* Thiết kế các cặp primer và TaqMan mẫu dò đặc hiệu với các vị trí đột biến kháng isoniazid, Rifampin và ethambutol của MTB bằng phần mềm chuyên dụng và các công cụ trên NCBI và IDT.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 44 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
* Tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng real-time PCR, tiến hành khảo sát các thông số sau: khả năng nhân bản của hệ primer-mẫu dò, nhiệt độ lai, nồng độ primer và mẫu dò, nồng độ Mg2+, độ nhạy của phản ứng, độ đặc hiệu của hệ primer và mẫu dò.
* Thiết lập quy trình phản ứng phát hiện đột biến kháng isoniazid tại gen katG vị trí 516, kháng Rifampin tại gen rpoB vị trí 315 và kháng ethambutol tại gen emb
vị trí 306 của MTB bằng kỹ thuật real-time PCR. * Tiến hành chạy trên một số mẫu bệnh phẩm.
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1 Phƣơng pháp thiết kế và kiểm tra các oligonucleotide (mồi và mẫu dò) bằng cơ sở dữ liệu trên IDT và các phần mềm sinh học chuyên dụng nhƣ ClustalX và Annhyb [3,6,8,10].
Vì đột biến kháng INH nằm trên vùng gen katG , kháng RIF nằm trên gene
rpoB, kháng EMB nằm trên gene emb chúng tôi thu thập tất cả các trình tự về vùng gen katG, rpoB, emb đã được xác định cho đến nay từ ngân hàng dữ liệu gen NCBI (National Center for Biology Information). Sau đó, chúng tôi tiến hành so hàng (alignment) trên tất cả các trình tự tải về bằng phần mềm ClustalX. Dựa trên sự so hàng và kết quả công bố của các bài báo trước đó, chúng tôi chọn các vùng gen để thiết kế các cặp mồi (primer) và mẫu dò (probe) tương ứng với các đột biến kháng INH tại vị trí codon 315, kháng RIF tại vị trí codon 516 và kháng EMB tại vị trí codon 306 .
Đặc tính của các oligonucleotide thiết kế được kiểm tra và chỉnh sửa để phù hợp với tiêu chuẩn (%GC, Tm…) bằng phần mềm trực tuyến OligoAnalyzer (IDT) và Annhyb. Sau khi đã thiết kế được các cặp mồi và mẫu dò có các thông số phù hợp, tôi tiến hành Blast với các trình tự DNA có trên Ngân hàng dữ liệu gen của NCBI để xác định các trình tự mồi và mẫu đã thiết kế là đặc hiệu cao với DNA đích của MTB.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 45 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
2.3.1.1 Các nguyên tắc thiết kế các oligonucleotide
* Nguyên tắc thiết kế mồi[3,6,9,10]
- Chúng tôi thiết kế các mồi ngược bắt cặp đặc hiệu với các vị trí đột biến, mồi xuôi bắt cặp hoàn toàn với cả bản mẫu hoang dại và đột biến.
- Mồi thường dài từ 15-30 nucleotide. Hàm lượng GC cho phép khoảng 20- 80% (tốt nhất là 50-60%). Nucleotide G và C phải được phân bố đều khắp trình tự thiết kế. Thiết kế mồi sao cho base G và C nằm ở hai đầu của mồi. Tránh trường hợp đầu 3’ của mồi có nhiều hơn 3 nucleotide G hoặc C, vì mồi không đặc hiệu có thể được tạo ra.
- Nhiệt độ nóng chảy của các mồi xuôi và ngược chênh nhau không quá 50C, và kiểm soát nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi nằm trong khoảng 50-650 C.
- Mồi không được tự bắt cặp bổ sung hoặc bắt cặp bổ sung với mồi khác trong hỗn hợp phản ứng tạo thành các cấu trúc thứ cấp như:
+ Self-dimer: Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base của các mồi giống nhau.
+ Hairpin loop (Cấu trúc kẹp tóc): Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base trong cùng một mồi, đặc biệt nên tránh cấu trúc kẹp tóc chìm sâu ở đầu 3’ của mồi.
+ Hetero-dimer: Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base của oligonucleotide khác nhau.
-Năng lượng tự do (∆G) giữa các cấu trúc thứ cấp không nhỏ hơn quá -9kcal.mol-1. * Nguyên tắc thiết kế mẫu dò[6,8]
Nguyên tắc thiết kế mẫu dò cũng tương tự như nguyên tắc thiết kế mồi:
- Mẫu dò bắt cặp đặc hiệu với cả bản mẫu hoang dại và đột biến, nằm giữa hai mồi xuôi và ngược.
- Thành phần GC trong trình tự nucleotide của mẫu dò phải nằm trong khoảng 30-80%.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 46 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mẫu dò phải lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của các mồi từ 5-100C nhằm đảm bảo cho việc bắt cặp hoàn toàn với sợi DNA khuôn trong bước bắt cặp và kéo dài của chu kỳ PCR.
- Không nên có G ở đầu 5’ của mẫu dò vì G có thể hấp thu ánh sáng huỳnh quang ngay cả khi mẫu DNA bị phân giải bởi Taq polymerase.
2.3.1.2 Các phần mềm máy tính sử dụng
- ClustalX 1,83;
- Annhyb 4,930 (Olivier Friard, Hoa Kỳ);
- Phần mềm trực tuyến BLAST (NCBI, Hoa Kỳ); (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3,0 (IDT, Hoa Kỳ);
- Phần mềm trực tuyến thiết kế primer: http://frodo.wi.mit.edu/primer3/
2.3.2 Phƣơng pháp lấy mẫu, xử lý bệnh phẩm
2.3.2.1 Phương pháp lấy mẫu
* Các mẫu đờm được lấy vào buổi sáng ngay sau khi bệnh nhân thức dậy, giữ lạnh ở - 20oC hoặc -80oC để sử dụng cho tách chiết ADN. Mẫu được thao tác trong tủ an toàn sinh học cấp độ II.
Nếu mẫu bệnh phẩm là đờm hay mủ thì tiến hành xử lý như sau :
- Lấy 3 ml mẫu bệnh phẩm cho vào ống falcon 15ml vô trùng (nếu lượng mẫu ít hơn 3 ml thì lấy hết). Thêm 5 ml dung dịch SP4 vào, lắc nhẹ để tan mẫu bệnh phẩm, để yên ở nhiệt độ phòng trong 20 phút.
- Bổ sung 5 ml dung dịch SP5, lắc nhẹ, ly tâm 4500 vòng/phút trong 20 phút. - Bỏ dịch nổi, thu cặn (phần cặn và dung dịch còn lại khoảng 0,5 ml) để tách chiết DNA
- Vortex cặn, hút 100 µl mẫu đã xử lý để tách chiết DNA (Nếu chưa tiến hành tách chiết DNA ngay, bảo quản -20oC).
* Đối với mẫu là dịch cơ thể như : dịch màng phổi, dịch phế quản, dịch não tủy… - Nếu mẫu bệnh phẩm có thể tích < 3ml có thể hút luôn để tách chiết DNA - Nếu mẫu bệnh phẩm có thể tích >3ml , ly tâm 4500 vòng/phút trong 20 phút, bỏ dịch nổi thu cặn (phần cặn và dung dịch còn lại khoảng 0,5 ml) để tách chiết DNA.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 47 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
2.3.2.2 Phương pháp tách chiết MTB DNA từ bệnh phẩm
Quy trìnhcải tiến từ quy trình của Notle và CS. 1993, Jain Amita và CS. 2002 dùng để tách DNA từ chủng nuôi cấy. Quy trình này cũng có thể áp dụng với các mẫu bệnh phẩm đã xử lý (mẫu đờm) và các mẫu bệnh phẩm thuần nhất như dịch màng phổi, dịch rửa phế quản...
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dùng các tác nhân biến tính mạnh để phá vỡ vỏ bao của vi khuẩn và loại bỏ các thành phần không mong muốn (protein…). Để thu nhận DNA tinh sạch, ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. DNA sẽ được tủa bởi isopropanol ở điều kiện lạnh và thu lại qua các lần ly tâm, sau đó cặn DNA được huyền phù trong TE 1X và bảo quản ở -200C.
Thành phần các hóa chất tách chiết DNA đã trình bày trên mục 2.1.3.2. Các bước tiến hành như sau:
- Vortex kỹ bệnh phẩm lao đã xử lý (hay chủng lao nuôi cấy đã bất hoạt) để được dịch mẫu đồng nhất.
- Cho 100 µl mẫu vào 1 tube eppendorf có sẵn 900 µl dung dịch 1, vortex 30 giây, giữ 10 phút. Thêm vào 200 µl dung dịch 2, trộn đều. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Thu 600 l dịch nổi có chứa DNA (chú ý chỉ thu dịch nổi) vào 1 tube eppendorf sạch khác có sẵn 600 µl dung dịch 3 (trộn đều trước khi sử dụng). Trộn đều, giữ 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (tránh loại bỏ luôn phần cặn). Cho từ từ 900 µl dung dịch 4 vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ hết dịch nổi (dùng pipet 200 l hút sạch phần dịch nổi), thu cặn
(tránh loại bỏ luôn phần cặn), để khô ở 60oC trong 10 phút, cuối cùng thêm vào 50 l dung dịch 5 và trộn nhẹ.
- Nếu chưa đặt phản ứng PCR ngay thì phải bảo quản DNA ở -20oC.
Kiểm tra sản phẩm thu được bằng điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8%.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 48 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
Như vậy, toàn bộ quy trình tách chiết DNA vi khuẩn lao từ các mẫu bệnh phẩm lâm sàng có thể được thực hiện trong khoảng từ 1 giờ đến 1 giờ 30 phút.
2.3.3 Phƣơng pháp tối ƣu hóa các điều kiện phản ứng real-time PCR
2.3.3.1 Phương pháp real-time PCR
Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc, bằng cách điện di trên gel agarose. Ngược lại, real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra, đó là ý nghĩa của cụm từ “real-time”. Real-time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: khuếch đại DNA bằng PCR và đo độ phát quang tỷ lệ thuận với số lượng phân đoạn DNA tạo thành[8,10,33]. Khả năng này được thực hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang. Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là mẫu dò. Hệ thống real-time PCR bao gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy phát hiện quang phổ huỳnh quang và
Bệnh phẩm lâm sàng Chủng vi khuẩn Xử lý Bất hoạt Tách DNA theo qui trình Tinh sạch, Điện di kiểm tra
Bảo quản - 20oC hoặc -80o (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 49 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
máy vi tính. Nguyên lý chủ yếu của real-time PCR là dựa trên cơ sở phát hiện và định lượng thể thông báo huỳnh quang[34].
Ưu điểm chính của real-time PCR so với PCR truyền thống là nó cho phép xác định số lượng bản sao khuôn mẫu ban đầu với sự chính xác và độ nhạy cao trong một phạm vi biến thiên rộng. Kết quả real-time PCR có thể là kết quả định tính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự DNA) hay định lượng (số lượng bản sao DNA). Real-time PCR sử dụng để định lượng được gọi là PCR định lượng. Ngược lại, PCR truyền thống chỉ được xem là bán định lượng. Thêm vào đó, dữ liệu real- time PCR có thể được đánh giá mà không cần phải điện di trên gel, giúp tiết kiệm thời gian và gia tăng số lượng thí nghiệm thực hiện. Đồng thời, việc tiến hành phản ứng và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống đóng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm và loại bỏ những thao tác sau phản ứng khuếch đại.
Hình 2.2 : các giai đoạn trong phản ứng Real-time PCR
Phản ứng real-time PCR thường chịu nhiều ảnh hưởng của các thành phần và điều kiện phản ứng. Trong phần thực nghiệm này, chúng tôi kiểm chứng một số điều kiện tối ưu trong phản ứng real-time PCR như: khả năng nhân bản của hệ
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 50 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
primer-mẫu dò, nhiệt độ lai của phản ứng, nồng độ mồi, mẫu dò và nồng độ ion Mg2+, độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng. Sau một số chu kỳ nhất định, các thành phần trong phản ứng bị phân hủy hay bị cạn kiệt, các sản phẩm phụ hình thành gây ức chế phản ứng và các bản sao vừa được tổng hợp không bắt cặp với mồi mà tự bắt cặp với nhau, làm cho hiệu quả khuếch đại giảm. Vì vậy, để thu được kết quả cao cần thực hiện phản ứng không quá 40 chu kỳ. Để đảm bảo tính ổn định về nhiệt độ giữa các lần khảo sát nên sử dụng cùng một loại thiết bị và dụng cụ. Đồng thời, để tránh các trường hợp ngoại nhiễm, cần sử dụng tất cả dụng cụ mới cho phản ứng
2.3.3.2 Khảo sát khả năng nhân bản của hệ mồi, mẫu dò
Trong phương pháp real-time PCR, mồi và mẫu dò và yếu tố quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Khả năng bắt cặp của mồi, mẫu dò với DNA bản mẫu là hết sức quan trọng. Nó quyết định sự thành công hay thất bại của toàn bộ quy trình từ khâu thiết kế cho đến các kết quả trong thực nghiệm. Nếu mồi và mẫu dò hoạt động tốt thì khi khảo sát sẽ cho kết quả dương tính với mẫu chứa trình tự đột biến và cho kết quả âm tính với mẫu chứa codon hoang dại. Nếu mồi và mẫu dò không hoạt động tốt hoặc không cho ra kết quả thì không đạt yêu cầu và phải thiết kế lại 17. Tiến hành khảo sát khả năng nhân bản của hệ primer và mẫu dò trên hai chủng đối chứng với đầy đủ các thành phần của một phản ứng real-time ở thể tích 25μl.
2.3.3.3 Khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng
Nhiệt độ lai (nhiệt độ bắt cặp) của phản ứng phụ thuộc trực tiếp vào độ dài và thành phần của các oligonucleotide. Nên sử dụng nhiệt độ bắt cặp Ta (annealing temperature) thấp hơn 50C so với nhiệt độ nóng chảy Tm của cặp mồi sử dụng. Nếu tạo ra sản phẩm không đặc hiệu, nhiệt độ bắt cặp phải được tối ưu bằng cách tăng từng bước từ 1-20C. Khi nhiệt độ bắt cặp Ta quá thấp, các mồi có thể bắt cặp với các trình tự đích khác do những base đơn bắt cặp nhầm có thể xảy ra. Điều này rất tốt với mục đích khuếch đại các trình tự tương tự hay họ hàng. Tuy nhiên, nó có thể dẫn tới khuếch đại không đặc hiệu và giảm hiệu suất sản phẩm mong muốn nếu base đầu 3’ của mồi bắt cặp với trình tự đích. Nếu giá trị Ta quá cao, rất ít sản phẩm
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 51 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
được tổng hợp do sự bắt cạp của mồi bị giảm. Thời gian bắt cặp không lâu, hầu hết trong 30 giây hoặc ít hơn [3,8,9,10]. Do vậy, nhiệt độ lai tối ưu của phản ứng sẽ khắc phục được các sai sót trên và cho hiệu quả khuếch đại tối đa.
Tiến hành khảo sát nhiệt độ lai theo dãy Gradient nồng độ sau: 70,0; 69,3; 68,1; 66,2; 63,6; 62; 60,8; 60,00 C trên máy BIORAD – CFX 96.
2.3.3.4 Khảo sát nồng độ mồi của phản ứng
Mồi là yếu tố quan trọng quyết định độ đặc hiệu và ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng. Việc thiết kế mồi đặc hiệu và sử dụng nồng độ mồi thích hợp sẽ dẫn đến phản ứng có sản phẩm hay không. Nồng độ mồi quá cao có thể cho kết quả không đặc hiệu và tạo ra cấu trúc nhị phân mồi. Nồng độ mồi quá thấp sẽ ảnh hưởng đến kết quả phản ứng, trừ khi mồi có độ suy biến cao[17]. Khi tiến hành khảo sát nồng độ mồi, chúng tôi thực hiện các phản ứng real-time PCR ở cùng một điều kiện với nhiệt độ lai là nhiệt độ lai tối ưu đã khảo sát ở trên. Thành phần các chất trong phản ứng cũng giống nhau, chỉ có một sự khác biệt giữa các phản ứng là nồng độ mồi có trong phản ứng. Trong nội dung đề tài này, để tìm nồng độ mồi tối ưu, chúng tôi khảo sát nồng độ mồi theo dãy nồng độ sau: 100, 200, 300, 400, 500nM trong một thể tích phản ứng.
2.3.3.5 Khảo sát nồng độ mẫu dò của phản ứng
Mẫu dò (mẫu dò) phải đặc hiệu với trình tự đích và để tạo ra tín hiệu huỳnh quang thì mẫu dò phải nằm giữa hai mồi xuôi và ngược. Trong phản ứng real-time PCR với mẫu dò TaqMan, khuếch đại không đặc hiệu do mồi sai vị trí hoặc do hiện tượng nhị phân mồi cũng không tạo ra tín hiệu [8,10]. Do vậy, nồng độ mẫu dò cũng ảnh hưởng đến sự phát huỳnh quang và đọc tín hiệu sau mỗi chu kỳ của phản ứng. Nồng độ mẫu dò quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng xấu đến kết quả phản ứng. Để lựa chọn nồng độ mẫu dò tối ưu, chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ mẫu dò theo dãy nồng độ sau: 100, 200, 300, 400, 500nM. Thành phần phản ứng đều như nhau, nhiệt độ lai và nồng độ mồi tối ưu đã khảo sát ở trên, chỉ có nồng độ