Phát hiện và phân biệt chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn bằng phương pháp multiplex RT PCR (reverse transcription polymerase chain reaction)

So sánh trình tự amino acid GP4 của dòng virus trên có gây đáp ứng miễn dịch với kháng thể đơn dòng đặc hiệu GP4 phát hiện thấy xuất hiện các đột biến thay thế amino acid trong vùng epit

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ THU

PHÁT HIỆN VÀ PHÂN BIỆT CHỦNG VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX RT-PCR (REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2013

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

PHÁT HIỆN VÀ PHÂN BIỆT CHỦNG VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX RT-PCR (REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION)

Chuyên ngành : Động Vật Học

Mã số : 60 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ DIỆU THÚY

Hà Nội – 2013

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả nêu trong Luận văn chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác Các số liệu, ví dụ và trích dẫn trong Luận văn đảm bảo tính chính xác, tin cậy và trung thực Tôi đã hoàn thành tất cả các môn học và đã thanh toán tất cả các nghĩa vụ tài chính theo quy định của Phòng Đào tạo sau Đại học, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật

Vậy tôi viết Lời cam đoan này đề nghị Phòng Đào tạo sau Đại học, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật xem xét để tôi có thể bảo vệ Luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

NGƯỜI CAM ĐOAN

Nguyễn Thị Thu

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Diệu

Thúy, Phó trưởng phòng Công nghệ gen động vật, Viện Công nghệ Sinh học,

Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ chỉ bảo tận tình về chuyên môn và sự động viên chân thành của tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ gen động vật, Viện Công nghệ sinh học

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, các Cô Phòng Đào tạo sau đại học - Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày… tháng … năm 2013

Học Viên

Trang 5

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN IV MỤC LỤC V DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT VI DANH MỤC CÁC BẢNG VIII DANH MỤC CÁC HÌNH IX

MỞ ĐẦU 1

NỘI DUNG 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khái quát về hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS - Porcine reproductive and respiratory syndrome) 3

1.1.1 Sự xuất hiện và phát sinh dịch bệnh của bệnh PRRSV 3

1.1.2 Triệu chứng lâm sàng 6

1.1.3 Tác hại của bệnh 7

1.1.4 Đường truyền lây của virus 8

1.2 Tổng quan về virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus) 8

1.2.1 Đặc điểm của virus 8

1.2.2 Cấu trúc virus 9

1.2.3 Chức năng của ORFs 11

1.2.4 Đặc tính vai trò của Protein chức năng N 13

1.3 Các phương pháp phát hiện PRRSV 14

1.3.1.Biểu hiện lâm sàng 14

1.3.2 Phân lập virus 15

1.3.3 Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học 15

1.3.4 Phương pháp chẩn đoán dựa trên nguyên lý PCR (PCR và realtime RT-PCR) 16

1.4 Tình hình nghiên cứu PRRSV trên thế giới và Việt Nam 22

1.4.1 Tình hình nghiên cứu PRRSV trên thế giới 22

1.4.2 Tình hình nghiên cứu PRRSV ở Việt Nam 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29

2.2 Vật liệu nghiên cứu 29

Trang 6

2.2.1 Mồi sử dụng 29

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 30

2.3 Phương pháp nghiên cứu 31

2.3.1 Tách RNA tổng số 31

2.3.2 Phương pháp thiết kế mồi 31

2.3.3 Phương pháp RT-PCR 32

2.3.4 Tinh sạch đoạn ORF7 để giải trình tự 33

2.3.5 Phân tích trình tự gen và amino acid tương ứng của các chủng PRRSV 34

2.3.6 Xác định độ đặc hiệu 34

2.3.7 Xác định độ nhậy 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37

3.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số 37

3.2 Kết quả nhân đoạn gen ORF7 37

3.3 Kết quả giải trình tự đoạn gen ORF7 38

3.3.1 So sánh sự khác nhau về trình tự nucleotide của ORF7 38

3.3.2.2 So sánh sự khác nhau về thành phần amino acid của ORF7 43

3.3.2.3.So sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide và thành phần amino acid của đoạn gen ORF7 46

3.3.2.4 Phân tích cây phả hệ của PRRSV ở đoạn gen ORF7 50

3.4 Thiết kế mồi và kiểm tra độ nhậy của PRRSV 52

3.5 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của PRRSV 54

3.6 Kết quả kiểm tra độ nhậy của PRRSV 55

3.6.1 Kết quả kiểm tra độ nhậy 55

3.6.2 Kết quả chẩn đoán dựa vào phương pháp mRT-PCR 56

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59

Kết luận 59

Đề nghị 59

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC 70

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid

Trang 7

DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic

RNA Ribonucleic acid Axit Ribonucleic

dNTP Deoxyribonucleic acid triphosphate Deoxynucleosit triphotphat

LB Loading buffer Đệm tra mẫu

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase

Multiplex Reverse Transcription

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng nhiều chuỗi đồng phân hóa sao chép ngƣợc

ORF Open reading frame Khung đọc mở

NA North American type Kiểu Bắc Mỹ

EU European type Kiểu Châu Âu

Nsp non-structural protein Protein không cấu trúc

NLS nuclear localization signal Vùng tín hiệu định vị nhân

NoLS nucleolar localization signal Vùng tín hiệu định vị hạch nhân PRRS Porcine Reproductive and

Respiratory Syndrome

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

PRRSV Porcine Reproductive and

Respiratory Syndrome Virus

Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

PCV2 Porcine Circovirus type 2 Virus Ciro loại 2

CSFV Classical swine fever virus Virus sốt cổ điển lợn

RNase Ribonuclease Ribonucleaza

TE Tris boric acid - EDTA Đệm TE

µl Microlitre Mi – cro – lít

Trang 8

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Trình tự mồi dùng để khuếch đại gen 29

Bảng 2.2: Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 30

Bảng 2.3: Các dung dịch đệm cần pha 30

Bảng 2.4: Các các hóa chất sử dụng 31

Bảng 2.5: Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA 32

Bảng 2.6: Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA 32

Bảng 2.7: Chu trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA 33

Bảng 2.8: Thành phần của phản ứng khuếch đại gen ORF7 33

Bảng 2.9: Chu trình phản ứng khuếch đại gen ORF7 33

Bảng 2.10: Danh sách các loại vaccine phòng bệnh PRRS đang lưu hành ở Việt Nam 35

Bảng 2 11: Các mẫu PRRSV phân lập năm 2012, năm 2007 - 2010 và chủng virus JXA1-R 35

Bảng 2.13: Các chủng trên Genbank lựa chọn để so sánh với gen ORF7 36

Bảng 3.1: Tỷ lệ phần trăm tương đồng về trình tự nucleotide (phía trên đường chéo) và thành phần amino acid suy diễn (phía dưới đường chéo) của gen ORF7 47

Bảng 3.2: So sánh mức tương đồng về trình tự nucleotide (nt) và amino acid (aa) (%) của ORF7 ở các mẫu phân lập so với một số chủng đại diện (LV, VR-2332, 07QN, JXA1, CH-1a, IngelvacMLV vaccine, MLV.becta.vaccine, JXA1-R vaccines) 49

Bảng 3.3: Kết quả chẩn đoán 158 mẫu có triệu chứng nhiễm PRRSV phân lập ở VN 57

Trang 9

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Phổi và thận bị xuất huyết của lợn nhiễm PRRSV 6

Hình 1.2 Đại thực bào của tế bào bình thường và tế bào bị nhiễm PRRSV 9

Hình 1.3 Cấu trúc genome PRRSV 9

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết RNA tổng số của mẫu phân lập 37

Hình 3.2 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR gen ORF7 có kích thước 490 bp 38

Hình 3.3 Kết quả so sánh trình tự nucleotide trên đoạn gen ORF7 của các mẫu PRRSV phân lập (trong nước, chủng VR2332 và các chủng phân lập từ vaccine JXA1-R, BSL-PS 100, IngelvacMLV) 41

Hình 3.4 Kết quả so sánh thành phần amino acid trên đoạn gen ORF7 của các mẫu phân lập trong nước, chủng VR2332 và các chủng phân lập từ vaccine JXA1-R, BSL-PS 100, IngelvacMLV 44

Hình 3.5 Cây phân loại di truyền các chủng PRRSV của đoạn gen ORF7 51

Hình 3.6 Sơ đồ bộ mồi thuộc ORF7 của PRRSV có kích thước 245 bp (chủng NA), 161 bp (chủng EU) 52

Hình 3.7 Kiểm tra bộ mồi thiết kế trên vùng gen ORF7 có kích thước 245 bp 53

Hình 3.8 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm multiplex RT-PCR gen ORF7 53

Hình 3.9 Kết quả điện di kiểm tra độ đặc hiệu của các mẫu phân lập với PCV2/CSFV 55

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen ORF7 có kích thước 245 bp của mẫu 1155 ở các nồng độ pha loãng 10 lần (nồng độ ban đầu là 1,87 ng/ µl) 56

Hình 3.11 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm multiplex RT-PCR gen ORF7 sử dụng cặp mồi multiplex có kích thước 245 bp (chủng NA), 161 bp (chủng EU) 56

Trang 10

MỞ ĐẦU

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS - Porcine reproductive and respiratory syndrome) còn gọi là bệnh “tai xanh” là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm xảy ra trên lợn Bệnh gây sảy thai ở lợn nái, rối loạn đường hô hấp trên

lợn sơ sinh và lợn choai, do virus PRRS, thuộc họ Arteriviridae, bộ Nidovirales gây

ra Bệnh xảy ra lần đầu tiên ở Mỹ vào khoảng năm 1987, sau này được tìm thấy ở Châu Âu, và xuất hiện ở Châu Á vào đầu những năm 1990 Cho đến nay, bệnh tai xanh đã lan rộng trên các vùng khắp thế giới với những đặc trưng của từng chủng khác nhau trên từng vùng, gây ra những thiệt hại kinh tế nặng nề hàng năm

PRRS do Arterrivirus gây nên, loại virus này được phân lập và định loại vào

năm 1991 Nó là một virus có áo bao, thuộc loại ARN virus, có kích thước vào khoảng 45 ÷ 80 nm, chịu được nhiệt độ thấp (tồn tại 4 tháng dưới nhiệt độ -700C) Vật chất di truyền của virus PRRS là RNA mạch đơn có kích thước phân tử khoảng

15 kb mã hóa cho protein cấu trúc và protein không cấu trúc Virus PRRS có gồm 2 gen (ORF1a, ORF1b) mã hóa cho các protein không cấu trúc 7 bảy gen (GP1, GP2, GP3, GP4, GP5, M và N) mã hóa cho các protein cấu trúc và chức năng

Virus PRRS có mặt ở Việt Nam từ năm 1994, tuy nhiên từ đầu năm 2007 đến nay đã liên tục gây ra các đại dịch và ảnh hưởng nghiêm trọng đến số lượng và chất lượng đàn lợn Ngay cả khi không có dịch bệnh xuất hiện thì bệnh vẫn tồn tại và lưu hành trong các đàn lợn, gây nhiều thiệt hại về kinh tế Theo thống kê của Cục Thú Y năm 2012, dịch bệnh tai xanh gây thiệt hại nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi lợn, số lợn mắc bệnh là 90.688, tổng số chết là 14.065 con, tổng số lợn phải tiêu hủy là 51.761 con Các nghiên cứu gần đây xác nhận chủng virus PRRS lưu hành tại Việt Nam có quan hệ gần gũi với các chủng virus PRRS độc lực cao đang lưu hành tại Trung Quốc Nghiên cứu về lĩnh vực này tại Việt Nam đã bắt đầu tập trung vào các nghiên cứu về dịch tễ học, bệnh học và miễn dịch học virus PRRS, phát triển các kít chẩn đoán bệnh chính xác, phân biệt chủng virus vaccine và virus thực địa Đánh giá mức độ biến đổi di truyền của các chủng virus PRRS thực địa, so sánh với các chủng vaccine đang lưu hành góp phần khuyến cáo việc sử dụng chủng

Trang 11

vaccine hiệu quả nhằm kiểm soát tốt dịch bệnh, hạn chế tổn thất kinh tế

Thực tế cho thấy, các tác nhân gây bệnh là virus ngày càng có sự biến đổi di truyền cao do đó hình thành nên các biến chủng/dòng khác nhau gây khó khăn cho công tác chẩn đoán bệnh một cách chính xác Cho đến nay, các biện pháp khống chế bệnh được áp dụng ở nhiều nước nhưng vẫn chưa đem lại hiệu quả như mong muốn Phương pháp RT-PCR đã được sử dụng để đồng thời nhận diện, phân biệt nhiều loại virus hoặc các chủng/dòng khác nhau của cùng một loại tác nhân gây bệnh trong cùng một mẫu dựa vào kích thước đoạn gen được khuếch đại Xuất phát

từ thực tiễn và yêu cầu trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Phát hiện và phân biệt chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn bằng phương pháp multiplex RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)”

Mục tiêu:

Giải trình tự toàn bộ vùng gen ORF7 của virus PRRS phân lập tại Việt Nam Phân tích đặc tính di truyền ở mức độ nucleotide và amino acid của các chủng virus PRRS phân lập

So sánh, đánh giá về quan hệ di truyền của các chủng virus PRRS đang lưu hành tại Việt Nam với các chủng virus đã phân lập tại Việt Nam trước đây, các chủng nguyên thủy, các chủng đang lưu hành ở các vùng địa lý khác nhau trong khu vực và trên thế giới, và với các chủng vaccine đang sử dụng

Thiết kế bộ mồi đặc hiệu để nhận biết và phân biệt virus PRRS kiểu gen Bắc

Mỹ và Châu Âu

Nội dung:

Thiết kế cặp mồi đặc hiệu

Tối ưu phương pháp multiplex RT-PCR

Kiểm tra độ nhậy của của cặp mồi sử dụng phương pháp multiplex RT-PCR

Kiểm tra độ đặc hiệu của mẫu nghiên cứu

Kiểm tra trên các mẫu thực địa để nhận biết và phân biệt chủng virus PRRS đang lưu hành

Trang 12

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS - Porcine reproductive and respiratory syndrome)

1.1.1 Sự xuất hiện và phát sinh dịch bệnh của bệnh PRRSV

 Trên thế giới

Bệnh này được mô tả lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1987 [45], sau đó, đến năm

1990 lan đến Châu Âu [74] và sau cùng là Châu Á Ban đầu dựa vào vào các biểu hiện đầu tiên của bệnh và cũng do chưa xác định được căn bệnh mà PRRS được gọi

là “bệnh bí hiểm” sau đó có tên lần lượt như: Hội chứng hô hấp và sẩy thai ở lợn (SIRS – Swine infertility and Respiratory Syndrome), bênh sốt cao, biếng ăn, sảy thai ở lợn (HAAT – Hyperthermie Avortements dé Truies), bệnh tai xanh (blue ear disease) Năm 1992, tổ chức Thú ý thế giới (O.I.E) công nhận tên chính thức là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS)

Ở Mỹ là một quốc gia đầu tiên phát hiện sự có mặt và chịu ảnh hưởng nặng nề của dịch bệnh PRRSV Bệnh xảy ra ở hầu hết quốc gia có chăn nuôi lợn trên toàn thế giới và có tác động rất lớn về mặt kinh tế đối với ngành chăn nuôi Tại Trung Quốc, dịch bệnh PRRS đã xuất hiện trong những năm gần đây và hiện đang còn tồn tại Chủng virus đang lưu hành tại nước này chủ yếu là chủng thuộc dòng Bắc Mỹ, chúng được chia thành hai dạng, gồm chủng cổ điển (gây chết ít lợn mắc bệnh) và chủng độc lực cao (gây chết nhiều lợn nhiễm bệnh) Vào năm 2006 một dạng độc tính cao của virus đã ảnh hưởng đến hơn 2 triệu con lợn và gây ra cái chết của ít nhất 400.000 con lợn từ tháng 6 đến tháng 9 trên 6 tỉnh thành của Trung Quốc

 Tại Việt Nam

PRRSV đã xâm nhập vào Việt Nam từ năm 1994 trên đàn giống lợn nhập từ

Mỹ, tuy nhiên từ thời điểm đó đến năm 2006 hầu như vẫn chưa có thông tin nào về đại dịch [22] Đến đầu năm 2007, diễn biến của dịch tại Việt Nam ngày càng trở nên phức tạp

Trang 13

Dấu ấn quan trọng của dịch PRRS tại Việt Nam được bắt đầu từ 12/3/2007, hàng loạt đàn lợn tại Hải Dương có những biểu hiện ốm khác thường và có những triệu chứng lâm sàng tương tự như bệnh sốt cao ở lợn cái xảy ra ở Trung Quốc trong suốt năm 2006 Ngày 23/3/2007, lần đầu tiên cơ quan thú y tại tỉnh này đã báo cáo cho Cục Thú y, ngay sau đó ngày 26/3/2007, Trung tâm chẩn đoán Thú y Trung ương – Cục Thú y đã tiến hành lấy mẫu xét nghiệm và cho kết quả dương tính với virus PRRS [2] Bệnh ngay lập tức lan nhanh ra 6 tỉnh thành của vành đai sông Hồng là Hưng Yên, Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang với hàng ngàn con lợn bị nhiễm Thời điểm này, dịch bệnh đã tác động đến khoảng 65.000 con lợn và phải tiêu hủy hơn 15.000 con Trong năm 2008 – 2009 dịch bệnh

đã bùng phát trở lại ở cả 3 miền với thiệt hại nặng nề [14]

Theo Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, trong năm 2008 dịch tai xanh

đã xảy ra hai đợt chính tại 953 xã, phường thuộc 99 huyện, thị và thành phố của 25 tỉnh Tổng số lợn mắc bệnh là 308.901 con, số chết, buộc phải tiêu huỷ là 299.988 con: Đợt 1, dịch tập trung chủ yếu tại các tỉnh miền Bắc Trung bộ Do phát hiện chậm, không kiểm soát được việc vận chuyển lợn, thú y âm thầm chữa trị lợn bệnh

và không báo cáo nên dịch đã đồng loạt xuất hiện tại nhiều địa phương, rồi lây lan rất nhanh ra các địa phương lân cận Hậu quả là hàng trăm nghìn con lợn đã mắc bệnh, phải tiêu huỷ tại gần 1.000 xã, phường và thị trấn trong khoảng thời gian ngắn; Đợt 2, dịch xuất hiện rải rác tại nhiều địa phương ở cả 3 miền (Bắc, Trung và Nam) Do triển khai áp dụng đồng bộ nhiều biện pháp nên dịch được khống chế ở phạm vi và quy mô nhỏ hẹp hơn đợt 1 (trừ Quảng Trị) [3]

Năm 2009, dịch xảy ra ở 69 xã thuộc 26 huyện của 13 tỉnh, thành phố: Bến Tre, Bình Dương, Đồng Nai, Tiền Giang, Vĩnh Long, Hưng Yên, Quảng Ninh, Bắc Giang, Quảng Nam, Gia Lai, Bạc Liêu, Bà Rịa - Vũng Tầu và Đắk Lắk với 7.030 lợn mắc bệnh và 5.847 lợn buộc phải tiêu huỷ [4]

Trong năm 2010, dịch bệnh heo tai xanh có nhiều diễn biến phức tạp, dịch

xảy ra trên diện rộng từ miền Bắc - Trung - Nam dịch xảy ra hai đợt dịch lớn: Đợt 1/2010 (miền Bắc) Dịch lợn tai xanh xảy ra từ ngày 23/3/2010 tại Hải Dương Tính

đến hết tháng 6/2010, toàn quốc ghi nhận các ổ dịch tai xanh tại 461 xã, phường, thị

Trang 14

trấn của 71 quận, huyện thuộc 16 tỉnh, thành phố gồm Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Hà Nội, Nam Định, Hà Nam, Nghệ An, Quảng Ninh, Hòa Bình, Cao Bằng, Sơn La Tổng số lợn

mắc bệnh là 146.051 con trong đó số tiêu hủy là 65.911 con; Đợt 2/2010 (miền Trung và miền Nam): Đợt dịch này bắt đầu từ ngày 11/6/2010 tại Sóc Trăng Sau đó

dịch xuất hiện tại Tiền Giang (ngày 19/6), Bình Dương (ngày 27/6), Long An (ngày 15/7), Lào Cai (11/7), Quảng Trị (01/7) Trong đợt dịch này, toàn quốc ghi nhận các

ổ dịch tai xanh tại 42.080 hộ chăn nuôi của 1.517 xã, phường, thị trấn thuộc 215 quận, huyện của 36 tỉnh, thành phố Tổng số lợn trong đàn mắc bệnh là 970.857 con, số mắc bệnh là 717.830 con, trong đó số chết, tiêu hủy là 413.540 con [5]

Năm 2011, dịch tai xanh xảy ra hai đợt, tuy nhiên số ổ dịch và số lợn mắc bệnh, số lợn bị tiêu hủy giảm rất nhiều (gần 20 lần cả về phạm vi, quy mô dịch và

số lượng gia súc phải tiêu hủy) so với năm 2010 Đợt 1: Tổng số lợn mắc bệnh là

14.759 con trong đó có 1.468 con lợn nái, 5.346 con lợn thịt và 7.665 con lợn con; tổng số lợn phải tiêu hủy là 14.158 con trong đó 1.373 con lợn nái, 4.850 con lợn

thịt và 7.581 con lợn con; Đợt 2: Tổng số lợn mắc bệnh là 27.558 con trên tổng đàn

46.328 con của các tỉnh có dịch, số lợn phải tiêu hủy là 12.361con [6]

Tính từ đầu năm đến 25 tháng 12 năm 2012 toàn quốc ghi nhận các ổ dịch tai xanh tại 453 xã/phường, thị trấn của 95 quận/ huyện thuộc 28 tỉnh Tổng số lợn mắc bệnh là 90.688 con, tổng số chết là 14.065 con, tổng số lợn phải tiêu hủy là 51.761 con Qua giám sát diễn biến của từng ổ dịch theo từng tháng của năm, có thể thấy rằng dịch bắt đầu xuất hiện lẻ tẻ vào đầu tháng 1 đến cuối tháng 3, sau đó phát triển lây lan trên diện rộng trong giai đoạn tháng 4 đến cuối tháng 7 [7]

Năm 2013 dịch lợn tai xanh tuy không bùng phát mạnh nhưng vẫn xuất hiện rải rác tại một vài tỉnh trong khoảng thời gian từ tháng 2 đến tháng 5 đã làm chết và tiêu hủy hơn 6.000 con lợn Dịch lợn tai xanh: Xuất hiện tại 9 tỉnh là Long An, Quảng Nam, Quảng Trị, Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Nam Định, Bắc Ninh và Thái Bình trong 6 tháng đầu năm Tính đến ngày 22/6/2013 cả nước không còn tỉnh nào có dịch lợn tai xanh chưa qua 21 ngày [8]

Trang 15

1.1.2 Triệu chứng lâm sàng

Dấu hiệu lâm sàng có thể được quan sát hoặc trong đàn giống hoặc trong đàn thịt hoặc cả hai nhưng trong đàn thịt các bệnh khác có lẽ làm che mất sự nhiễm mầm bệnh chính và làm khó phát hiện hơn Căn cứ vào sự biểu hiện các triệu chứng của bệnh, người ta có thể chia thành hai giai đoạn khác nhau: Giai đoạn 1 là biểu hiện các triệu chứng rối loạn sinh sản đối với lợn nái và giai đoạn hai là sự biểu hiện của các triệu chứng hô hấp Trong khoảng 6-12 tuần sẽ có biểu hiện bệnh trong đàn lợn

Các triệu chứng trong giai đoạn 1 hay các triệu chứng sinh sản bao gồm: Sốt 39-40oC, bỏ ăn, mệt mỏi, giảm tỷ lệ thụ thai và số con đẻ ra, sảy thai (tỷ lệ này có thể đến 50 % trong các đàn mới bị nhiễm virus), giảm tiết sữa hoặc mất sữa hoàn toàn, thai khô (thai gỗ), chết thai, đẻ non, chậm động dục hoặc không động dục trở lại, rối loạn sinh sản có thể kéo dài đến vài tháng Giai đoạn biểu hiện các triệu chứng hô hấp: Loạn hô hấp, lợn biểu hiện đau khi thở Các triệu chứng ở lợn con:

Tỷ lệ chết trước cai sữa cao, lợn gày yếu, bỏ ăn

Các triệu chứng thuộc giai đoạn 2 ở lợn con: Hắt hơi, tăng tần số hô hấp, thở khó, thở đứt quãng, gày, yếu, phù mắt, các nốt phồng rộp trên da, ỉa chảy, đi không vững và run, đứng choãi chân Lợn lớn có các biểu hiện sốt nhẹ, bỏ ăn Các triệu chứng khác nhẹ hơn Lợn đực giống có các biểu hiện giảm hưng phấn, giảm thể tích

và chất lượng tinh dịch (hình thái, hoạt lực và nồng độ tinh trùng)

Hình 1.1 Phổi và thận bị xuất huyết của lợn nhiễm PRRSV [18]

Sự biểu hiện lâm sàng của bệnh trên lợn là thân nhiệt cao, ốm và suy nhược,

Trang 16

lợn mắc bệnh với biểu hiện run rẩy, co giật, triệu chứng khập khễnh và phát ban đỏ

ở tai, triệu chứng nổi mụn nhọt và xuất huyết da, lợn nái chết do bệnh, hay triệu chứng sảy thai, chết lưu, lợn con đẻ ra yếu Ngoài ra, Tiến hành kiểm tra những con lợn bị ảnh hưởng thể hiện các biểu hiện lâm sàng của bệnh sốt cao, và run rẩy nội tạng của chúng bị tổn thương nghiêm trọng, ví dụ, điểm máu trong thận và xuất huyết trong phổi kết quả tương tự như những gì quan sát thấy trong năm 2006 dịch tai xanh bùng phát ở Trung Quốc

Trong hầu hết các trường hợp, thời gian ủ bệnh có thể lên đến 5 ngày với các dấu hiệu về sinh sản 2 – 4 tuần sau đó Có nhiều yếu tố liên quan đặc biệt: loại đàn (tình trạng sức khỏe tốt, tập quán); mật độ đàn trong vùng có thể góp phần lây lan bệnh qua đường không khí; mật độ đàn và cách quản lý trong trại; môi trường và quan trọng nhất là bệnh đã xuất hiện trước đó

1.1.3 Tác hại của bệnh

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, lây lan nhanh và gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn Đặc điểm bệnh là gây sảy thai ở lợn nái và rối loạn đường hô hấp trên lợn sơ sinh và lợn nhỡ Trong cơ thể, virus tấn công vào đại thực bào (đặc biệt là đại thực bào hoạt động ở phổi), gia tăng và phá hủy đại thực bào dẫn đến suy giảm chức năng của hệ thống bảo vệ cơ thể,vì thế, các lợn nhỏ khi bị nhiễm PRRSV sẽ dễ dàng bị chết bởi virus và các tác nhân gây bệnh khác

Lợn nái giai đoạn cạn sữa: Trong tháng đầu tiên khi bị nhiễm virus, lợn biếng ăn từ 7 – 14 ngày (10 – 15 % đàn), sốt 39 – 40oC, sảy thai thường vào giai đoạn cuối (1 – 6 %), tai chuyển màu xanh trong khoảng thời gian ngắn (2 %), đẻ non (10 – 15 %), động đực giả (3 – 5 tuần sau khi thụ tinh), đình dục hoặc chậm động dục trở lại sau khi đẻ, ho và có dấu hiệu của viêm phổi

Lợn nái giai đoạn đẻ và nuôi con: Biếng ăn, lười uống nước, mất sữa và viêm

vú (triệu chứng điển hình), đẻ sớm khoảng 2 – 3 ngày, da biến màu, lờ đờ hoặc hôn

mê, thai gỗ (10 – 15 % thai chết trong 3 – 4 tuần cuối của thai kỳ), lợn con chết ngay sau khi sinh (30 %), lợn con yếu, tai chuyển màu xanh (khoảng dưới 5 %) và duy trì trong vài giờ Pha cấp tính này kéo dài trong đàn tới 6 tuần, điển hình là đẻ

Trang 17

non, tăng tỷ lệ thai chết hoặc yếu, tăng số thai gỗ, chết lưu trong giai đoạn 3 tuần cuối trước khi sinh, ở một vài đàn con số này có thể tới 30 % tổng số lợn con sinh ra

Lợn đực giống: Bỏ ăn, sốt, đờ đẫn hoặc hôn mê, giảm hưng phấn hoặc mất tính dục, lượng tinh dịch ít, chất lượng tinh kém và cho lợn con sinh ra nhỏ

Lợn con theo mẹ: Thể trạng gầy yếu, nhanh chóng rơi vào trạng thái tụt đường huyết do không bú được, mắt có dử màu nâu, tiêu chảy nhiều, giảm số lợn con sống sót, tăng nguy cơ mắc các bệnh về hô hấp, chân choãi ra, đi run rẩy

Lợn con cai sữa và lợn nhỡ: Chán ăn, ho nhẹ, lông xác xơ Ngoài ra, trong trường hợp ghép với bệnh khác có thể thấy viêm phổi lan toả cấp tính, thể trạng gầy yếu, da xanh, tiêu chảy, ho nhẹ, hắt hơi, chảy nước mắt, thở nhanh, tỷ lệ chết có thể tới 15 %

1.1.4 Đường truyền lây của virus

Tiếp xúc giữa lợn ốm và lợn khỏe là đường truyền lây chính của bệnh nên bệnh có thể lây giữa các cá thể trong một đàn hay từ đàn này sang đàn khác (nếu lợn

bị bệnh được chuyển đàn, chuyển trại ) Lợn mang virus có thể giải phóng virus trong thời gian 3-4 tháng gây khó khăn cho công tác theo dõi và phát hiện và khống chế bệnh

Tinh dịch lợn mang trùng cũng có khả năng nhiễm virus vì vậy bệnh có thể truyền qua đường sinh dục

Các chất bài tiết như phân, nước tiểu lợn bệnh cũng có khả năng có virus Virus cũng có thể từ lợn bệnh truyền sang lợn khỏe qua các dụng cụ chăn nuôi Virus có mặt trong hạch lâm ba, phổi với số lượng lớn hơn nhiều trong thịt và

có khả năng giữ được độc lực trong điều kiện lạnh (khi giữ thức ăn) Tuy vậy, khả năng truyền bệnh do cho ăn các phụ phẩm trong quá trình giết mổ các gia súc bệnh chưa được xác định Tuy nhiên, tốt hơn hết nên cách ly toàn bộ đàn lợn có nguy cơ với mọi loại nguồn bệnh và không cho ăn các nội tạng từ lợn nghi mắc bệnh

1.2 Tổng quan về virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus)

1.2.1 Đặc điểm của virus

Lúc đầu, người ta cho rằng một số virus như Parvovirus, virus giả dại (Pseudorabies), virus cúm lợn, Porcine enterovirus, đặc biệt virus gây viêm não –

Trang 18

cơ tim (Encephalomyocarditis) gây nên Sau đó, người ta đã xác định được một loại virus mới, được gọi là virus Lelystad phân lập được từ các ổ dịch ở Hà Lan, là

nguyên nhân chính gây ra hội chứng trên Tác nhân gây bệnh là PRRSV thuộc

giống Arterivirus, họ Arteriviridae và bộ Nidovirales [30], có đặc tính thích ứng cao

với đại thực bào, đặc biệt là các đại thực bào phế nang Bình thường, đại thực bào sẽ tiêu diệt tất cả vi khuẩn, virus xâm nhập vào cơ thể, riêng đối với virus PRRS, virus

có thể nhân lên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40

%) Đại thực bào bị giết sẽ làm giảm chức năng của hệ thống bảo vệ cơ thể và làm tăng nguy cơ bị nhiễm các bệnh kế phát

Hình 1.2 Đại thực bào của tế bào bình thường và tế bào bị nhiễm PRRSV

1.2.2 Cấu trúc virus

Hình 1.3 Cấu trúc genome PRRSV

Trang 19

Virus PRRS được biết đến là virus đặc hiệu vật chủ, chỉ lây nhiễm sang vật chủ duy nhất là lợn Tuy nhiên, nó tương đối bền khi ở bên ngoài cơ thể vật chủ, ví dụ: mẫn cảm với nhiệt độ cao, hoặc có thể tồn tại hàng tháng ở nhiệt độ -200C, chịu được trong môi trường pH rộng (<6 và >7,6), chịu đựng lâu trong điều kiện chiếu tia cực tím và bất hoạt bởi một số loại hóa chất Hơn nữa, trong điều kiện độ ẩm, virus PRRS có thể tồn tại đến 11 ngày Chính những đặc tính sinh học này của virus PRRS giúp nó dễ dàng tồn tại và phát tán ra môi trường, gây cản trở cho các biện pháp an toàn sinh học để ngăn ngừa sự lây nhiễm virus

Virus có vỏ bao với vật chất di truyền là RNA sợi đơn, dương, kích thước hệ gen khoảng 15kb bao gồm đầu 5’, đầu 3’ và 9 khung đọc mở (Open reading frame – ORF) Cấu trúc virus bao gồm 2 gen mã hóa cho các protein không cấu trúc (Nsp – non-structure protein) và bảy gen mã hóa cho các protein cấu trúc và chức năng (structure protein gene) ORF1a và ORF1b là các gen mã hóa protein không cấu trúc – chiếm khoảng 75 %, kích thước phân tử nhỏ, có hoạt tính sao chép và polymerase ORF1a được dịch trực tiếp trong khi ORF1b được dịch bởi một khung dịch chuyển ribosomal Bảy ORF còn lại có kích thước phân tử nhỏ hơn, định vị ở đuôi 3’ của hệ gen, mã hóa các protein cấu trúc bao gồm GP1, GP2, GP3, GP4, GP5, M và N

Khi phân tích hệ gen PRRS người ta thấy rằng các khung đọc mở (ORFs) lồng vào nhau từ 1 – 253 bp Ví dụ: khung đọc mở 4 (ORF4) và 5 (ORF5) lồng vào nhau bởi 1 bp, ORF3 và ORF4 lồng vào nhau bởi 253 bp Như vậy, virus sử dụng một phần gen chung để mã hóa cho các protein khác nhau (Hình 1.3)

Giữa các chủng virus PRRS có sự khác biệt di truyền đáng kể, đó là 2 chủng gốc nguyên thủy Châu Âu (loại I, điển hình là virus Lelystad –EU type) và Bắc Mỹ (loại II, virus VR-2332 – NA type) [56], [27] Hai kiểu gen khác nhau – hai biến chủng virus PRRS Bắc Mỹ và châu Âu gây ra các hội chứng lâm sàng tương tự nhau, nhưng chúng thể hiện 2 kiểu gen riêng biệt với khác biệt di truyền khoảng 20-

50 % ở mức độ nucleotide [65] Sự tương đồng giữa 2 chủng trên thể hiện ở sự giống nhau trong trình tự nucleotide giữa các ORF lần lượt là: 57-59 % (ORF7), 70-

81 % (ORF6), 51-59 % (ORF5), 68 % (ORF4), 58 % (ORF3) và 63 % (ORF2) [27],

Trang 20

[51], [52], [53], [57] Và ngay trong cùng một kiểu gen, mức độ khác biệt di truyền cao giữa các chủng virus thực địa (field virus) đang lưu hành tại các vùng địa lý cũng được xác nhận Điều này do đặc tính biến đổi di truyền cao của các chủng virus giúp nó trốn tránh được đáp ứng miễn dịch của vật chủ Gần đây dịch bệnh xảy ra tại một số nước cho thấy sự biến đổi của chủng NA tại một số nước châu Á như Trung Quốc, Việt Nam cho thấy độc lực virus đã có thay đổi đáng kể thể hiện ở việc dịch bệnh xảy ra với tỷ lệ lợn chết cao [38]

1.2.3 Chức năng của ORFs

ORF1a và 1b mã hoá protein enzyme RNA polymerase có chức năng xúc tác sao chép và tổng hợp như các RNA polymerase của các virus RNA khác

ORF2 đến 6 mã hoá cho các protein kết hợp với màng của virus, trong đó đã xác định:

Vỏ (Envelope glycoprotein E, ORF5) có trọng lượng phân tử từ 24-25 kDa là protein liên kết vỏ bọc kết hợp glycogen Các kháng thể trung hoà chủ yếu liên kết trực tiếp với các epitope có trên bề mặt của protein GP5, do vậy virus có thể bị trung hoà Những epitope trung hoà này nằm sát ngay cạnh các vị trí glycosyl hoá Người ta cũng thấy rằng phân tử GP4 và protein M cũng chứa các epitope trung hoà

và phân tử GP3 cũng chứa một epitope trung hoà Mặc dù vậy, những protein này

có tác dụng kích thích miễn dịch và sinh học nhỏ hơn đáng kể so với protein GP5

(Envelop protein), nằm trên bề mặt màng virus, chính là các vị trí tiếp xúc của virus PRRS khi nó nhiễm vào vật chủ Chính

vì thế ORF5 mã hóa cho GP5 có mức độ

[69] Và đó chính là lý do mà GP5 rất được quan tâm nghiên cứu trong việc phân tích dịch tễ học và tiến hóa phân tử, cũng như biến đổi vật liệu di truyền của chủng virus này Thông tin về trình tự DNA, chuyển đổi sang trình tự amino acid giúp cho các phân tích về mô hình cấu trúc protein (amino acid motif) Điển hình là các peptide tín hiệu (signal peptide), vùng ngoại bào virus (extravirion domains), vùng xuyên màng (transmembrane regions) và vùng nội bào virus (intra-viron domains), các điểm trung hòa virus (neutralizing epitope), và những đột biến quan trọng như: R13-Q13, R15-G151 Đây là những motif có vai trò quan trọng làm

Trang 21

thay đổi các yếu tố ảnh hưởng đến độc lực virus 5 được xem

 Nhân (Nucleocapsid protein: N, ORF7) có khối lượng phân tử khoảng 14-15 kDa, đây là protein vỏ bọc nhân, có tính kháng nguyên cao Protein N chiếm khoảng 20-40 % protein của hạt virus

 Phân tích trình tự gen mã hóa protein cấu trúc ở chủng virus PRRS đang lưu hành nhận thấy vị trí glycosyl hóa ở GP3 (vị trí 131) và GP5 (vị trí 51) có vai trò quan trọng trong tính mẫn cảm với kháng thể trung hòa đặc hiệu virus PRRS Thú

vị hơn, hiệu ứng hỗ trợ (synergistic effect) được nhận thấy khi glycosyl hóa được tiến hành đồng thời ở cả GP3 và GP5 Nghiên cứu này khẳng định 1 cách chắc chắn rằng bên cạnh GP5, GP3 có vai trò tham gia vào việc cảm ứng của kháng thể trung hòa virus PRRS [70]

 Các kết quả nghiên cứu trên GP4 của virus Lelystad nguyên thủy chủng virus Châu Âu cho thấy tại các vùng đầu N của GP4 chứa các vị trí có tính quyết định miễn dịch (Immuno dominant) và trung hòa kháng thể (neutralizing epitope) So sánh trình tự amino acid GP4 của dòng virus trên có gây đáp ứng miễn dịch với kháng thể đơn dòng đặc hiệu GP4 phát hiện thấy xuất hiện các đột biến thay thế amino acid trong vùng epitope trung hòa kháng thể [33] Điều này cho phép khẳng định epitope trung hòa kháng thể trên GP4 có đặc tính mẫn cảm với chọn lọc miễn

Trang 22

dịch Das và cs (2009) kết luận rằng hiện tượng glycosyl hóa đầu N của GP2a, GP3

và GP4 là bắt buộc đối với việc tạo ra các virus gây nhiễm và việc tương tác giữa chúng với điểm thụ thể tế bào CD163 Hệ gen virus PRRS cũng giống như các loại virus khác có các mô hình đáp ứng vật chủ khác nhau [35] Trong nghiên cứu của Wang và cs (2010), vai trò của virus PRRS độc lực cao trong các mô hình tương tác

virus – vật chủ khác nhau đã được thử nghiệm in vitro Kết quả chỉ ra sự có mặt của

các điểm quyết định miễn dịch với tế bào T ở vùng protein màng (protein M –

tương ứng với ORF6) của dòng virus HuN4 mang độc lực cao [72]

Các nghiên cứu trên cho thấy với mức độ tham gia khác nhau, các protein chức năng có vai trò trong thành phấn cấu trúc, nhận biết, tương tác và trung hòa kháng thể kháng virus PRRS

1.2.4 Đặc tính vai trò của Protein chức năng N

ORF7 mã hóa cho nucleocapsid protein có kích thước phân tử khoảng –

không glycosyl hóa, không có trong cấu trúc phân

tử, được cấu thành từ 123 hay 128 aa virus PRRS nguyên thủy Bắc ) hay Lelystad ) [50] Nucleocapsid protein (N)

Trang 23

V117A ở các chủng virus PRRS có thể gây ảnh hưởng lớn đến cấu trúc và kháng nguyên của protein N dẫn đến tính gây bệnh cao Rowland và cs, 2003 đã phân tích trình tự nuclecapsid protein của các chủng trên 2 vùng trình tự tín hiệu định vị nhân nằm tại vị trí aa 10-13 (NLS1) và 41-42 (NLS2), vùng này được dự đoán nằm trên vùng mang tính kháng nguyên cao; protein N của virus PRRS nằm trên vùng kị nước, tham gia chức năng dịch chuyển protein N từ nhân vào tế bào chất ở các vị trí amino acid sau 19-30 và 106 -123 [61]

1.3.1.Biểu hiện lâm sàng

Lợn bệnh bị viêm phổi nặng khi xua đuổi thì lợn nhanh mệt, khó thở giống bệnh suyễn, tim đập nhanh, mạnh và lợn dễ bị chết do trụy hô hấp Đa phần lợn ốm, sốt cao trên 400

C, đều có sự phát ban đỏ trên da, đặc biệt là rìa tai và chỏm tai, sau vài ngày rìa tai và chỏm tai có màu xanh tím Một số khác chảy nước mắt dàn dụa

và phát ban đỏ xung quanh mắt, bị tiêu chảy nặng, phân có mùi khó chịu Bệnh tích đặc trưng ở lợn nái là thai bị sảy, lợn con chết yểu hoặc bị chết lưu thai, phổi bị viêm hoại tử, thùy phổi bệnh có màu xám đỏ, có mủ đặc và chắc Trên xác lợn con

bị chết lưu thấy một số đám bị hoại tử thối rữa, lợn con sinh ra nhợt nhạt, chết yểu phương pháp này cho phép chẩn đoán nhanh nhưng kém hiệu quả do một số tác nhân gây bệnh là virus/ vi khuẩn đều có các biểu hiện lâm sàng gần giống nhau

Trang 24

1.3.2 Phân lập virus

Virus PRRS chỉ có thể nhân lên trên hai loại tế bào: đại thực bào túi phôi của lợn (PAMs: pulmonary alveolar macrophage) và dòng tế bào thận khỉ châu Phi Virus thường được phân lập từ nhiều mẫu bệnh có biểu hiện lâm sàng khác nhau bao gồm: huyết thanh, tinh dịch, màng tế bào, máu, tủy xương, hạch nhân, tim, gan, phổi, lá lách… Trong đó dịch thu nhận từ phổi và huyết thanh là những mẫu dùng

để phân lập virus tốt nhất khi có dịch PRRS bùng nổ Môi trường phân lập virus chủ yếu là môi trường MARC-145 Virus được nhận diện và phân loại bằng nhuộm màu miễn dịch với kháng huyết thanh đặc hiệu Việc phân lập thành công virus PRRS phụ thuộc rất nhiều vào tuổi của lợn nhiễm bệnh, điều kiện lấy mẫu, giai đoạn lấy mẫu Phương pháp phâp lập virus có độ đặc hiệu cao nhưng lại rất tốn kém, phức tạp, tiến hành khó khăn, đòi hỏi nhiều thời gian và rất khó để phân lập được chủng virus PRRS dòng EU vì chủng này không sao chép trên tế bào dòng mà chỉ sao chép trên đại thực bào phổi của lợn

1.3.3 Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học

Có nhiều nghiên cứu để pháp hiện các kháng thể trong huyết thanh đối với virus PRRS Phản ứng kháng thể huỳnh quang trực tiếp (indirect fluorescent antibody - IFA); trung hòa virus huyết thanh (serum virus neutralization - SNV); xét nghiệm đơn lớp kỹ thuật ô xy hóa (immunoperoxidase monolayer assay - IMPA) và

kỹ thuật xét nghiệm ELISA (enzyme linked immunosorbent assay - ELISA) tất cả đều có thể được sử dụng cho việc phát hiện kháng thể đặc hiệu với virus PRRS Phản ứng IFA, SNV và ELISA được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các phòng thí nghiệm ở miền nam nước Mỹ trong khi đó, IMPA được sử dụng nhiều hơn ở Châu Âu Yoon và cs trong một nghiên cứu đã cho thấy IFA có độ đặc hiệu cao đến 99,5 % [79] Theo Drew (1995), trong một thử nghiệm so sánh của mình, ông cho rằng IMPA có độ nhậy cao hơn so với ELISA IMPA thường được sử dụng nhằm phát hiện việc nhiễm virus PRRS từ ngày 7 đến ngày 15 sau khi nhiễm Tuy nhiên, IMPA cũng cho kết quả đáng tin cậy đối với việc phát hiện kháng thể đặc hiệu sau hai đến ba tháng nhiễm bệnh [37] Theo Albina và cs (1992) ELISA cho kết quả có

độ đặc hiệu và độ nhậy cao đối với việc phát hiện kháng thể virus PRRS trong huyết

Trang 25

thanh Điều bất lợi của thử nghiệm này là hay cho kết quả dương tính giả [24]

Những kết quả huyết thanh dương tính từ mẫu máu thu nhận từ lợn có biểu hiện lâm sàng đối với virus PRRS thì không đủ cơ sở cho việc chẩn đoán virus PRRS [69], [79] Albina trong một nghiên cứu năm 1994 cho thấy rằng kháng thể truyền từ mẹ được phát hiện trong huyết thanh của lợn con 4 ngày sau khi sinh và không phát hiện thấy ở 3 tuần sau đó [25] Kháng thể đặc hiệu từ mẹ đối với PRRSV tồn tại trong cơ thể lợn con từ 4 đến 10 tuần tuổi và đôi khi tồn tại đến 16 tuần tuổi đối với lợn bú sữa mẹ đã được miễn dịch Vì kháng thể thường không kéo dài trong suốt thời gian sống của lợn và vì sự liên kết trong thời gian ngắn của kháng thể IFA và ELISA, do vậy lợn nhỏ và tốt hơn hết là đàn lợn giống cần được kiểm tra để phát hiện tình trạng nhiễm virus PRRS của đàn [36]

Trần Thị Bích Liên (2008) khi nghiên cứu về dịch PRRS cả Việt Nam và thế giới cũng như những đặc điểm cơ bản về PRRSV Đặc biệt tác giả đưa ra phương pháp chẩn đoán PRRS như phân lập virus bằng phương pháp IPMA, IPMA kết hợp với PCR, phương pháp phát hiện kháng nguyên, kháng thể Kết quả cho thấy để phát hiện kháng thể có hai phương pháp có độ chính xác cao là IPMA và ELISA [19].Năm 2012, Nguyễn Đức Hiền đã nghiên cứu tình hình nhiễm PRRS trong đàn lợn ở Cần Thơ Xét nghiệm cho thấy 290 mẫu huyết thanh lợn chưa tiêm phòng vaccine PRRS bằng phương pháp ELISA cho thấy tỷ lệ nhiễm PRRSV ở lợn nuôi tại thành phố Cần Thơ là 16,90 % [16]

Nhược điểm của phương pháp này có thể cho kết quả dương tính giả, mức độ kháng thể giảm rất nhanh khi thiếu sự tuần hoàn của virus và khó phân biệt được kháng thể của lợn mắc bệnh PRRSV với lợn đã được tiêm vaccine

1.3.4 Phương pháp chẩn đoán dựa trên nguyên lý PCR (RT-PCR và realtime RT-PCR)

Kỹ thuật PCR được phát triển để phát hiện RNA của virus PRRS trong các mẫu bệnh phẩm Vì không cần phải phân lập virus trong môi trường nuôi cấy tế bào nên PCR sẽ ít tốn thời gian để phát hiện hơn so với phương pháp nuôi cấy tế bào PCR còn được xem là một phương pháp có độ nhậy và độ đặc hiệu cao

Phương pháp realtime RT-PCR

Trang 26

Realtime RT-PCR là phương pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn cDNA chuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang Trong phản ứng realtime RT-PCR, quá trình nhân bản cDNA đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp Realtime RT-PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản cDNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang, độ phát quang này

tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành Phương pháp này có độ đặc hiệu cao, chính xác tuy nhiên giá thành của phương pháp tương đối đắt, thiết kế phản ứng khó khăn và đòi hỏi kỹ thuật tay nghề cao và chuyên sâu

Theo Chai và cs (2013) sử dụng phương pháp realtime RT-PCR trong việc phát hiện đồng thời và phát hiện khả năng gây bệnh của 2 loại HP-PRRSV và C-PRRSV trên 319 mẫu thực địa phân lập ở Trung Quốc dựa trên sự bắt màu SYBR Green cùng với phân tích đường cong nóng chảy Kết quả nghiên cứu xác định được nhiệt độ nóng chảy của 2 loại là 82,98 ± 0,25°C và 85,95 ± 0,24°C trong HP-PRRSVs hoặc 82,74 ± 0,26°C trong C-PRRSVs [31] Gerber và cs (2013) khi sử dụng phương pháp realtime RT-PCR để pháp hiện sớm, nhanh sự đa dạng di truyền của các chủng virus PRRS trong mẫu bệnh phẩm thu thập từ: huyết thanh, tinh dịch, máu, nước bọt của những con lợn bị nhiễm bệnh Tiến hành tiêm 1 trong 6 chủng virus PRRS (có sự khác nhau 55 - 99 % về trình tự nucleotide trên vùng gen ORF5) cho sáu nhóm của ba giống lợn âm tính với PRRSV Tỷ lệ phát hiện cao nhất là vào các ngày 3 và 5, mẫu huyết thanh có tỷ lệ phát hiện cao nhất (90 %), tiếp theo là bệnh phẩm máu (p= 0,97) và tinh dịch (p= 0,80) Mẫu nước bọt có tỷ lệ phát hiện thấp nhất, mẫu huyết thanh và máu bệnh phẩm có hiệu suất tốt nhất với tỷ lệ phát hiện cao nhất [39]

Phương pháp RT-PCR

RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) là một phương pháp dùng để khuếch đại cDNA được tạo ra từ RNA dựa vào đặc tính phiên mã ngược, là một kỹ thuật có độ nhậy cao để tìm và định lượng mRNA (RNA thông tin) RT-PCR thường được sử dụng để tạo ra thư viện cDNA lớn từ một lượng rất nhỏ mRNA; sử dụng trong việc nhận biết các đột biến và đa hình dựa vào những trình tự phiên mã ngược và sử dụng trong việc định lượng mức độ biểu hiện của

Trang 27

gene Ngoài ra, RT-PCR còn có một ứng dụng quan trọng nữa đó là chúng được sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh do virus RNA

Nguyên lý: Bước đầu tiên của phản ứng RT-PCR là quá trình phiên mã

ngược từ khuôn mẫu mRNA để tạo ra sợi đơn cDNA Một primer oligodeoxynucleotide sẽ gắn vào mRNA và sau đó chúng sẽ được kéo dài nhờ một enzyme phiên mã ngược có hoạt tính polymerase để tạo thành bản sao cDNA, bản sao này sau đó sẽ được khuếch đại nhờ vào phản ứng PCR ở bước thứ hai Tùy thuộc vào mục đích của xét nghiệm, primer sử dụng để tạo cDNA đầu tiên có thể được thiết kế đặc hiệu để lai vào một vị trí xác định trên mRNA hay có thể được thiết kế để gắn kết vào nhiều vị trí trên mRNA

Hai giai đoạn của kỹ thuật này:

 Giai đoạn thứ nhất: Tổng hợp cDNA

Phiên mã ngược khuôn mẫu RNA thành sợi DNA thứ nhất, sau đó dùng sợi này làm khuôn mẫu để tổng hợp sợi DNA thứ hai

 Giai đoạn thứ hai: Khuếch đại cDNA

Các thành phần cần thiết cho phản ứng nhân PCR: mẫu cDNA mới tổng hợp ở giai đoạn 1, cặp mồi, Enzyme DNA polymerase, dNTP và dung dịch đệm

Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt Đây là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng và thường được thực hiện với các bước sau:

 Tổng hợp, kéo dài chuỗi:

Trang 28

Trong bước này, nhiệt độ được tăng lên ~72o

C, đây là nhiệt độ tối ưu cho chức

năng xúc tác của Taq DNA polymerase Sự tổng hợp DNA được khởi động ở đầu 3’

hydroxyl của mỗi mồi

Ứng dụng của phương pháp dựa trên nguyên lý PCR trong chẩn đoán bệnh PRRS

Nhiều dạng khác nhau của PCR được sử dụng, hầu hết chúng được sử dụng

để phát hiện các vùng ORF7, ORF6, ORF5 hay ORF1b và có thể sử dụng một cách trực tiếp trong việc phân tích các mẫu bệnh phẩm Wang (1994) đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR trực tiếp để phát hiện sự tồn tại của virus PRRS trong lợn thương phẩm và trong tinh dịch của con đực [73] Trong thí nghiệm này với tỉ lệ huyết thanh dương tính chiếm 85,4 % (205/240), nhưng chỉ có 11/140 mẫu máu chứa lượng virus có thể phát hiện được bằng phương pháp RT-PCR Ông đã phát hiện ra sự hiện diện RNA của PRRS virus trong cả hai loại mẫu: tinh dịch và phần chứa tế bào Kết quả của phản ứng PCR giữa các phòng thí nghiệm khác nhau có thể sẽ khác nhau, phụ thuộc vào các điều kiện về mẫu; qui trình thu nhận và trữ mẫu; qui trình chiết tách, tinh sạch; trang thiết bị phòng thí nghiệm; kỹ năng và kinh nghiệm của người thực hiện việc phân tích [32] Wagstrom và cs trong nghiên cứu của mình đã chứng minh

kỹ thuật RT-PCR trực tiếp có khả năng phát hiện RNA virus PRRS với độ đặc hiệu cao (99,4 %) [71]

Nguyễn Ngọc Hải và cs (2007), đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR để phát hiện virus PRRS trong các mẫu huyết thanh, tinh dịch, mô của lợn có kết quả dương tính

và âm tính với kháng thể PRRS khi dùng phương pháp ELISA Tác giả đã không ghi nhận được mối tương quan giữa sự liên hệ của kháng thể kháng PRRS và kết quả dương tính với virus PRRS chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR [13] Trần Thị Bích Liên (2008) đã tổng quát về tình hình dịch PRRS cả Việt Nam và thế giới cũng như những đặc điểm cơ bản về PRRSV Tác giả chỉ rõ để phát hiện kháng nguyên

sử dụng phương pháp RT-PCR là hiệu quả nhất [19] Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan và cs (2012) về chẩn đoán PRRSV của lợn con cai sữa bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại đoạn gen trên vùng ORF7 với kích thước băng DNA tương ướng 392 bp của 10 mẫu bệnh phẩm phân lập từ phổi, hạch phổi, nước mũi,

Trang 29

rử mắt đều cho kết quả dương tính với virus PRRS [18] Nguyễn Bá Hiên (2013) tiến hành nghiên cứu trên 50 mẫu bệnh phẩm của lợn có biểu hiện mắc bệnh bằng phương pháp RT-PCR kết quả thu được 15/50 mẫu dương tính với PRRSV

Giammarioli và cs (2008) đã phát triển và sau đó đánh giá hiệu quả sử dụng phương pháp multiplex RT-PCR trong việc xác định độ đồng nhiễm của các virus trên lợn Kết quả phân tích độ nhậy của phương pháp được kiểm tra trên gel agarose sau khi nhuộm với ethidium bromide cho phép phát hiện nồng độ virus ít nhất là 0,2-200 pcg trong phương pháp single PCR (sPCR) và 20-200 pcg trong mPCR Thí nghiệm được thực hiện trên nồng độ pha loãng 10x của các mẫu có chứa tất cả các virus để xác định giới hạn phát hiện của multiplex RT-PCR Độ nhậy của phương pháp mPCR so với sPCR tương ứng để phát hiện một trong năm loại virus là giống hệt nhau cho CSFV, PCV2 và PPV, cho PRRSV là 101 và ASFV là 102 Không có phản ứng âm tính giả cho 5 loại virus đồng nhiễm trên lợn [40]

Ogawa và cs (2009) đã tiến hành nghiên cứu sử dụng phương pháp multiplex PCR và multiplex RT-PCR để xác định 9 virus ở lợn thường có sự đồng nhiễm cao là: porcine circovirus type 2 (PCV2), suid herpesvirus 1, porcine parvovirus (PPV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), Japanese encephalitis virus, porcine rotavirus A (PoRV-A), porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), transmissible gastroenteritis virus (TGEV) và Getah virus trên 75 mẫu bệnh phẩm phân lập từ thực địa Những kết quả này cho thấy rằng sự kết hợp của phản ứng multiplex PCR và multiplex RT-PCR là hữu ích để xác định nhanh chóng

và chính xác trong chín virus gây bệnh chủ yếu ở lợn [58]

Liu và cs (2011) sử dụng phương pháp multiplex RT-PCR để phát triển và đánh giá khả năng nhiễu nhiều virus cùng một lúc trên lợn Ông tiến hành thiết kế mồi và nghiên cứu 3 loại virus thường đồng nhiễm với kích thước DNA được nhân lên tương ứng 451 bp (PRRS), 343 bp (CSFV), hoặc 163 bp (PTV- porcine teschovirus) Độ nhậy của phương pháp multiplex RT-PCR đối với 3 virus PRRS, CSFV và PTV tương ứng là 2,02 x 10², 2.90 x 10³, và 6.16 x 10³ Trong số 69 mẫu bệnh phẩm từ tỉnh Heilongjiang, Jilin và Henan đồng nhiễm PRRSV và CSFV là 4,4 %, đồng nhiễm PRRSV và PTV là 11,6 %, đồng nhiễm PTV và CSFV là 13,0

Trang 30

%, và đồng nhiễm của ba loại virus là 8,7 % [49]

Wernike và cs (2012) khi tiến hành nghiên cứu so sánh 2 phương pháp xét nghiệm Real time RT-PCR và RT -PCR được sử dụng để chẩn đoán virus PRRS, một thử nghiệm được tiến hành trên toàn Châu Âu Một loạt các chủng virus PRRS phân lập bao gồm cả hai kiểu gen được tiến hành phân tích bởi những người nhà khoa học Sự khác biệt lớn về chất lượng chẩn đoán cũng như phân tích độ nhậy đã được quan sát giữa hai phương pháp RT- qPCR, đặc biệt là trên chủng EU Chưa có một phương pháp nghiên cứu nào có thể xác định xác đúng tất cả các chủng virus PRRS khác nhau với độ nhậy và chẩn đoán tối ưu Sự thay đổi di truyền của các chủng virus PRRS, vốn được cho là cản trở việc chẩn đoán của RT-PCR vì đột biến

ở vị trí gắn mồi, cũng được xác nhận bởi trình tự nucleotide và phân tích phát sinh loài tiếp theo Tóm lại, một vấn đề lớn trong chẩn đoán virus PRRS bằng RT- qPCR

là kết quả âm tính giả Để đạt được độ tin cậy nhất trong việc chẩn đoán phân tử của virus PRRS, việc sử dụng kết hợp các phương pháp là rất cần thiết [76]

Xu và cs (2012) sử dụng phương pháp Uniplex và multiplex RT-PCR, PCR

để phát hiện và đánh giá sự đồng nhiễm của các tác nhân gây bệnh ở lợn Kết quả phát hiện độ nhậy ít nhất 450 pg của DNA hoặc RNA virus từ một hỗn hợp của sáu virus trong phản ứng bằng phương pháp mPCR Mẫu lâm sàng và bào thai (n=30) được thu thập từ những con lợn được 4 – 12 tuần tuổi đã được phát hiện là nhiễm virus trong 39 mẫu kiểm tra bởi cả hai phương pháp uniplex và multiplex PCR, cho thấy

độ nhậy cao Vì vậy độ nhậy và độ đặc hiệu của các phương pháp multiplex RT-PCR là thích hợp cho chẩn đoán lâm sàng của sự đồng nhiễm các virus trên lợn [77]

Schulze và cs (2013) đã sử dụng phương pháp RT-PCR trong nghiên cứu ảnh hưởng PRRSV trên chất lượng tinh dịch của 11 con lợn nhiễm bệnh một cách tự nhiên cho thấy có 36 % mẫu huyết thanh nhiễm kiểu gen Châu Âu Điều tra các dữ liệu sản xuất thường xuyên giữa trước và sau khi nhiễm cho thấy không có sự khác biệt về khối lượng xuất tinh (P = 0,417), nồng độ tinh trùng (P = 0,788), và tỷ lệ tinh trùng di động (P = 0.321) Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn sâu vào một chiến lược kiểm soát khả năng bùng phát virus PRRS trong đàn lợn [63]

Trong nghiên cứu của Wang và cs (2013) sử dụng phương pháp RT-PCR

Trang 31

chứng minh rằng Dipotassium glycyrrhetate (DG) có thể ngăn chặn sự nhân lên của virus PRRS DG có thể được sử dụng như một hóa chất tiềm năng cho việc phòng chống và kiểm soát PRRSV [73]

1.4 Tình hình nghiên cứu PRRSV trên thế giới và Việt Nam

1.4.1 Tình hình nghiên cứu PRRSV trên thế giới

Wenvoort (1991), áp dụng định đề Koch đã khẳng định nguyên nhân của PRRS là do virus, khẳng định có hai dòng virus nguyên mẫu là dòng Châu Âu và dòng Bắc Mỹ gây ra PRRS Tác giả đã đặt tên cho virus gây ra PRRS ở Châu Âu là Lelystad [75]

Benfield (1992), đã mô tả, đặt tên cho virus gây bệnh ở Bắc Mỹ là VR- 2332

và đưa ra đặc tính của PRRSV như sức đề kháng của PRRSV Tác giả khẳng định PRRSV thích hợp ở pH từ 6,5- 7,5 [28]

Saito (1996), đã khẳng định virus gây PRRS có quan hệ họ hàng gần với virus viêm động mạch ngựa, virus tăng enzyme lactate dehydrogenase ở chuột, virus gây sốt xuất huyết ở khỉ Cũng như đưa ra những đặc tính quan trọng của họ Arteriviridae, bộ Nidovirales [62]

Tại Thái Lan năm 1996, Damrongwatanapokin và cs lần đầu tiên đã phân lập được PRRSV Tuy nhiên, có một số nghiên cứu đã khẳng định PRRS lần đầu tiên xuất hiện ở nước này vào năm 1989 [34] Năm 2000, Thanawongnuwech và cs đã tiến hành một nghiên cứu với quy mô rộng lớn và đưa ra kết quả PRRSV từ 137 mẫu phân lập từ nhiều địa phương thuộc nước này gồm cả chủng dòng Châu Âu và dòng Bắc Mỹ Trong đó, virus thuộc chủng dòng Bắc Mỹ chiếm 33,58 %, dòng Châu Âu chiếm 66,42 % Mengeling và cs (1996, 1998) nghiên cứu về vaccine chống lại PRRSV Khẳng định virus vaccine kích thích đáp ứng miễn dịch chậm, virus vaccine có thể truyền qua nhau thai, truyền từ con được tiêm vaccine sang con không tiêm vaccine Đến năm 2009, Amonsnin và cs đã phân tích trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen của chủng PRRSV thu từ đợt dịch bệnh năm 2001 tại Thái Lan Kết quả cho thấy kích thước phân tử của hệ gen chủng PRRSV dòng châu

Âu (EU) và dòng Bắc Mỹ (NA) tương ứng là 14.934 và 15.412 nucleotide Cũng giống như các nhà nghiên cứu trước đây về cấu trúc hệ gen PRRSV, hệ gen của

Trang 32

virus PRRS Thái bao gồm: 2 vùng không phiên mã (đầu 5’- và đuôi 3’-), 8 ORF, trong đó 2 gen không cấu trúc là ORF1a và ORF1b (Nsp – Nonstructure protein) và ORF2 – 7 là các gen mã hoá protein cấu trúc Dựa trên trình tự hệ gen, cây phả hệ di truyền cho thấy trong 2 chủng PRRSV thì 1 thuộc về dòng châu Âu và 1 thuộc về dòng Bắc Mỹ So sánh trình tự toàn bộ hệ gen của 2 chủng virus PRRS phân lập tại Thái Lan với các chủng có nguồn gốc châu Âu, Bắc Mỹ cung cấp thông tin quý giá cho việc đánh giá mức độ biến đổi di truyền và tiến hoá phân tử của các chủng này,

cụ thể là: chủng virus 0INPI được cho là có nguồn gốc từ virus vaccine nhưng tại thời điểm năm 2001 thì vaccine US – MVL (Modified live virus) chưa có mặt tại thị trường Thái Lan, vì thế lý do của việc lưu hành chủng virus 0INP1 có thể là do sự

có mặt của PRRSV trong lợn giống hoặc tinh trùng nhập khẩu từ Mỹ

Yoon và cs (1995), đã nghiên cứu về quá trình đáp ứng miễn dịch của lợn khi

cơ thể lợn nhiễm PRRSV Các tác giả đã khẳng định kháng thể IgM xuất hiện vào ngày thứ 7 và ngày thứ 14 IgG xuất hiện sau khi nhiễm PRRSV Kháng thể trung hoà xuất hiện vào 4- 5 tuần sau nhiễm PRRSV và đạt tối đa vào lúc 10 tuần, miễn dịch kéo dài khoảng 1 năm [79]

Năm 2005, Indik và cs đã đưa ra bằng chứng về sự có mặt của chủng PRRSV dòng Bắc Mỹ ở Áo ở mức độ phân tử Không giống như nhiều nước khác, chủng vaccine dòng Bắc Mỹ chưa được phép nhập vào Áo, vì thế lý do duy nhất để giải thích sự có mặt của chủng virus PRRS dòng Bắc Mỹ ở Áo là do việc nhập lợn

đã được tiêm vaccine chủng virus Bắc Mỹ Nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của các phân tích chi tiết trình tự gen của các biến thể di truyền virus PRRS đang lưu hành ở từng khu vùng, khu vực [44]

Han và cs (2006) đã khẳng định, về mặt di truyền học và tính kháng nguyên của hai loại virus Lelystad và VR- 2332 hoàn toàn khác nhau, nếu chúng xuất phát

từ một tổ tiên thì chúng được tiến hoá theo hai hướng khác nhau Hai virus này đã trở thành hai dòng virus nguyên mẫu, dòng Châu Âu (virus Lelystad) và dòng Bắc

Mỹ (VR2332) [42]

Tại Trung Quốc, một căn bệnh bí hiểm đã xảy ra còn được gọi là bệnh sốt cao vào năm 2006 và người ta thấy có dấu hiệu của PRRS Căn bệnh này đã lan

Trang 33

rộng ra hơn 10 tỉnh và tấn công 2.000.000 lợn, gây chết 400.000 lợn Không giống với PRRS điển hình, căn bệnh bí hiểm này xảy ra trên lợn lớn với dấu hiệu sốt cao,

và một số triệu chứng như dịch tả lợn Khi phân tích hệ gen, người ta thấy các PRRSV phân lập được thuộc nhóm II và tương đồng rất cao với chủng HB-1, một chủng PRRS của Trung quốc (96,5 %) [48]

Năm 2006, Pesente và cs đã nhận xét trình tự nucleotide ORF5 và ORF7 của chủng virus PRRS phân lập tại các trại lợn ở miền bắc Italia cung cấp các thông tin giá trị cho việc đánh giá dịch tễ học và phát tán virus Kết quả so sánh trình tự nucleotide các dòng virus PRRS đại diện đang lưu hành cho thấy đa hình di truyền lớn trong trình tự ORF5 và ORF7, và cây phả hệ cũng bộc lộ khác biệt di truyền lớn giữa các chủng virus nghiên cứu Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đây của Stadejek và cs năm 2002 khi phân tích các vùng biến đổi trong thành phần amino acid của ORF5 và ORF7 [59]

Năm 2009, Kim và cs đã giải trình tự nucleotide GP5 của virus PPRS phân lập tại Hàn Quốc năm 2007 – 2008 Kết quả cho thấy sự khác biệt di truyền tương đối cao (1,3 – 12,9 %) giữa chủng virus đang lưu hành so với chủng virus vaccine (Modified live virus) Cây phân loại di truyền cũng cho thấy biến đổi di truyền giữa các chủng tăng theo thời gian từ 1997 – 2008 Vì thế tác giả khuyến cáo cần có đề xuất trong việc lựa chọn loại vaccine thích hợp hơn nhằm khống chế bệnh PRRSV hiệu quả mặc dù chủng vaccine đang sử dụng đã và vẫn có tác dụng tốt trong việc làm giảm các tín hiệu lâm sàng của bệnh cũng như cải thiện giá trị tăng trọng trung bình ngày của đàn lợn tại các trại nhiễm PRRSV [46]

Vào năm 2010, Shi và cs đã dựa trên sự phân tích di truyền của 8.624 trình

tự ORF5 để xây dựng nên một bức tranh toàn diện về sự đa dạng di truyền của PRRSV loại 2, đồng thời phân chia các chủng hiện có thành 9 lineage và và các sublineage cho mỗi lineage Trong nghiên cứu này còn bao gồm cả các lingeage chưa từng được công bố trước đây Hệ thống phân loại của Shi là một trong những

hệ thống đầy đủ và đáng tin cậy nhất, làm cơ sở để so sánh và phân tích cho các nghiên cứu sau này Hơn 85 % tất cả các trình tự rơi vào 4 lineage lớn bao gồm linegae số 9 (2.800 mẫu), lineage số 1 (2.000 mẫu), lineage số 5 (1.500 mẫu) và

Trang 34

lineage số 8 (1.400 mẫu) trong khi các mẫu còn lại rơi vào 5 lineage với kích thước mẫu gần tương đương khoảng từ 14 cho đến 115 mẫu Chủ yếu các trình tự của các dòng quốc tế rơi vào lineage số 5 Một vài trình tự của Thái Lan và của Canada thuộc lineage số 1 Dòng độc lực cao của Trung Quốc thuộc lineage số 8 Một vài mẫu từ Ý thuộc về lineage số 8 và số 9 Các chủng vacccine đang sử dụng hiện nay cũng được phân tích Vaccine MLV (Boehringer Ingelheim, Germany) và chủng gốc VR – 2332 thuộc sublineage só 5.1 tương tự như phần lớn các mẫu của các trình tự trên thế giới Vacccine dòng ATP (Boehringer Ingelheim, Germany) thuộc

về sublineage 8.9 Vaccine dòng PrimePac và Neb-1 thuộc về lineage số 7 Chủng

có độc lực cao ở Trung Quốc thuộc vào sublineage số 8.7 Mangshi và cs cũng đã đưa

ra dự đoán các chủng có độc lực cao này không bắt nguồn từ một lineage chưa được biết trước đó mà bắt nguồn từ lineage số 8 đã lưu hành ở Trung Quốc 10 năm trước khi bùng nổ dịch vào năm 2006 [64]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu PRRSV ở Việt Nam

Năm 1997 Việt Nam nhập 51 lợn giống từ Mỹ khi kiểm tra có 10/ 51 con có huyết thanh dương tính với PRRSV Từ năm 1997 đến 2006 có rất nhiều tác giả trong nước nghiên cứu về hội chứng PRRS nhưng chỉ dừng lại ở điều tra, giám sát tỷ lệ lưu hành huyết thanh Bắt đầu từ tháng 3 năm 2007, khi các ổ dịch lâm sàng PRRS bùng

nổ thì việc nghiên cứu về bệnh ở Việt Nam mới được triển khai toàn diện

Tô Long Thành (2007), đã trình bày một cách tổng hợp về hội chứng PRRS nói chung, khẳng định lợn các lứa tuổi đều mắc, nhưng nặng nhất ở lợn nái và lợn con Tác giả đã đưa ra biện pháp phòng hội chứng PRRS, trong đó nhấn mạnh việc phòng PRRS bằng vaccine

Khi lợn mắc PRRS không chỉ có những bệnh tích đặc trưng nhất của PRRS

là ở phổi và hạch lâm ba, mà còn có những bệnh tích khác do vi khuẩn kế phát gây

ra Những vi khuẩn kế phát ở đường phổi thường gặp là Mycoplasma hyopneumoniae (suyễn lợn), Pasteurella multocida (tụ huyết trùng), Streptococcus suis type 2 (liên cầu khuẩn type 2), Bordetella bronchiseptica (viêm teo mũi) và Haemophilus parasuis (viêm đường hô hấp) Bùi Quang Anh và cs (2007) Theo kết quả nghiên cứu của Viện Thú y Quốc gia do tác giả Cù Hữu Phú thực hiện cho thấy,

Trang 35

các bệnh nhiễm trùng kế phát thường gặp ở lợn mắc bệnh tai xanh gồm: Tụ huyết trùng, Liên cầu khuẩn và Viêm phổi do vi khuẩn ở lợn [1]

Phạm Ngọc Thạch và cs (2007), nghiên cứu về một số chỉ tiêu lâm sàng và chỉ tiêu máu của lợn mắc PRRS tại Hải Dương và Hưng Yên đã cho thấy, khi lợn mắc PRRS tần số hô hấp, tim mạch, thân nhiệt đều cao hơn sinh lý bình thường, chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá máu thay đổi đặc biệt là số lượng bạch cầu, độ dự trữ kiềm trong máu tăng cao Trong khi hàm lượng protein tổng số, hàm lượng đường huyết lại giảm rõ rệt [21]

Lê Văn Năm (2007), khi khảo sát các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể

ở lợn mắc PRRS tại một số địa phương thuộc Đồng bằng Bắc Bộ - Việt Nam đã thấy rằng các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn mắc PRRS tương tự như các tài liệu trong và ngoài nước công bố Nhưng điểm khác đó là tỷ lệ tiêu chảy, lạc giọng của lợn con theo mẹ cũng như tỷ lệ táo bón ở lợn lớn hơn [20]

Tô Long Thành và cs (2008) đã cho biết năm 2008 số lượng bệnh phẩm lợn mắc PRRS gửi đến Trung tâm chẩn đoán thú y TW nhiều hơn năm 2007, khẳng định những mẫu bệnh phẩm dương tính với PRRS có sự bội nhiễm vi khuẩn Chủng virus độc lực cao của Việt Nam có sự tương đồng về cấu trúc gen với chủng virus độc lực cao của Trung Quốc đến 99 % [23]

Nghiên cứu của Feng và các cộng sự Việt Nam (2009) đã chỉ rõ các biến chủng của PRRSV của Trung Quốc và Việt Nam có bộ gen tương đồng tới 99 % Phân tích di truyền đã cho thấy các chủng virus này đều có sự đứt đoạn amino acid trên protein không cấu trúc NSP2 [9]

Vào năm 2009, Lê Thanh Hoà và cs đã phân tích trình tự gen M (ORF6) cho thấy chủng virus PRRS thu trong đại dịch tại Quảng Nam năm 2007 có trình tự nucleotide tương đồng rất cao (99 %) so với các chủng độc lực cao đang lưu hành tại Trung Quốc, thuộc kiểu gen Bắc Mỹ (với 96 % tương đồng với chủng nguyên thuỷ VR2332), nhưng chỉ có 76 % trình tự tương đồng với chủng cổ điển châu Âu – Lelystad [17]

Vào năm 2010, Võ Khánh Hưng và cs khi phân tích trình tự gen N (ORF7) của các chủng PRRSV phân lập tại Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu và Tp HCM đã

Trang 36

xác nhận các chủng virus PRRS đang lưu hành tại địa phương thuộc dòng châu Mỹ, cùng nhóm với chủng virus độc lực cao của Trung Quốc (tương đồng 98,4 – 99,5 % nucleotide) Đặc biệt, hai chủng phân lập từ Bà Rịa – Vũng Tàu có sự biến đổi di truyền lớn so với các chủng thực địa khác tại các tỉnh thành được nghiên cứu (89,5 – 90,3 % nucleotide tương đồng) và so với chủng vaccine BSL – PS100 (mức tương đồng 91,1 % nucleotide), và tách riêng biệt so với các chủng khác xuất hiện trước đây Kết quả này cho thấy đang có xu hướng biến đổi di truyền của virus PRRS tại một số tỉnh miền Nam Việt Nam cụ thể là ở Bà Rịa – Vũng Tàu Điều này đóng góp vào hiểu biết về dịch tễ học cũng như xu hướng biến đổi di truyền của các chủng virus PRRS tại thực địa và hiệu quả của việc sử dụng vaccine hiện tại ở các tỉnh nói trên Hoàng Thị Thu Hằng và cs (2011) cũng đã nghiên cứu đa dạng di truyền một

số dòng virus PRRS ở Việt Nam dựa vào trình tự amino acid của gen GP5 [13]

Nguyễn Ngọc Hải và cs (2012a) nghiên cứu phân tích và so sánh trình tự GP5 của 6 chủng virus PRRS phân lập tại Tp HCM và Đồng Nai trong năm 2009 cho thấy các chủng virus PRRS lưu hành tại Đồng Nai và Tp HCM thuộc dòng châu Mỹ, cùng nhóm với các chủng virus PRRS độc lực cao của Trung Quốc (98,5 – 99,7 %), và tương đồng 87,9 – 88,6 % so với chủng vaccine đang khuyến cáo sử dụng tại Việt Nam, BSL – PS100 của Bestam Singapo Cũng trong năm này tác giả

và cs đã sử dụng kỹ thuật nested RT-PCR để xác định kiểu gen của PRRSV nhiễm trên 46 mẫu bệnh phẩm thu được từ các trại chăn nuôi lợn ở TP Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Bắc Giang và Hà Nội Kết quả ghi nhận PRRSV nhiễm trên đàn lợn Việt Nam thuộc kiểu gen Bắc Mỹ với 100 % mẫu dương tính Kiểu gen Châu Âu của PRRSV chỉ chiếm 2,18 % (1/46 mẫu) mẫu xét nghiệm [11], [12]

Theo Nguyễn Thị Lan và cs (2012) khi chẩn đoán bằng kỹ thuật bệnh lý cho thấy các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn sau cai sữa mắc PRRS bao gồm: sốt,

bỏ ăn, khó thở, tím tai Bệnh tích đại thể tập trung chủ yếu ở phổi và hạch lâm ba với hiện tượng viêm là phổ biến Các biến đổi vi thể phổ biến ở phổi với hiện tượng thâm nhiễm tế bào viêm, các cơ quan khác như hạch, lạch, thận cũng xuất hiện các tổn thương vi thể [18]

Nguyễn Bá Hiên (2013) nghiên cứu trên 50 mẫu bệnh phẩm của lợn nghi

Trang 37

bệnh thu thập được, bằng kỹ thuật RT-PCR, đã chẩn đoán chính xác 15 lợn mắc PRRS Các mẫu dương tính này phân lập được virus trên môi trường tế bào Marc-

145 Qua khảo sát đặc tính sinh học và sinh học phân tử của 15 chủng virus PRRS phân lập chọn được 5 chủng có đặc tính sinh học và sinh học phân tử khá ổn định,

có hiệu giá virus cao để phục vụ cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine phòng hội chứng PRRS [15]

Nói chung, cho đến nay ở Việt Nam, các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của virus PRRS chưa được hệ thống, đồng thời thiếu các nghiên cứu sâu về đặc tính mần bệnh, cơ chế đáp ứng miễn dịch của vật chủ với PRRSV qua từng giai đoạn nhiễm bệnh khác nhau, cũng như độc lực học của virus gây bệnh

Trang 38

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian tiến hành: Luận văn được tiến hành từ ngày 02/2012 đến ngày 05/2013

Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ Gen động vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu bệnh phẩm (n=158) mẫu máu, huyết thanh, nhau thai lợn có nguy cơ cao nhiễm virus PRRS được thu thập từ ở một số tỉnh như Điện Biên (n=9); Lâm Đồng (n=67); Cần Thơ, Đồng Tháp, Hậu Giang (n=12); Đồng Nai, TP Hồ Chí Minh (n=58); Bình Dương (n=12) Mẫu bệnh ở phía nam do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam cung cấp

2.2.1 Mồi sử dụng

Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này được chúng tôi thiết kế nhằm mục đích nhân đoạn, giải trình tự ORF7 và kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng Thiết kế

bộ mồi trên vùng gen ORF7 của virus PRRSđể nhận biết và phân biệt 2 kiểu gen

NA (với kích thước 245 bp) và EU (với kích thước 161 bp) Thiết kế cặp mồi nhân đặc hiệu đoạn gen PCV2 (kích thước 387 bp), CSFV (kích thước 342 bp) sử dụng xác định độ đặc hiệu của phương pháp nghiên cứu Các bộ mồi được thiết kế bằng phần mềm Primer 3, thông tin về mồi được trình bày trong bảng 2.1.

Bảng 2.1: Trình tự mồi dùng để khuếch đại gen

Virus Ký hiệu

mồi Trình tự mồi [5’ – 3’]

Ta [oC]

Kích thước sản phẩm PCR [bp]

55

53

54

PRRSV 1 dùng cho phản ứng multiplex RT-PCR, PRRSV 2 dùng cho tách dòng và đọc trình tự toàn bộ gen ORF7

Trang 39

1 Bộ cối chày sứ Việt Nam

2 Cân phân tích Mettler (Đức)

3 Đèn chiếu tia UV Probe Shimadzu (Nhật Bản)

4 Hệ thống chụp ảnh gel Biolads (Mỹ)

5 Hệ thống điện di DNA Mupid - ex (Nhật)

7 Máy chu trình nhiệt PCR Applied Biosystems (Mỹ)

8 Máy PCR – 96 Mastercycler – eppendorf (Mỹ)

9 Bể điện di Mupid-2 plus (Nhật Bản)

10 Nồi khử trùng và tủ sấy Nhật Bản

11 Pipettman, đầu côn các loại Eppendorf (Đức)

12 Tủ cấy vô trùng Sanyo (Nhật Bản)

3 Dung agarose 0.5% dịch Cân 0,5 g agarose hòa tan vào trong 100 ml dung dịch đệm TBE

4 Dung agarose 1 % dịch Cân 1 g agarose hòa tan vào trong 100 ml dung dịch đệm TBE

5 Ethidium bromide (1%) Hoà tan 1 g Ethidium bromide trong 100 ml H2O

6 Đệm PE 40 ml cồn tuyệt đối và 50 ml Buffer PE với ỷ lệ 4:5

Định dạng
Số trang	79
Dung lượng	2,39 MB