Trong những năm gần đây, dịch cúm gia cầm do virus A/H5N1 là vấn đề quan tâm đối với cả thế giới, đặc biệt là đối với các nước châu Á như Việt Nam, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc... Kể từ cuối năm 2003 đến nay, dịch cúm A/H5N1 đã gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm và gây tử vong cho hàng trăm người. Cả thế giới đang lo sợ trước nguy cơ có thể xảy ra một đại dịch cúm trên người do virus A/H5N1 giống như các vụ đại dịch cúm đã xảy ra trong thế kỷ 20. Các nước trên thế giới đã tiêu tốn hàng tỷ đô la cho việc chuẩn bị chống lại một đại dịch cúm H5N1 có thể xảy ra trong tương lai như mua thuốc và các thiết bị y tế, nghiên cứu sản xuất vaccine, thực hành các phương án phòng chống dịch, thực hiện các chiến lược nhằm kiểm soát chặt chẽ đường biên giới...
MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, dịch cúm gia cầm virus A/H5N1 vấn đề quan tâm giới, đặc biệt nước châu Á Việt Nam, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc Kể từ cuối năm 2003 đến nay, dịch cúm A/H5N1 gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm gây tử vong cho hàng trăm người Cả giới lo sợ trước nguy xảy đại dịch cúm người virus A/H5N1 giống vụ đại dịch cúm xảy kỷ 20 Các nước giới tiêu tốn hàng tỷ đô la cho việc chuẩn bị chống lại đại dịch cúm H5N1 xảy tương lai mua thuốc thiết bị y tế, nghiên cứu sản xuất vaccine, thực hành phương án phòng chống dịch, thực chiến lược nhằm kiểm soát chặt chẽ đường biên giới Ở Việt Nam, kể từ năm 2003 đến nay, dịch cúm gia cầm liên tục xảy hầu hết tỉnh thành toàn quốc Mỗi năm có hàng triệu gia cầm bị chết tiêu hủy Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam đứng thứ giới (sau Indonesia) số người nhiễm tử vong virus A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 virus có khả biến đổi gen nhanh chóng hình thành nên chủng virus nên việc sử dụng vaccine để dự phòng thường khơng đạt hiệu cao Ở Việt Nam nay, dịch cúm A/H5N1 liên tục xảy gia cầm người, mức độ không trầm trọng giai đoạn trước khơng phát có biện pháp dập dịch kịp thời dịch trở nên bùng phát Khi có dịch cúm gia cầm, phương pháp chẩn đốn nhanh, nhạy xác cần thiết cho việc điều trị, kiểm soát ngăn chặn kịp thời tránh lây lan rộng cộng đồng Để phát virus cúm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm người gia cầm, hầu hết phòng xét nghiệm áp dụng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) Đây kỹ thuật sinh học phân tử, cho phép phát virus với độ xác cao, thời gian làm xét nghiệm khoảng 4-6 thực Realtime RT-PCR 12-24 thực RT- PCR điện di gel agarose Với RT-PCR thông thường, người ta phải thực ba phản ứng để chẩn đoán xác định virus cúm A/H5N1, bao gồm: phản ứng để xác định virus cúm A, phản ứng xác định subtype H5 phản ứng xác định subtype N1 Để đơn giản hóa q trình xét nghiệm, rút ngắn thời gian xét nghiệm tiết kiệm chi phí người ta ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR, cho phép chẩn đoán xác định cúm A/H5N1 với phản ứng RT-PCR thay phải làm ba phản ứng RT-PCR Tuy nhiên, việc nghiên cứu thiết kế xây dựng quy trình thực kỹ thuật multiplex RT-PCR phức tạp nên hầu hết phòng xét nghiệm nước chưa áp dụng kỹ thuật chẩn đoán cúm A/H5N1 Chính vậy, chúng tơi thực ”Nghiên cứu xây dựng quy trình phát nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction” Labo Trường Đại học Y Thái Bình với mục tiêu: Thiết kế lựa chọn mồi phù hợp để thực phản ứng multiplex RT-PCR phát virus cúm A/H5N1 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện phản ứng multiplex RT-PCR: nhiệt độ thời gian gắn mồi, nồng độ mồi, Thử nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR phát A/H5N1 số mẫu bệnh phẩm thu thập từ người gia cầm Chương TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 1.1.1 Phân loại học danh pháp 1.1.1.1 Phân loại virus cúm Theo ủy ban Quốc tế phân loại virus (ICTV - International Committee on Taxonomy of Viruses), virus cúm thuộc nhóm V, họ Orthormyxoviridae, gồm type A, B C Chúng virus có vật liệu di truyền RNA sợi đơn âm [32] Sự phân biệt virus cúm A, B C dựa khác đặc tính kháng nguyên nucleoprotein (NP) protein M1 (matrix protein) Ngoài ra, hệ gen virus cúm A B có đoạn RNA virus cúm C có đoạn RNA [36] Trong type type A virus có giới hạn vật chủ rộng, lưu hành phổ biến gia cầm số động vật có vú lợn, ngựa, chó, mèo, hải cẩu,… người [32] Virus cúm A loại có độc lực mạnh nhất, có khả biến đổi gen lớn nguyên nhân chủ yếu gây vụ đại dịch cúm kỷ qua Dựa vào khác biệt đặc tính kháng nguyên hai glycoprotein haemagglutinin (HA) neuraminidase (NA), virus cúm A chia thành 16 subtype HA (H1-H16) subtype NA (N1-N9) Sự tái tổ hợp subtype HA NA, mặt lý thuyết tạo nhiều subtype khác độc tính khả gây bệnh [2] Tất subtype HA NA diện chủng virus lưu hành lồi thủy cầm hoang dã Tuy nhiên, có số subtype định thường xuyên lưu hành người H1N1, H1N2, H2N2, H3N2 [11] Cúm A/H5N1 subtype có khả gây nhiễm cao virus cúm Các chủng virus cúm gia cầm xâm nhiễm vào nhiều loại động vật khác chim, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi người Virus cúm B virus cúm C lưu hành chủ yếu người gây vụ dịch mức độ vừa nhỏ 1.1.1.2 Phân loại virus cúm A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 phân biệt với subtype virus cúm A khác dựa khác biệt đặc tính kháng nguyên HA NA Do có khả biến đổi di truyền nhanh chóng nên chủng virus cúm A/H5N1 lưu hành phân chia thành nhiều clade/subclade (nhóm/phân nhóm), clade/subclade có đặc điểm di truyền đặc trưng [2] Các genotype virus cúm A/H5N1 Trong năm gần virus cúm A/H5N1 có biến đổi di truyền phân chia thành nhiều nhóm dựa vào khác biệt kiểu gen (genotype) Kiểu gen virus cúm A/H5N1 thể đặc điểm di truyền virus hình thành kết hợp phân đoạn gen Trên sở gen H5 N1 chủng gốc Goose/Guangdong/1/96, virus A/H5N1 phân chia thành kiểu gen khác với đặc điểm di truyền hình thành tái tổ hợp gen lại từ nguồn khác Các kiểu gen khác virus cúm A/H5N1 xác định bao gồm A, B, C, D, E, G, V, W, X 0, X1, X2, X3, Y, Z Z+ [26] Trong số kiểu gen này, có số kiểu gen (B, Z, Z+, V, G, W, X0) lưu hành năm, chứng tỏ chúng thích nghi để tồn [22] Kiểu gen Z kiểu gen lưu hành phổ biến Indonesia, Thái Lan, Việt Nam phía nam Trung Quốc từ năm 2003 đến [14] Các clade virus cúm A/H5N1 Các tổ chức WHO (World Health Organization), OIE (Organisation for Animal Health) FAO (Food and Agriculture Organization) xây dựng hệ thống danh pháp thống để xác định clade A/H5N1 [50] Hiện nay, hệ thống danh pháp chia virus A/H5N1 thành 10 clade khác nhau, clade phân thành subclade (phân dòng) [5, 46] Hiện có virus thuộc clade 0, 1, lây nhiễm cho người Clade gồm số subclade khác lưu hành tiếp tục hình thành subclade [5] Kể từ 2008, clade A/H5N1 lưu hành gây bệnh người gồm có clade 2.3.2 (Trung Quốc), 2.3.4 (Trung Quốc Việt Nam) 2.2 (Ai Cập), 2.1 (Indonesia), (Campuchia) (Trung Quốc) [51] 1.1.1.3 Danh pháp virus cúm Tổ chức Y tế giới (WHO) quy định thống danh pháp virus cúm theo thứ tự kí hiệu: type virus (A, B C), vật chủ (có thể bỏ qua vật chủ người), địa điểm phân lập virus, mã số chủng virus năm phân lập Nếu virus cúm A phải thêm kí hiệu kháng nguyên HA kháng nguyên NA đặt dấu ngoặc đơn Ví dụ: A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) chủng virus cúm A người, phân lập Hong Kong, mã số chủng 156, phân lập năm 1997, có kháng nguyên HA H5 kháng nguyên NA N1 A/Chicken/Vietnam/G62/2005 (H5N1) chủng virus cúm A phân lập gà Việt Nam năm 2005, mã số chủng G62, kháng nguyên HA H5 kháng nguyên NA N1 1.1.2 Hình thái cấu trúc virus cúm A/H5N1 Virus cúm H5N1 subtype virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridea Virus cúm A/H5N1 mang đặc điểm virus cúm A (hình 1.1) Hình 1.1 Cấu trúc virus cúm A http://thefutureofthings.com/news/6684/ human-antibodies-neutralize-avian-flu.html Virus cúm A virus có vỏ bọc, cấu trúc dạng hình cầu với đường kính từ 80120 nm (nanomet) hình sợi dài 200-300 nm, đường kính 20 nm Vỏ bọc virus lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào vật chủ, màng có khoảng 500 cấu trúc hình gai nhơ Các cấu trúc kháng nguyên bề mặt virus, dài khoảng 10-14 nm, đường kính 4-6 nm, chất glycoprotein HA, NA M2 nằm xen kẽ với Sự phân bố kháng nguyên bề mặt hạt virus không đồng đều, tỉ lệ HA/NA khoảng 4-5/1 Bên màng lipid lót lớp protein M1 (khoảng 3000 phân tử M1) [36] Vật chất di truyền (hệ gen) virus cúm A RNA sợi đơn âm (-)ssRNA, gồm phân đoạn riêng biệt mã hóa cho 10 11 protein virus (tùy theo chủng virus mà có khơng có protein PB1-F2) Bên hạt virus, phân đoạn liên kết với nucleoprotein (NP) tiểu đơn vị enzyme polymerase (bao gồm PB1, PB2, PA) hình thành nên phức hợp ribonucleoprotein (viral ribonucleoprotein - vRNP) [37] 1.1.3 Hệ gen protein virus A/H5N1 H5N1 có hệ gen RNA sợi đơn âm bao gồm phân đoạn gen mang tên từ 1-8 với kích thước phân tử giảm dần gọi theo tên protein mà chúng mã hóa tổng hợp PB2, PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M (M1 M2) NS (NS1 NEP) (hình 1.2) Hình 1.2 Các phân đoạn gen protein virus cúm A/H5N1 Đặc điểm phân đoạn gen virus cúm A/H5N1 sau: Các phân đoạn mã hóa cho kháng nguyên bề mặt virus (đặc trưng theo chủng virus): - Phân đoạn (gen HA): Có kích thước khoảng 1704-1707 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein HA, kháng nguyên bề mặt virus cúm có chất glycoprotein Kháng ngun có vai trò việc giúp cho virus gắn với tế bào vật chủ vận chuyển vật liệu di truyền vào bên tế bào vật chủ Q trình bị chặn lại có kháng thể đặc hiệu gắn kết với kháng nguyên bề mặt virus Protein HA kháng nguyên bề mặt quan trọng virus cúm A, kích thích thể sinh đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với subtype HA, tham gia vào phản ứng trung hòa virus HA protein vừa định tính kháng nguyên, vừa định độc lực virus, đích bảo vệ miễn dịch nhằm ngăn chặn xâm nhiễm virus thể nhiễm, sở điều chế vaccine phòng cúm Một đặc điểm di truyền để phân biệt virus cúm gia cầm virus cúm người là: virus cúm gia cầm gắn với thụ thể alpha 2-3 sialic acid virus cúm người gắn với thụ thể alpha 2-6 sialic acid tế bào chủ Ở số động vật (lợn, gà ) có loại thụ thể nên bị nhiễm virus cúm gia cầm cúm người [24] Người ta phát đột biến số vị trí gen HA làm cho virus cúm gia cầm gắn với tế bào người gây bệnh cho người [11] Một số nghiên cứu thời gian gần cho thấy người có thụ thể alpha 2-3 sialic acid với mật độ thấp gia cầm có thụ thể alpha 2-6 sialic acid với mật độ thấp [28] Người ta nhận thấy đột biến xảy vị trí gen HA tương ứng với axit amin 182 192 virus gắn với thụ thể người gia cầm [10, 27] - Phân đoạn (gen NA): Có kích thước khoảng từ 1350-1410 bases, mang gen mã hóa cho neuraminidase, kháng nguyên bề mặt virus, có vai trò enzyme cắt đứt liên kết gốc sialic acid màng tế bào nhiễm với phân tử carbonhydrate protein HA, giải phóng hạt virus khỏi tế bào vật chủ Ngồi ra, NA phân cắt liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan lỗng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mơ khỏi chất ức chế khơng đặc hiệu Giống kháng nguyên HA, NA đích chủ yếu chế bảo vệ miễn dịch thể chủ, sinh kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA chủng virus nhễm Như vậy, hai kháng nguyên bề mặt HA NA virus sở điều chế vaccine phòng cúm cho người gia cầm hạn chế lây truyền sang người [2] Các phân đoạn mã hóa cho protein thành phần enzyme polymerase virus, có độ dài ổn định có tính bảo tồn cao, gồm: - Phân đoạn (gen PB2) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein PB2, tiểu đơn vị thành phần phức hợp enzyme polymerase virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus [2] Nghiên cứu thấy rằng, PB2 tất virus cúm gia cầm có axit amin vị trí 627 glutamine, PB2 chủng A/H5N1 phân lập từ người mang đột biến chứa axit amin lysine vị trí 627 Sự có mặt lysine vị trí 627 PB2 tạo thuận lợi cho virus phát triển đường hô hấp đường hô hấp động vật có vú, nguyên nhân làm cho A/H5N1 có độc lực cao [29] - Phân đoạn (gen PB1) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein PB1 PB1-F2 PB1 tiểu đơn vị xúc tác phức hợp enyzme polymerase, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA [5] PB1-F2 liên quan đến độc lực virus có vai trò quan trọng việc xác định mức độ nguy hiểm dịch cúm [43] Khi so sánh chủng virus vụ dịch Hong Kong năm 1997, người ta nhận thấy biến đổi axit amin asparagine vị trí 66 thành serine (N66S) PB1-F2 liên quan đến độc lực virus Sự thay đổi axit amin N66S phát PB1-F2 virus cúm gây đại dịch cúm năm 1918 [17] - Phân đoạn (gen PA) có kích thước khoảng 2233 bases, phân đoạn gen bảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein PA, tiểu đơn vị enzyme polymerase chịu trách nhiệm kéo dài RNA trình tổng hợp RNA virus [40] Các phân đoạn mã hóa protein chức khác virus, chúng có kích thước tương đối ổn định chủng virus cúm A, gồm: - Phân đoạn (gen NP) có kích thước khoảng 1556 bases, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP), chịu trách nhiệm vận chuyển RNA nhân bào tương tế bào chủ NP có đặc tính kháng ngun biểu theo nhóm virus, tồn hạt virus dạng kết hợp với phân đoạn RNA - Phân đoạn (gen M): có kích thước khoảng 1027 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein M1 M2 virus Các protein kết hợp với kháng nguyên bề mặt tạo nên lớp vỏ capsid virus Hai protein tạo từ phân đoạn RNA với khung đọc mở khác Protein M1 gắn với RNA virus M2 có tác dụng phá vỡ vỏ bọc virus để giải phóng phân đoạn RNA vào tế bào chất tế bào chủ M2 protein xuyên màng có chất kênh ion, cần thiết cho trình xâm nhiễm virus [36] Sự thay axit amin vị trí 31 serin thành asparagine protein M2 số chủng H5N1 liên quan đến tình trạng kháng amantadin virus [25] - Phân đoạn (gen NS) có kích thước khoảng 890 bases, chứa gen mã hóa cho protein khơng cấu trúc virus NS1 NEP (nuclear export protein) (thường gọi protein NS2) Độc lực virus liên quan đến protein NS [39] NS1 protein có vai trò việc ghép nối, dịch mã vận chuyển RNA qua màng tế bào NEP có vai trò trung gian trình vận chuyển ribonucleoprotein virus (vRNPs) vào nhân tế bào chủ 1.1.4 Chu trình tái virus cúm A/H5N1 Chu trình tái virus cúm xảy chủ yếu tế bào biểu mơ đường hơ hấp, đường tiêu hóa thể nhiễm (hình 1.3) Hình 1.3 Chu trình tái virus cúm A Khởi đầu chu trình gắn kết virus với thụ thể có chứa nhóm sialic acid bề mặt tế bào nhiễm nhờ kháng nguyên HA Khi virus bám gắn với tế bào, màng tế bào lõm lại hình thành túi thực bào (endosome) Túi thực bào giảm dần pH để giúp cho q trình hồ nhập màng virus với màng túi thực bào giải phóng phức hợp RNP virus vào tế bào chất tế bào chủ Sau đó, phức hợp RNP vận chuyển vào nhân tế bào để tổng hợp sợi dương RNA Sợi dương RNA làm khuôn để mã tạo mRNA tái sợi âm RNA virus mRNA đưa tế bào chất để tổng hợp protein virus Quá trình tổng hợp protein tái hệ gen virus q trình phức tạp điều hồ nhiều yếu tố virus tế bào Các protein PB1, PB2, PA NP virus sau tổng hợp đưa vào nhân tế bào kết hợp với RNA virus hình thành phức hợp RNP phức hợp đưa tế bào chất Các protein khác (HA, NA M2) glycosyl hoá nhờ mạng lười nội sinh chất phức hệ golgi tế bào Sau hoàn thiện, protein đưa đến màng tế bào gắn vào lớp lipid kép mật độ đủ lớn phức hợp RNP protein M1 tập hợp lại màng để hình thành hạt virus hệ gắn bề mặt tế bào nhờ liên kết HA với nhóm sialic acid glycoprotein màng tế bào Các hạt virus sau giải phóng khỏi màng nhờ tác dụng cắt nhóm sialic acid enzyme neuraminidase 10 phản ứng Kết điện di (hình 3.13) cho thấy phản ứng multiplex RT-PCR phát đồng thời gen (154 bp - M, 292 bp - NA, 371 bp - HA) với RNA virus A/H5N1; phát gen (292 bp - NA, 154 bp - M) với RNA virus cúm A/H1N1; phát gen (371 bp - HA; 154 pb - M) với RNA virus cúm A/H5; phát gen (154 bp - M) với RNA virus cúm A/H3 không phát gen với RNA virus cúm B Ngoài ra, thực phản ứng với vật liệu di truyền số loài khác (người, Escherichia coli, Mycobacteria tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Neisseria gorrnorhea, Hepatitis B virus, Hepatitis C virus, Human immunodeficiency virus, Human Papillomavirus), phản ứng multiplex RT-PCR cho kết âm tính Điều chứng tỏ với cặp mồi thiết kế phản ứng multiplex RT-PCR tối ưu đặc hiệu với virus cúm A subtype H5 subtype N1, khơng có phản ứng chéo với RNA lồi khác Hình 3.13: Ảnh điện di đánh giá độ đặc hiệu phản ứng multiplexRT-PCR M: thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; 1: cúm A/H5; 2: cúm A/H3; 3: cúm B; 4: cúm A/H5N1; 5: cúm A/H1N1 Như sau tối ưu, thành phần điều kiện chu trình nhiệt phản ứng multiplex RT-PCR chẩn đoán cúm A/H5N1 là: Thành phần phản ứng (bảng 3.12): Bảng 3.12: Thành phần phản ứng multiplex RT-PCR Thứ tự Sinh phẩm RNase free water Qiagen Onestep buffer 5X Thể tích (l) 20.75 RT-PCR 10 60 Nồng độ cuối 1X dNTP mix 10 mM each Diag MF 10 M 1.5 0.4 mM each 0.3 M Diag MR 10 M 1.5 0.3 M Diag H5F 10 M 2.5 0.5 M Diag H5R 10 M 2.5 0.5 M Diag N1F 10 M 0.4 M 0.4 M Diag N1R 10 M Qiagen Onestep RT-PCR Enzyme mix RNase Inhibitor 40 U/l RNA template Tổng thể tích phản ứng 0.25 10 U pg – g 50 Chu trình nhiệt (bảng 3.13): Bảng 3.13: Chu trình nhiệt phản ứng multiplex RT-PCR Thứ tự Nhiệt độ (oC) 50 95 94 57 72 72 Thời gian 30 phút 15 phút 30 giây 30 giây 30 giây phút Số chu kỳ 1 45 3.4 Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR phát virus A/H5N1 mẫu bệnh phẩm Các mẫu bệnh phẩm tiến hành xử lý tách chiết RNA sinh phẩm QIAamp viral RNA mini spin protocol Sản phẩm RNA tách chiết đo OD 260 nm 280 nm để xác định hàm lượng RNA xác định độ tinh RNA mẫu bệnh phẩm Kết đo OD cho thấy, tỷ lệ OD 260/OD280 nằm khoảng 1.8-2.0, RNA tách chiết khơng lẫn protein Sau đó, RNA mẫu bệnh phẩm sử dụng để thực phản ứng multiplex RT-PCR phát gen M, HA NA virus cúm gia cầm 61 A/H5N1 Đối với mẫu bệnh phẩm chưa biết chưa biết có nhiễm H5N1 hay không, thực phản ứng RT-PCR phát gen riêng rẽ để so sánh kiểm tra độ tin cậy phản ứng multiplex RT-PCR - Kết kỹ thuật multiplex RT-PCR thử nghiệm 14 mẫu dương tính với virus cúm A/H5N1 (2 mẫu từ ngan, mẫu từ vịt, mẫu từ gà, mẫu từ người) điện di (hình 3.14) cho thấy phản ứng multiplex RT-PCR phát virus cúm A/H5N1 14 mẫu bệnh phẩm Hình 3.14: Kết thử nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR mẫu bệnh phẩm dương tính M: thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; md: muscovy duck; ck: chicken; d: duck 1, 2, 3; h: human 1, 2, 3, 4, 5, Qua kết cho thấy, kỹ thuật multiplex RT-PCR tối ưu hoá với cặp mồi thiết kế đặc hiệu nhạy Kỹ thuật áp dụng để xác định virus cúm A/H5N1 đối tượng vật chủ khác nhau: gia cầm, người - Kết thử nghiệm kỹ thuật multiplex RT-PCR tối ưu phát có mặt virus cúm gia cầm A/H5N1 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm chết bị bệnh vụ dịch cúm: Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng multiplex RT-PCR phát virus cúm A/H5N1 gel agarose 2% mẫu bệnh phẩm (hình 3.15) cho thấy mẫu chứng âm không bị nhiễm, mẫu dương tính (số 1, 3, 5, 6, 9) lên band (371 bp- HA, 292 bp- NA, 154 bp- M) tương đương với band chứng dương Các mẫu âm tính (số 2, 4, 10) khơng xuất band 62 Hình 3.15: Kết thử nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR phát virus cúm gia cầm A/H5N1 số mẫu bệnh phẩm M: Thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; PC: Chứng dương; 1-10: Mẫu bệnh phẩm Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát gen M, HA NA mẫu bệnh phẩm (hình 3.16) cho thấy: Các mẫu âm tính (khơng xuất band nào) mẫu dương tính (xuất band phản ứng RT-PCR với cặp mồi hình 3.16 A, B, C) mẫu âm tính dương tính phản ứng multiplex RT-PCR chẩn đốn Như vậy, khẳng định kết phản ứng multiplex RT-PCR hoàn toàn đáng tin cậy Và khẳng định độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng không đổi kết hợp mồi phản ứng (A) 63 (B) (C) Hình 3.16: Kết thử nghiệm phản ứng RT-PCR phát virus cúm gia cầm A/H5N1 số mẫu bệnh phẩm A: RT-PCR phát gen M; B: RT-PCR phát gen HA; C: RT-PCR phát gen NA M: Thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; PC: Chứng dương; 1- 10: Mẫu bệnh phẩm Trong 30 mẫu bệnh phẩm thử nghiệm, kỹ thuật multiplex RT-PCR RT-PCR phát mẫu dương tính (30%) với virus cúm gia cầm A/H5N1, 21 mẫu âm tính (70%) với virus cúm gia cầm (bảng 3.14) Kết kỹ thuật multiplex RT-PCR phát đồng thời gen có độ nhạy độ đặc hiệu không thay đổi so với phản ứng RT-PCR phát gen riêng biệt Độ đặc hiệu phản ứng 100%, độ nhạy cao, phát phản ứng có từ 10 virus trở lên Bảng 3.14: So sánh kết xét nghiệm phản ứng RT-PCR multiplex RTPCR mẫu bệnh phẩm Kỹ thuât xét nghiệm Dương tính Âm tính Tổng Multiplex RT-PCR 21 30 RT-PCR 21 30 Tỷ lệ 30% 70% 100% 64 So sánh thời gian chi phí làm xét nghiệm kỹ thuật multiplex RTPCR RT-PCR phát virus cúm A/H5N1 (bảng 3.15) cho thấy: thời gian hoàn thành xét nghiệm với phản ứng RT-PCR khoảng 9.5 giờ, chi phí hết 600 ngàn đồng; thời gian hồn thành xét nghiệm với phản ứng multiplex RT-PCR khoảng 6.5 giờ, chi phí hết 320 ngàn đồng Như vậy, phản ứng multiplex RT-PCR rút ngắn thời gian làm xét nghiệm tích kiệm chi phí hố chất đến nửa so với phản ứng RT-PCR Bảng 3.15: So sánh thời gian chi phí hố chất làm xét nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR RT-PCR Xét nghiệm Các bước làm xét nghiệm RT-PCR Xử lý mẫu tách chiết RNA Thực phản ứng Qiagen Onestep RT-PCR Điện di gel agarose, nhuộm, quan sát Tổng Xử lý mẫu tách chiết RNA Thực phản ứng Qiagen Onestep RT-PCR Điện di gel agarose, nhuộm, quan sát Tổng Multiplex RT-PCR Thời gian (giờ) Chi phí (ngàn đồng) 150 420 1.5 9.5 30 600 150 140 1.5 6.5 30 320 Thảo luận Trong năm gần đây, dịch cúm gia cầm virus cúm A/H5N1 xảy nhiều nước, đặc biệt nước khu vực Đông Nam Á Không gây bệnh gia cầm, virus cúm A/H5N1 lây nhiễm gây bệnh người với tỉ lệ tử vong cao Theo Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam nước có số người tử vong cúm A/H5N1 đứng thứ giới, sau Indonesia Ở nước ta, dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy bùng phát lúc Khi dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát, việc điều trị, kiểm soát ngăn chặn khẩn cấp dịch cúm lan rộng vơ quan trọng Do đó, việc xây dựng kỹ thuật chẩn đoán nhanh, nhạy xác virus cúm A/H5N1 cấp thiết để sàng lọc số lượng lớn loại virus Trong kỹ thuật phân tử chẩn đoán virus cúm, phản ứng multiplex RT-PCR xem tốt cho kết nhanh, nhạy xác tiết kiệm chi phí hố chất cho 65 xét nghiệm (Ellis et al., 1997; Fan et al., 1998; Osiowy, 1998; Grondahl et al., 1999; Liolios et al., 2001; Xie et al., 2006; Bellau-Pojul et al., 2005 and Thontiravong et al., 2007) Trong nghiên cứu chúng tôi, kỹ thuật multiplex RT-PCR với cặp mồi cho phép phát đồng thời trình tự đặc hiệu virus cúm A (trên gen M), subtype H5 (trên gen HA) subtype N1 (trên gen NA) xây dựng thành công Kỹ thuật multiplex RT-PCR thực theo phương pháp bước (phản ứng phiên mã ngược phản ứng khuếch đại thực tube phản ứng) nên giảm thiểu tối đa nguy ngoại nhiễm Mặt khác, thời gian làm xét nghiệm giảm đáng kể so với phương pháp hai bước (phản ứng RT PCR thực tube riêng biệt) kỹ thuật RT-PCR phát gen riêng biệt Kết thử nghiệm cho thấy kỹ thuật multiplex RT-PCR đặc hiệu với virus cúm A/H5N1 có độ nhạy cao, có khả phát mẫu thử có từ 10 virus trở lên So với kỹ thuật RT-PCR phát gen riêng biệt, đô nhạy độ đặc hiệu phản ứng multiplex không bị giảm Thử nghiệm 14 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus cúm A/H5N1 (8 mẫu thu thập từ gia cầm mẫu từ người), phản ứng multiplex RT-PCR khuếch đại thành công gen H5, N1 M virus Như vậy, kỹ thuật ứng dụng để phát nhiễm cúm A/H5N1 người gia cầm Các cặp mồi thiết kế đặc hiệu với gen M, HA NA chủng virus cúm phân lập từ vật chủ khác nên kỹ thuật multiplex RTPCR dùng để phát nhiễm cúm A/H5N1 số động vật có vú khác Kỹ thuật multiplex RT-PCR thiết kế với cặp mồi có ưu điểm vượt trội như: đơn giản hóa bước q trình xét nghiệm, giảm thời gian làm xét nghiệm tiết kiệm khoảng 50% chi phí hóa chất phục vụ cho xét nghiệm Tuy phản ứng multiplex realtime RT-PCR cho kết nhanh, nhạy xác u cầu có máy móc đại chi phí tốn Do vậy, kỹ thuật multiplex RT-PCR xây dựng thuận tiện cho nhiều phòng thí nghiệm nước ta 66 Kết luận Đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu với gen M, HA NA dùng để phát virus cúm gia cầm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm phản ứng mutiplex RTPCR Đã xây dựng thành công kỹ thuật multiplex RT-PCR cho phép phát nhanh virus cúm A/H5N1 với độ nhạy độ đặc hiệu cao áp dụng để phát nhiễm cúm A/H5N1 gia cầm người Kỹ thuật multiplex RT-PCR đặc hiệu với virus cúm A/H5N1, khơng có phản ứng chéo với lồi khác Kỹ thuật có khả phát mẫu thử có từ 10 RNA trở lên Kiến nghị Để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu vào xét nghiệm cúm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm gia cầm người, đề xuất kiến nghị sau: Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng quy trình phản ứng multiplex RT-PCR vào phát virus cúm A/H5N1 số lượng lớn mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm người bị bệnh vụ dịch cúm Ứng dụng quy trình multiplex RT-PCR phát virus cúm A/H5N1 mẫu thu thập từ gia cầm khoẻ mạnh mơi trường nơi có dịch cúm xảy để đánh giá lưu hành virus cúm gia cầm 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Quang Anh (2006), Báo cáo tình hình cúm gia cầm Việt Nam, Hội nghị phòng chống dịch cúm gia cầm Bộ Nông nghiệp phát triển Nông thôn Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Trần Bình (2004), “Virus cúm A gia cầm mối quan hệ lây nhiễm động vật sang người”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 2(1): 1-18 Lê Văn Năm (2004), “Bệnh cúm gà”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(1): 81-86 Tơ Long Thành (2004), “Bệnh cúm lồi chim”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(2): 53-58 Tiếng Anh Abdel-Ghafar AN, Chotpitayasunondh T, Gao Z, Hayden FG, Nguyen DH, et al, 2008, “Update on avian influenza A (H5N1) virus infection in humans”, N Engl J Med, 358, pp 261-73 Apisarnthanarak A, Kitphati R, Thongphubeth K, Patoomanunt P, et al, 2004, “Atypical avian influenza (H5N1)”, Emerg Infect Dis, 10, pp 1321- Baigent SJ, McCauley JW (2001), “Glycosylation of haemagglutinin and stalklength of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture” Virus Res, 79(1-2): 177-185 Beare AS and Webster RG (1991), “Replication of avian influenza viruses in humans”, Arch Virol., 119, pp 37-42 Beigel JH, Farrar J, Han AM, Hayden FG, Hyer R, de Jong MD, Lochindarat S, Nguyen TK, Nguyen TH, Tran TH, Nicoll A, Touch S, Yuen KY (2005), “Avian influenza A (H5N1) infection in humans”, N Engl J Med, 353, pp 1374- 85 10 Bloomberg News articles (2006), Two Bird Flu Gene Mutations Might Lead to Faster Human Spread, Published 11 Butler D (2006), “Alarms ring over bird flu mutations”, Nature, 439, pp 248-9 12 CDC (2009), Interim guidance on the planning for the use of surgical masks and respirators in health care settings during an influenza pandemic 68 13 Chan PK (2002), “Outbreak of avian influenza A (H5N1) virus infection in Hong Kong in 1997”, Clin Infect Dis, 34(suppl 2):S58- S64 14 Chen H, Smith GJ, Li KS, Wang J, Fan XH, et al (2006), “Establishment of multiple sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic control”, Proc Natl Acad Sci USA, 103, pp 2845- 50 15 Chen, H., G Deng, Z Li, G Tian, Y Li, and P Jiao (2004), “ The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southern China” , Proc Natl Acad Sci USA, 101: p 10452-10457 16 Chotpitayasunondh T, Ungchusak K, Hanshaoworakul W, et al (2005), “Human disease from influenza A (H5N1)” Emerg Infect Dis, 11, pp 201- 17 Conenello G, Zamarin D, Perrone L, Tumpey T and Palese P (2007), “A Single Mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 Influenza A Viruses Contributes to Increased Virulence”, PLoS Pathog, 3(10), pp 1414-21 18 De Jong MD, Bach VC, Phan TQ, Vo MH, Tran TT, Nguyen BH, Beld M, Le TP, Truong HK, Nguyen VV, Tran TH, Do QH, Farrar J (2005), “Fatal avian influenza A (H5N1) in a child presenting with diarrhea followed by coma”, N Engl J Med, 352, pp 686-91 19 De Jong MD, Simmons CP, Thanh TT, Hien VM, Smith GJ, Chau TN, Hoang DM, Chau NV, Khanh TH, Dong VC, Qui PT, Cam BV, Ha DQ, Guan Y, Peiris JS, Chinh NT, Hien TT, Farrar J (2006), “Fatal outcome of human influenza A (H5N1) is associated with high viral load and hypercytokinemia”, Nat Med, 12, pp 1203- 07 20 De Jong MD, Tran TT, Truong HK, Vo MH, Smith GJ, Nguyen VC, Bach VC, Phan TQ, Do QH, Guan Y, Peiris JS, Tran TH, Farrar J (2005), “Oseltamivir resistance during treatment of influenza A (H5N1) infection”, N Engl J Med, 353, pp 2667-72 21 Drake J W (1993), “Rate of spontaneous mutation among RNA viruses”, Proc Natl Acad Sci U S A, 90(9): 4171-4175 22 Duan L, Bahl J, Smith G, et al (2008), “The development and genetic diversity of H5N1 influenza virus in China, 1996-2006”, Virology, 380, pp 243-54 23 Gambaryan A, Tuzikov A, Pazynina G, et al (2006), “Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses”, Virology; 344:432-438 69 24 Greninger A (2004), The Definition and Measurement of Dangerous Research 25 Guan Y, et al (2004), “H5N1 influenza: A protean pandemic threat”, PNAS, 101(21), pp 8156-61 26 Guan Y, et al (2002), “Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR”, Proc Natl Acad Sci USA, 99, pp 8950–5 27 Hamada S., Suzuki Y., Suzuki T., et al (2006), “Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A virus to human-type receptors”, Nature, 444(7117), pp.378-82 28 Harder T C and Werner O (2006), “Avian Influenza”, Influenza, Report 2006 29 Hatta M., et al (2007), Growth of H5N1 Influenza A Viruses in the Upper Respiratory Tracts of Mice, PLoS Pathog 30 Hoa, L.T., D.D Khang, P.V Chi, N.V Hai, T.N Hai, N.T.B Nga, and L.T Binh (2006), “Molecular characterization of the H5 gene for the highly pathogenic A/H5N1 strains isolated in Vietnam during 2004 – 2006”, Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture, p 68-71 31 Hui DS (2008), “Review of clinical symptoms and spectrum in humans with influenza A/H5N1 infection”, Respirology, 13(suppl 1):S10-S13 32 International Committee on Taxonomy of Viruses Index of Viruses (2009), Orthomyxoviridae, In: ICTVdB - The Universal Virus Database, version B#chen-Osmond, C (Ed), Columbia University, New York, USA 33 Julkunen I, Pyhala R, Hovi T, 1985, Enzyme immunoassay, complement fixation and hemagglutination inhibition tests in the diagnosis of influenza A and B virus infections”, Purified hemagglutinin in subtype-specific diagnosis, J Vir.Methods 10, 75-84 34 Kandun IN, Wibisono H, Sedyaningsih ER, Yusharmen, Hadisoedarsuno W, et al (2006), “Three Indonesian clusters of H5N1 virus infection in 2005” N Engl J Med, 355, pp 2186-94 70 35 Katz JM, Lim W, et al (1999), “Antibody response in individuals infected with avian influenza A (H5N1) viruses and detection of anti-H5 antibody among household and social contacts”, J Infect Dis, 180, pp 1763-70 36 Lamb RA and Krug RM (2001), “Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication”, Fields Virology, 4th Edition, (D.M Knipe and P.M Howley, eds), pp 1487-1531 37 Lamb RA (1989), Genes and proteins of the influenza viruses In: Krug R M, editor The influenza viruses 1st ed New York, N.Y: Plenum Press 38 Le, Q., M Kiso, K Someya, Y Sakai, T Nguyen, K Nguyen, N Pham, H Nguyen, S Yamada, Y Muramoto, T Horimoto, A Takada, H Goto, T Suzuki, Y Suzuki, and Y Kawaoka (2005), “Avian flu: isolation of drugresistant H5N1 virus” Nature, 437(7062): p 1108 39 Lee C W., Suarez D., Tumpey T., et al (2005), “Characterization of Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza A Viruses Isolated from South Korea”, Journal of Virology, 79(6), pp 3692-3702 40 Luong, G and P Palese (1992), “Genetic analysis of influenza virus”, Curr Opinion Gen Develop, 2: p 77-81 41 Ng EK, Cheng PK, Ng AY, Hoang TL, and Lim WW (2005), “Influenza A H5N1 detection”, Emerg Infect Dis., 11, pp 1303-5 42 Rowe T, Abernathy RA, Hu-Primmer J, et al (1999), Detection of Antibody to Avian Influenza A (H5N1) Virus in Human Serum by Using a Combination of Serologic Assays, J Clin Microbiol, 37(4), pp 937- 43 43 Sastre A (2006), Antiviral Response in Pandemic Influenza Viruse, CDC, vol 12 number 44 Senne, DA, Panigrahy, B, Kawaoka, Y, Pearson, JE, Suss, J, Lipkind, M, Kida, H and Webster, RG (1996), “Survey of the hemagglutinin (HA) cleavage site sequence of H5 and H7 avian influenza viruses: amino acid sequence at the HA cleavage site as a marker of pathogenicity potential”, Avian Diseases, 40: 425-437 71 45 Swayne DE and Halverson DA (2007), Diseases of Poultry: Influenza, 12th edn Ames, IA: Blackwell Publishing Professional 46 Takano R, Nidom CA, Kiso M, Muramoto Y, Yamada S, Sakai-Tagawa Y, Macken C, Kawaoka Y (2009), “Phylogenetic characterization of H5N1 avian influenza viruses isolated in Indonesia from 2003-2007”, Virology, 390, pp 13-21 47 Tran TH, Nguyen TL, Nguyen TD, Luong TS, Pham PM, et al (2004), “Avian influenza A (H5N1) in 10 patients in Vietnam”, N Engl J Med, 350, pp 117988 48 Uiprasertkul, M., R Kitphati, P Puthavathana, R Kriwong, A Kongchanagul, K Ungchusak, S Angkasekwinai, K Chokephaibulkit, K Srisook, N Vanprapar, and P Auewarakul (2007), “Apoptosis and pathogenesis of avian influenza A (H5N1) virus in humans”, Emerg Infect Dis, 13(5): p 708-712 49 WHO inter-country-consultation, influenza A/H5N1 in humans in Asia: Manila, Philippines, 6-7 May 2005 50 World Health Organization (2009), Continuing progress towards a unified nomenclature system for the highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses 51 Xu C, Dong L, Xin L, Lan Y, Chen Y, Yang L, Shu Y (2009), “Human avian influenza A (H5N1) virus infection in China”, Science, 52, pp 407–11 52 Yamada S, Suzuki Y, Suzuki T, Le MQ, Nidom CA, Sakai-Tagawa Y, Muramoto Y, Ito M, Kiso M, Horimoto T, Shinya K, Sawada T, Kiso M, Usui T, Murata T, Lin Y, Hay A, Haire LF, Stevens DJ, Russell RJ, Gamblin SJ, Skehel JJ, Kawaoka Y (2006), “Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A viruses human-type receptors”, Nature, 444(7117): 378-382 72 Chương 1.2.1 2.2.2 Triệu KỹTỔNG thuật chứng lấy QUAN nhiễm mẫu, bảo cúmquản A/H5N1 16 vận chuyển mẫu 28 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 1.1.1 Phân loại học danh pháp MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.1.2 Hình thái cấu trúc virus cúm A/H5N1 1.1.3 Hệ gen protein virus A/H5N1 1.1.4 Chu trình tái virus cúm A/H5N1 1.1.5 Hiện tượng biến đổi kháng nguyên virus cúm A 11 1.1.6 Khả thích ứng vật chủ virus cúm A 12 1.1.7 Độc lực khả gây bệnh virus cúm A/H5N1 14 1.1.8 Sức đề kháng virus cúm A .15 1.2 CHẨN ĐOÁN, ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1 16 1.2.2 Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán nhiễm cúm A/H5N1 17 1.2.3 Điều trị nhiễm cúm A/H5N1 người .23 1.2.4 Kiểm sốt lây nhiễm dự phòng 24 1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VIRUS CÚM A/H5N1 Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI 25 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27 2.1.1 Mẫu vật 27 2.1.2 Hóa chất 27 2.1.3 Thiết bị 28 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.2.1 Chọn mẫu 28 2.2.3 Tách chiết RNA mẫu bệnh phẩm 29 2.2.4 Thiết kế mồi 30 2.2.5 Tối ưu phản ứng RT-PCR phát gen M, HA NA 32 2.2.6 Tối ưu phản ứng Multiplex RT-PCR phát virus A/H5N1 .38 2.2.7 Thử nghiệm phản ứng Multiplex RT-PCR mẫu bệnh phẩm 40 2.2.8 Điện di phân tích kết 41 73 3.1.3 Thiết 3.3.3 Tối ưukếthời mồigian đặc kéo hiệudài chochuỗi 57 gen NA virus cúm A/H5N1 45 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Thiết kế mồi 43 3.1.1 Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen M virus cúm A 43 3.1.2 Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen HA virus cúm A/H5N1 44 3.2 Tối ưu phản ứng RT-PCR phát gen M, HA NA 47 3.2.1 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi 47 3.2.2 Tối ưu nồng độ mồi 49 3.2.3 Tối ưu thời gian kéo dài chuỗi 50 3.2.4 Đánh giá độ nhạy phản ứng RT-PCR 51 3.2.5 Đánh giá độ đặc hiệu phản ứng RT-PCR 53 3.3 Tối ưu phản ứng multiplex RT-PCR phát virus A/H5N1 56 3.3.1 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi 56 3.3.2 Tối ưu nồng độ mồi 56 3.3.4 Tối ưu số chu kỳ phản ứng .58 3.3.5 Đánh giá độ nhạy phản ứng multiplex RT-PCR .59 3.3.6 Đánh giá độ đặc hiệu phản ứng multiplex RT-PCR 59 3.4 Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR phát virus A/H5N1 mẫu bệnh phẩm 61 Kết luận 67 Kiến nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 74 ... dụng kỹ thuật chẩn đốn cúm A /H5N1 Chính vậy, chúng tơi thực Nghiên cứu xây dựng quy trình phát nhanh virus cúm gia cầm A /H5N1 mẫu bệnh phẩm kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain. .. dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR, cho phép chẩn đoán xác định cúm A /H5N1 với phản ứng RT-PCR thay phải làm ba phản ứng RT-PCR Tuy nhiên, việc nghiên cứu thiết kế xây dựng quy trình thực kỹ thuật multiplex. .. nghiệm phải nhanh [34] Các kỹ thuật xét nghiệm áp dụng chẩn đốn virus cúm A /H5N1 bao gồm: phân lập virus; phát kháng nguyên; phát RNA virus kỹ thuật RT-PCR, realtime RT-PCR phát tăng hiệu giá kháng