Phát hiện mycobacterium tuberculosis kháng isoniazid, rifampin và ethambutol bằng kỹ thuật real time PCR

 TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Học viên: Khổng Thị Minh Ngân PHÁT HIỆN MYCOBACTERIUM TUBERLUCOSIS KHÁNG ISONIAZID, RIFAMPIN VÀ ETHAMBUTOL BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR.    2014  TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Học viên: Khổng Thị Minh Ngân PHÁT HIỆN MYCOBACTERIUM TUBERLUCOSIS KHÁNG ISONIAZID, RIFAMPIN VÀ ETHAMBUTOL BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR.    60 42 40     2014 i MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 3  3  3  4  6 1.2.1 B c ca vi khun lao 7  11 1.3.1 i vi khun lao 11  12 1.3.3  13  16  18  20   21  23 1.4.1 nh ki 23  26  28  31 Chƣơng 2VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41  41  41  42  43  43 ii  44   [3,6,8,10] . 44  46 -time PCR 48  53 Chƣơng 3KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 54  54  54  56 ‎  59  66  68  68  69  70  71   72  73  73  74  74  75  75  76  77  ++ 77 3.6.1  ++  77  ++  78  ++  78 iii  ++  79  79  80  83  87 -  87 g 2-  88 -  89  90 -  91 -  91 -  ethambutol 92 93  93  94  94  94  95   97 CHƢƠNG 4KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 101  101  102 TÀI LIỆU THAM KHẢO 103 iv NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT AFB : Acid Fast Bacilli AMK : amikacin BCG : Bacillus Calmette- CPM : Capreomycin CTCLQG  DNA : Deoxyribonucleic acid DR : Tected Repeat) EMB : Ethambutol ETH : Ethionamide FQs : Fluoroquinolones INH : Isoniazid KM : Kanamycin MDR-TB : Lmultidrug-resistant TB) MIC : Minimum inhibitory concentration MIRU-VNTR : Mycobacterial Interspered Repetitive Units of Variable Number of Tandem Repead MTB : Mycobacterium tuberculosis MTBC : M. tuberculosis complex PCR : Polymerase Chain Reaction PZA : Pyrazinamide RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism RIF : rifampin RNA : ribonucleic acid SM : Streptomycin ST : spoligotyping TB : Tuberculosis WHO  XDR-TB  (extensively drug resistant TB) v DANH MỤC BẢNG ltidrug-resistance) 11 [11,12,26,28] 11  25  25  42  57 -  G  58 --   58 --   58    58  69 ng 2 70  71  72  80  81  82  82  83  84  85   86  87  88  90 g 93 vi DANH MỤC HÌNH [47] 4  Vi[47] 6 1.3.             [33] 10  Neelsen[50] 13 [51] 13  28  30 (GC: growth control) 30  ynucleotid 33 - 36 - 37  48 -time PCR 49                   Annhyb 54         Annhyb 55                   Annhyb 55 56 -  59 -  60   61  -  62 vii    -   (NCBI) 62 -  63    63   64 -  65   -  65 -  66   67    ACC. 67    GTC. 67  68  70  70  71   73                   73                 -GTG) 74                 -ATA) 74 viii  75  76  76  77  ++  77   ++  78  ++  78  ++  79  80   81  81 4 82  83  85  86  87  88  89  91  92  94 [...]... thuật real- time PCR, sử dụng kỹ thuật real- time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở, nhanh, nhạy, chính xác, không lệ thuộc vào các hãng sản xuất kít ở nước ngoài, giá thành rẻ hơn,… nên chúng tôi chọn real- time PCR để phát hiện các đột biến kháng isoniazid, Rifampin và ethambutol trên vi khuẩn lao trong mẫu bệnh phẩm Chính vì những lý do trên nhóm nghiên cứu quyết định thực hiện đề tài: “ Phát hiện Mycobacterium. .. Mycobacterium tuberculosis kháng Isoniazid, Rifampin và Ethambutol bằng kỹ thuật real- time PCR Đề tài nhằm các mục tiêu sau : 1 Xây dựng quy trình real- time PCR phát hiện nhanh các mẫu lao đột biến kháng Isoniazid (đột biến gen katG ở codon 315 AGC-ACC (Ser315Thr)), Rifampin (đột biến gen rpoB ở codon 516 GAC-GTC (Asp516Val)) và Ethambutol (đột biến gen emb tại codon 306 với 2 loại: ATG-GTG (Met306Val) và ATG-ATA(Met306Ile)... tập trung nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng 3 loại thuốcchủ yếu trong điều trị lao là Rifampin, Isoniazid, và Ethambutol Để phát hiện lao đa kháng thuốc có các phương pháp như : làm xét nghiệm nuôi cấy vi trùng lao từ các mẫu bệnh phẩm như đờm, dịch cơ thể… và làm kháng sinh đồ lao Quá trình nuôi cấy vi trùng và thử kháng sinh đồ này mất khoảng 2 đến 3 tháng mới có kết quả Hiện nay, ở Việt Nam... Các phƣơng pháp xác định lao kháng thuốc Phát hiện sớm tính kháng thuốc chính là một trong những ưu tiên trong chương trình kiểm soát bệnh lao Nó cho phép bắt đầu điều trị thích hợp ở những bệnh nhân cũng như giám sát kháng thuốc Phát hiện kháng thuốc bằng phương pháp truyền thống đã được thực hiện dựa trên phát hiện sự phát triển của M tuberculosis với sự có mặt của các kháng sinh Tuy nhiên, do các... WHO năm 2007, tỷ lệ lao kháng đa thuốc là 4,8% Tỷ lệ lao kháng thuốc tiên phát với ít nhất 1 loại thuốc là 17% (từ 0% đến 56,3%), kháng isoniazid là 10,3%, kháng đa thuốc thay đổi từ 0% đến 22,3% Trường hợp kháng thuốc thứ phát: kháng ít nhất 1 loại thuốc là 35%, kháng isoniazid là 27,7%, tỷ lệ kháng đa thuốc là 15,3%, tỷ lệ kháng đa thuốc mở rộng là 7,0% Tại Uzbekistan tỷ lệ đa kháng thuốc lên đến 60,0%,... liệu khác - Lao đa kháng thuốc phổ rộng (XDR-TB): là sự đề kháng với isoniazid và rifampin cộng với fluoroquinolone và ít nhất 1 trong số 3 thuốc chống lao dòng thứ hai dùng đường tiêm (amikacin, kanamycin hoặc capreomycin) Kháng thuốc tiên phát là kháng thuốc xẩy ra ở một bệnh nhân trước đó chưa sử dụng một liệu pháp điều trị chống lao nào, còn kháng thuốc thứ phát là sự phát triển của kháng thuốc trong... cộng đồng dân tộc và các vùng địa lý Tuy nhiên cơ chế kháng thuốc chưa được xác định ở gần 5% các chủng lâm sàng kháng rifampin khi không có đột biến nào được phát hiện ở vùng lõi 81 bp hoặc ở đâu đó trong gen rpoB khi những chủng này được xác nhận tính kháng rifampin bởi xét nghiệm tính mẫn cảm chuẩn, điều này cho thấy một phần nhỏ của các chủng kháng rifampin sẽ không được phát hiện bởi các phương... giúp phát hiện kháng thuốc sớm và nhanh hơn là Hain test (thời gian thực hiện xét nghiệm khoảng 5 ngày) và Xpert MTB/RIF (thời gian thực hiện xét nghiệm khoảng 2 giờ) Tuy nhiên, hai xét nghiệm này có giá thành đắt, và không dùng phổ biến cho mọi bệnh nhân bị lao[5] Hiện nay các tiến bộ trong lĩnh vực công nghệ sinh học đang mang tới rất nhiều lợi ích ứng dụng trong y học Một trong số đó là kỹ thuật real- time. .. việc phát hiện và ngăn chặn sự lan truyền các chủng lao đa kháng thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong điều trị lao hiện nay [29,32] Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao được định nghĩa là sự giảm mức mẫn cảm của Mycobacterium tuberculosis trong in vitro làm cho chúng có sự khác biệt với các chủng dại chưa bao giờ tiếp xúc với thuốc kháng sinh Trong các trường hợp lao kháng thuốc cần phải phân biệt: Lao kháng. .. ở codon 315 AGC-ACC (Ser315Thr) được ghi nhận xuất hiện thường xuyên nhất, là một minh chứng rõ ràng sự cân bằng tốt nhất giữa mất khả năng hoạt hóa [11,24] 1.3.6 Cơ chế tác động của Rifampin và cơ chế kháng Rifampin của vi khuẩn lao * Cơ chế tác động của Rifampin (RIF) : Rifampin được đưa vào sử dụng trong điều trị chống lao vào đầu những năm 1970 và là một thành phần rất quan trọng trong điều trị . Học viên: Khổng Thị Minh Ngân PHÁT HIỆN MYCOBACTERIUM TUBERLUCOSIS KHÁNG ISONIAZID, RIFAMPIN VÀ ETHAMBUTOL BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR.   . Học viên: Khổng Thị Minh Ngân PHÁT HIỆN MYCOBACTERIUM TUBERLUCOSIS KHÁNG ISONIAZID, RIFAMPIN VÀ ETHAMBUTOL BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR.   . trình real-time PCR phát hiện nhanh các mẫu lao đột biến kháng Isoniazid (đột biến gen katG ở codon 315 AGC-ACC (Ser315Thr)), Rifampin (đột biến gen rpoB ở codon 516 GAC-GTC (Asp516Val)) và Ethambutol