bp; giếng 2: DNA lúa chuyển gen, giếng 3: : DNA lúa không chuyển gen; giếng 4: DNA bắp ăn không chứa GMO; giếng 5: DNA bắp dùng chăn nuôi; giếng 6-7: đối chứng dương pCAMBIA1380; giếng 8: nước Phân tích kết từ hình 4.3 cho thấy sản phẩm PCR cịn hai band 200 bp 528 bp mẫu đối chứng dương (vector pCAMBIA1380), không xuất band phụ Như với chu kỳ nhiệt cho sản phẩm DNA rõ nét hơn, điều giúp dễ phân tích kết so với sản phẩm PCR xuất nhiều band phụ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 40 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Những qui trình ly trích DNA thu nhận sản phẩm DNA chất lượng tốt với hiệu suất cao từ mẫu thực phẩm Có thể sử sụng qui trình Rogers Bendich (1988) để trích DNA mẫu thực phẩm dạng hạt cịn cho nẩy mầm, mẫu thực phẩm qua chế biến dùng qui trình Lipp et al.(1999) Cặp mồi thiết kết chuyên biệt dùng để phát GMO qua kỹ thuật PCR Đối với thực phẩm GM có chứa 35S promoter 816 bp khuếch đại đoạn 200 bp Đối với thực phẩm GM có chứa 35S promoter 781 bp khuếch đại 02 band, band 200 bp band 528 bp Trong 16 mẫu thực phẩm sử dụng để kiểm tra GMO, có 10 mẫu chứa GMO Để cải thiện sản phẩm PCR tránh xuất nhiều band phụ gây khó khăn phân tích, phản ứng PCR thực với thành phần sau: 50100ng DNA lá, 2,5µl dung dịch đệm PCR 10X (có chứa 3,0 mM MgCl2), 1μl dNTP có 200 µM loại, 1μl mồi có nồng độ 2µM, 1đơn vị Taq DNA polymerase Tổng thể tích phản ứng 25μl Phản ứng khuếch đại tiến hành 95oC phút, sau lặp lại 35 chu kỳ với bước sau: Biến tính 95oC 30 giây, bắt cặp mồi vào khuôn 65oC 30 giây, kéo dài 72oC phút Cuối phản ứng trì 72oC 10 phút 5.2 Đề nghị Tiếp tục cải thiện qui trình ly trích DNA từ loại thực phẩm có chế biến, pha trộn làm giảm hàm lượng DNA (các loại thức ăn dạng bột có phối trộn thêm nhiều thành phần khác) Ứng dụng qui trình cải thiện sản phẩm PCR để phát thêm đối tượng khác như: Cà chua, khoai tây, lúa, dưa leo loại rau cải có suất cao chống chịu sâu bệnh sản phẩm chế biến có chứa thành phần đậu nành, bắp, khoai tây… Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 41 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Minh Trí Bùi Cách Tuyến 2003 Kết ban đầu việc sử dụng kỹ thuật PCR nhằm đánh giá trạng sản phẩm bắp chuyển gen Việt Nam Tạp chí khoa học kỹ thuật Nơng Lâm nghiệp số 1, tr:6-11 Bùi Minh Trí Bùi Cách Tuyến 2003 Xây dựng qui trình chẩn đốn bắp có chuyển gen kháng sâu (CryIA [b]) gen tăng cường chuyển hóa đường (Invertase) kỹ thuật PCR Tạp chí khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp số 1, tr:1-5 Clive James 2008.Hiện trạng trồng chuyển gen/CNSH năm 2008 Báo cáo tóm tắt Báo cáo số 39 ISAAA Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2003 Sinh học phân tử NXB Giáo dục, trang 200-204 Khuất Hữu Thanh 2006 Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, trang 161 – 163 Lê Trần Bình 2008 Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, trang 1- 50 Quyền Đình Thi, 2005 Những kỹ thuật phân tích DNA NXB Khoa học kỹ thuật Tiếng Anh Alejandro C Tozzini 2000 Semi-quantitative detection of genetically modified grains based on CaMV 35S promoter amplification EJB Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458 Vol.3,No.2 Battraw MJ, T.C.Hall.Histochemical analysis of CaMV 35S promoter-betaglucuronidase gene expression in transgenic rice plants Plant Mol Biol 1990 Oct;15(4):527-38 Baumann, A., Krah-Jentgens, I., Muller-Holtkamp, F., Seidel, R., Kecskemethy, N., Casal, J., Ferrus, A., and Pongs, (1987) EMBO J 6,3419-3429 Benfey P.N and N.H Chua 1989 The Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter: Combinatorial Regulation of Transcription in Plants Science 16 November 1990: Vol 250 no 4983, pp 959 – 966 DOI: 10.1126/science.250.4983.959 Bevan, M., Barnes, W M., and Chilton, M D 1983 Structure and transcription of the nopaline synthase gene region of T-DNA Nucleic Acids Res 11:369-385 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 42 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT Boynton J.E., N.W Gillham., E.H Harris., J.P Hosler., A.M Johnson, A.R Jones, B.L Randolph-Anderson, D Robertson, T.M Klein, K.B Shark and Sanford J.C 1988 Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles Science 240:1534–1538 Cazzola Maria Laura & Petruccelli Silvana Semiquantitative analysis of genetically modified maize and soybean in food Electronic Journal of Biotechnology, Vol 9, No 3s1, 2006, pp 320-325 Cheng R.H., N.H Olson, T.S.Baker Cauliflower mosaic virus: a 420 subunit (T = 7), multilayer structure Virology 1992 Feb;186(2):655-68 Department of Biological Sciences, Purdue University, West Lafayette, Indiana 47907 Comai, L., Larson-Kelly, N., Kiser, Jones, A., C., Stalker, D.M., Moran, P., Kiehne, K.,Koning, A 1989 Genetic engineering of plants for herbicide resistance Expression of a RuBP carboxylase small subunit-EPSP synthase chimeric gene, chloroplast transport of the hybrid protein, and tolerance phenotype of transgenic plants Vortr Pflaenzenzuechtg 16:441-454 David L., L.M Maurizio, Theo R Allnutt and P Wayne Detection of genetically modified organisms (GMOs) using isothermal amplification of target DNA sequences BMC Biotechnology 2009, 9:7,doi:10.1186/1472-6750-9-7 Dean, C et al., Nucleic Acids Research 1986 Vol 14, No 5, p 2229 Dekeyser, R., Claes, B., Marichal, M., Van Montagu, M., and Caplan, A.1989 Evaluation of selectable markers for rice transformation Plant Physiol 90, 217-223 Diana L Brandner 1990 Gentically Modified Foofs,Chapter PCR-Based Detection of Genetically Modified Foods Gallie D.R 1991 The cap and poly(A) tail function synergistically to regulate mRNA translational efficiency.Genes Dev 1991 5: 2108-2116 Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., and Kumashiro, T 1994 Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA Plant J 6:271-282 Horsch R B and H J Klee.1986 Rapid assay of foreign gene expression in leaf discs transformed by Agrobacterium tumefaciens: Role of T-DNA borders in the transfer process (nopaline/plants/gene transfer) Proc Natl Acad Sci USA Vol 83, pp 4428-4432 Hsu-Yang L.,L C Chiueh and Y.C Daniel Shih 2000 Detection of Genetically Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 43 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT Modified Soybeans and Maize by the Polymerase Chain Reaction Method Journal of Food and Drugs analysis Vol.8, No.3, p 200-207 Hsu-Yang L.,L C Chiueh and Y.C Daniel Shih 2001 Detection of Genetically Modified Soybeans by PCR Method and Immunoassay Kits National Laboratories of Foods and Drugs, Department of Health, Executive Yuan,161-2, Kuen Yang Street, Nankang 115, Taipei, Taiwan, R O C Janet K Jansson, M Soren, R Martin 2005 Test methods for monitoring genetically modified microorganisms (GMMs) in nature NORDTEST project number: 1473-99 Approved 2000-05 Jedidah W D., K Michael and M Mercy 2006 Detection of Bacillus thuringiensis(Bt) genes in transgenic maize by the PCR method and FTA paper technology Biotechnology Centre, Kenya Agricultural Research Institute, P.O box 58711, Nairobi Kenya Jefferson, R A 1987 Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system Plant Mol Biol Rep 5:387–405 Joshi CP 1987 An inspection of the domain between putative TATA box and translation start site in 79 plant genes Nucleic Acids Res 15: 6643-6653 Keil M., J Sanchez-Serrano, J Schell, L Willmitzer Localization of Elements Important for the Wound-Inducible Expression of a Chimeric Potato Proteinase Inhibitor IICAT Gene in Transgenic Tobacco Plants Plant Cell 1990 Jan;2(1):61-70 Institut fur Genbiologische Forschung Berlin GmbH, Ihnestrasse 63, D-1000 Berlin 33, Federal Republic of Germany Komari T., T Hiei, Y Saito, T Kumashiro 1996 Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium mefaciens and segregation of transformants free from selection markers Plant J10, pp 165-174 Mullis, K B and F.A Faloona, 1987 Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalysed chain reaction Methods in Enzymology 155: 335-350 Kuhlemeier C., M Cuozzo, P Green Localization and conditional redundancy of regulatory elemets in rbcS3-3A, a pea gene encoding the small subumit of ribulosebiphosphate carboxylase// Proc Nat Sci USA.-1988-85 N 13.- P 4662 – 4666 Lipp, M., P Brodmann, Pietsch, K., J Pauwels., & E.Anklam 1999 IUPAC collaborative trial study of a method to detect genetically modified soybeans and maize in dried powder Journal of AOAC International, 82, 923–928 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 44 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT Liu, C.-N., Li, X , and Gelvin, S.B (1992) Multiple copies of virG enhance the transient transformation of celery, carrot, and rice tissues by Agrobacterium tumefaciens Plant MOI Biol 20, 1071-1087 Rogers, S O and Bendich, 1988 Extraction of DNA from plant tissues Plant Mol Biol Manual A6: 1-10 Schmid, J., Doerner, P.W., Clouse, S.D., Dixon, R.A., and Lamb, C.J (1 990) Developmental and environmental regulation of a bean chalcone synthase promoter in transgenic tobacco Plant Cell 2, 619-631 Skriver K., J Mundy (1990) Gene expression in response to abscisic acid and osmotic stress Plant Cell 2: 503-512 Viljoen S , A.G Mark, N Michael, H Viljoen A macroscopic kinetic model for DNA polymerase elongation and high-fidelity nucleotide selection Computational Biology and Chemistry, v.29 n.2, p.101-110, April, 2005 Trang Web http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Nghi%c3%aan_c%e1%bb%a9u_c%c3% a2y_tr%e1%bb%93ng_bi%e1%ba%bfn_%c4%91%e1%bb%95i_gene:_B%e1%bb%a 9c_tranh_Vi%e1%bb%87t (27-04-2010) http://www.vfej.vn/vn/chi_tiet/18407/cong_nghe_sinh_hoc _huong_phat_trien _cho_tuong_lai (27-04-2010) http://www.khoahoc.com.vn/print/8454.aspx http://www2.hcmuaf.edu.vn/contents.php?ids=2265&ur=dothiloi (07-04-2010) http://vietsciences.free.fr/thuctap_khoahoc/thanhtuukhoahoc/thucphamchuyenge n.htm (20-04-2010) http://www.cambia.org/daisy/bioforge_legacy/ (27-02-2010) http:// artsci.wustl.edu/~anthro/blurb/B der.html (18-03-2010) http://www.ptf.okstate.edu/pulser.html (18-03-2010) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 45 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần nồng độ hoá chất sử dụng nghiên cứu - Dung dịch Extraction buffer (EB): 100 mM Tris–HCl (pH 8.0), 0.05 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.5 M NaCl, 1% β-mercaptoethanol - Dung dịch TE 0.1: 10 mM Tris-HCl (pH 8), 0.1 mM EDTA (pH 8) - Dung dịch CTAB: 0.2 M Tris-HCl (pH 7.5), M NaCl, 0.05 M EDTA, 2% (w/v) CTAB CTAB buffer I: CTAB 20g/l, 1.4 M NaCl, 100mM/l Tris HCl, 20 mM/l EDTA) Ddung dịch CTAB II: 5g/l CTAB, 0.04 M NaCl Phụ lục Môi trường nuôi cấy Murashige & Skoog (1962) -Đường 30g/l -Agar g/l - pH = 5.7 Khống đa – vi lượng • • Khống đa lượng (mg/l) NH4NO3 1650,00 KNO3 1900,00 KH2PO4 170,00 MgSO4.7H2O 370,00 CaCl2 2H2O 440,00 Khoáng vi lượng (mg/l) MnSO4 H2O 23,30 ZnSO4 H2O 8,60 H3BO3 6,20 KI 0,83 Na2MoO4 2H2O 0,25 CuSO4 H2O 0,025 CoCl2 H2O 0,025 Na2EDTA 37,30 FeSO4.7H2O 27,80 Vitamins (mg/l) Thiamin (B1) Nicotinic acid (B3) Pyridoxine HCl (B6) Myo-inositol 100 Phụ lục Các hình ảnh số thiết bị chủ yếu phục vụ cho đề tài Hình 7- Máy PCR Hình 7- Máy chụp hình gel Biorad UV 2000 Hình 7- Máy ủ lắc Hình 7- Bồn điện di ... lớn trongquá trình thực phản ứng PCR Vì vậy, qui trình phát thực phẩm chứa GMO kỹ thuật PCR cần phải khắc phục khó khăn Trong nghiên cứu chúng tơi, qui trình phát thực phẩm chứa GMO xác định Có... sản phẩm biến đổi gen thị trường Do đề tài ? ?Ứng dụng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) phát nhanh thực phẩm chứa GMO? ?? cấp thiết cần tiến hành Mục tiêu đề tài: Tìm qui trình thích hợp phát. .. từ bắp hay đậu nành chuyển gen làm đối chứng dương, thực phản ứng PCR với cặp mồi thiết kế 3.4.3 Thí nghiệm 3: Ứng dụng cặp mồi để phát thực phẩm có chứa GMO * Mục đích: Chun ngành Cơng nghệ Sinh