3.11.1 Mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong đề tài là những mẫu bệnh phẩm đờm và dịch cơ thể của bệnh nhân đã xác định nhiễm lao do bệnh viện lao phổi TW và Bệnh viện Bạch Mai cung cấp.
Mẫu bệnh phẩm
Tách chiết DNA Bảo quản -200 C
Đặt phản ứng với thành phần như bảng
Chạy mẫu với chu kỳ nhiệt hình
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 95 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
3.11.2 Ứng dụng quy trình trên 50 mẫu bệnh phẩm lao
STT Mã số mẫu Kết quả định tính MTB Kết quả kháng thuốc Kháng isoniazid Kháng Rifampin Kháng ethambutol (ATG-GTG) Kháng ethambutol (ATG-ATA) Kết quả Kháng sinh đồ Kết quả real- time PCR Kết quả Kháng sinh đồ Kết quả real- time PCR Kết quả Kháng sinh đồ Kết quả real- time PCR Kết quả Kháng sinh đồ Kết quả real- time PCR 1 VA11112 (+) 2 VA21112 (+) 3 VA31112 (+) 4 VA41112 (+) (+) (+) 5 VA51112 (+) 6 VA61112 (+) 7 VA11212 (+) 8 VA21212 (+) (+) (+) 9 VA31212 (+) 10 VA41212 (+) (+) (+) 11 VA51212 (+) (+) (+) 12 VA10113 (+) 13 VA20113 (+) (+) (+) 14 VA30113 (+) 15 VA40113 (+) 16 VA50113 (+) (+) (+) (+) (+) 17 VA60113 (+) (+) (+) 18 VA70113 (+) 19 VA10213 (+) 20 VA20213 (+) 21 VA30213 (+) (+) (+) 22 VA40213 (+) 23 VA50213 (+) (+) 24 VA60213 (+)
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 96 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn 25 VA70213 (+) (+) 26 VA80213 (+) (+) (+) 27 VA90213 (+) 28 VA10313 (+) 29 VA20313 (+) (+) (+) 30 VA30313 (+) 31 VA40313 (+) (+) 32 VA50313 (+) 33 VA10413 (+) (+) (+) (+) (+) 34 VA20413 (+) 35 VA30413 (+) (+) (+) 36 VA40413 (+) 37 VA50413 (+) 38 VA60413 (+) (+) (+) 39 VA59413 (+) 40 VA60413 (+) (+) (+) 41 VA70413 (+) 42 VA80413 (+) 43 VA10513 (+) 44 VA20513 (+) 45 VA30513 (+) (+) (+) 46 VA40513 (+) (+) (+) 47 VA50513 (+) 48 VA60513 (+) (+) (+) 49 VA70513 (+) 50 VA80513 (+)
Kết quả Real-time PCR trên bệnh phẩm: Chúng tôi áp dụng quy trình vừa xây dựng lên 50 mẫu bệnh phẩm đàm đã biết nhiễm khuẩn lao. Kết quả cho thấy có 11 trường hợp xuất hiện đột biến tại codon 315 katG, 6 trường hợp xuất hiện đột biến tại codon 516 rpoB, 1 trường hợp xuất hiện đột biến tại codon 306 emb kiểu ATG-GTG và 1 trường hợp hợp đột biến tại codon 306 emb kiểu ATG-ATA. Có 2 trường hợp xuất hiện đa đột biến, trong đó có 1 trường hợp mẫu xuất hiện đột biến
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 97 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
ở cả codon 315 katG và codon 516 rpoB, 1 trường hợp còn lại là cùng mang đột biến tại codon 516 rpoB và codon 306 emb.
3.11.3 Xác định độ đồng thuận của phƣơng pháp real time PCR với phƣơng pháp kháng sinh đồ.
Để xác định đồ đồng thuận của phương pháp real-time PCR và phương pháp kháng sinh đồ trong chẩn đoán lao kháng thuốc chúng tôi thông qua hệ số kappa. Hệ số kappa được sử dụng để đánh giá phần trăm sự đồng thuận giữa hai phương pháp khi cùng dùng chẩn đoán một bệnh sau khi đã loại bỏ các yếu tố may rủi.
Giá trị hệ số kappa Kết quả sự đồng thuận giữa hai phương pháp
<0.4 Yếu
0.4-0.6 Trung bình
0.61-0.8 Tốt
0.81-1 Rất tốt
3.11.3.1 Độ đồng thuận của hai phương pháp khi xác định đột biến kháng isoniazid tại gen katG
Phương pháp real-time PCR
Mẫu âm tính Mẫu dương tính
Phương pháp kháng sinh đồ
Mẫu âm tính 37 0 37
Mẫu dương tính 2 11 13
39 11 50
* Sự phù hợp giữa hai phương pháp trên bảng :
Phương pháp real-time PCR
Mẫu âm tính Mẫu dương tính
Phương pháp kháng sinh đồ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu âm tính 78% của 37=28.86 22% của 37 = 8.14 37
Mẫu dương tính 78% của 2 = 10.14 22% của 13 = 2.86 13
39/50 = 78% 11/50=22% 50
Từ bảng trên chúng tôi tính toán được các thông số như sau :
37 + 11
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 98 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
* Tỷ lệ khả năng phù hợp giữa hai phương pháp là : * Tỷ lệ khả năng không phù hợp giữa hai phương pháp là :
* Hệ số kappa :
Vậy kết quả hệ số kappa giữa hai phương pháp kháng sinh đồ và real-time PCR trong việc xác định phản ứng kháng isoniazid là K= 0.86. Dựa vào bảng cho thấy sự đồng thuận giữa hai phương pháp xác định là rất cao, như vậy quy trình real-time PCR chúng tôi thiết lập có độ đồng thuận cao so với phương pháp kháng sinh đồ.
3.11.3.2 Độ đồng thuận của hai phương pháp khi xác định đột biến kháng rifampin tại gen rpoB
Phương pháp real-time PCR
Mẫu âm tính Mẫu dương tính
Phương pháp kháng sinh đồ
Mẫu âm tính 44 0 44
Mẫu dương tính 0 6 6
44 6 50
Dựa vào bảng cho thấy sự đồng thuận giữa hai phương pháp xác định là rất cao, như vậy quy trình real-time PCR chúng tôi thiết lập có độ đồng thuận cao so với phương pháp kháng sinh đồ. Tuy nhiên chúng tôi đề xuất vẫn cần có số lượng mẫu nhiều hơn để khảo sát để nâng cao tính hiệu quả của quy trình.
3.11.3.3 Độ đồng thuận của hai phương pháp khi xác định đột biến kháng ethambutol tại gen emb(ATG-GTG)
Phương pháp real-time PCR
Mẫu âm tính Mẫu dương tính
Phương pháp kháng sinh đồ
Mẫu âm tính 47 0 47
Mẫu dương tính 0 3 3
47 6 50
Dựa vào bảng cho thấy sự đồng thuận giữa hai phương pháp là rất cao, như vậy quy trình real-time PCR chúng tôi thiết lập có độ đồng thuận cao so với phương
28.86 + 2.86 50 x 100 = 63.44% 8.14 + 10.14 50 x 100 = 36.56% 96 - 63.44 100 - 63.44 = 0.86 K =
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 99 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
pháp kháng sinh đồ. Tuy nhiên chúng tôi đề xuất vẫn cần có số lượng mẫu nhiều hơn để khảo sát để nâng cao tính hiệu quả của quy trình.
3.11.3.4 Độ đồng thuận của hai phương pháp khi xác định đột biến kháng ethambutol tại gen emb(ATG-ATA)
Phương pháp real-time PCR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu âm tính Mẫu dương tính
Phương pháp kháng sinh đồ
Mẫu âm tính 48 0 48
Mẫu dương tính 1 1 2
49 1 50
* Sự phù hợp giữ hai phương pháp dựa trên bảng :
Phương pháp real-time PCR
Mẫu âm tính Mẫu dương tính
Phương pháp kháng sinh đồ
Mẫu âm tính 98% của 48=47.04 2% của 48 = 0.96 48
Mẫu dương tính 98% của 2 = 1.96 2% của 2 = 0.04 2
49/50 = 98% 1/50=2% 50
Từ bảng trên chúng tôi tính toán được các thông số như sau : * Tỷ lệ khả năng phù hợp giữa hai phương pháp là :
* Tỷ lệ khả năng không phù hợp giữa hai phương pháp là :
* Hệ số kappa :
Vậy kết quả hệ số kappa giữa hai phương pháp kháng sinh đồ và real-time PCR trong việc xác định phản ứng kháng ethambutol (ATG-ATA) là K= 0.65. Dựa vào bảng cho thấy sự đồng thuận giữa hai phương pháp xác định là tốt, như vậy quy trình real-time PCR chúng tôi thiết lập có độ đồng thuận cao so với phương pháp kháng sinh đồ. 48 + 1 50 x 100 = 98% 47.04 + 0.04 50 x 100 = 94.16% 1.96 + 0.96 50 x 100 = 5.84% 98 – 94.16 100 – 94.16 = 0.65 K =
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 100 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
Mặc dù số lượng bệnh phẩm chúng tôi khảo sát không nhiều, nhưng cũng có thể sơ bộ rút ra nhận định: rõ ràng kết quả PCR khá phù hợp với kết quả kháng sinh đồ.. Các kết quả real-time PCR này đã được kiểm chứng lại bằng giải trình tự sản phẩm PCR và kết quả của cả hai phương pháp cho thấy hoàn toàn trùng khớp trong phát hiện các đột biến. Tóm lại, các quy trình real-time PCR mà chúng tôi vừa xây dựng phù hợp cao trong việc phát hiện các đột biến đóng vai trò hot-spot trong sự liên quan đến tính kháng các kháng sinh isoniazid, rifampin và ethambutol ở vi khuẩn lao. Quy trình sẽ được tiếp tục thử nghiệm trên số lượng bệnh phẩm lớn hơn trong thời gian tới.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 101 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
CHƢƠNG 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận
Qua các kết quả khảo sát trong thực nghiệm, chúng tôi có các kết luận sau: * Đã xây dựng được quy trình chẩn đoán nhanh Mycobacterium Tuberlucosis
kháng Isoniazid, Rifampin và Ethambutol.
* Các cặp mồi và mẫu dò hoàn toàn đặc hiệu với MTB, đảm bảo các đặc tính cần thiết và có khả năng nhân bản tốt về mặt lý thuyết lẫn thực nghiệm.
* Chúng tôi đã xác định được các điều kiện tối ưu của các phản ứng và đưa ra quy trình phát hiện các đột biến kháng INH, RIF và EMB của MTB bằng kỹ thuật real-time PCR với độ nhạy của quy trình là 102 bản sao/ml.
* Quy trình hoàn hoàn đặc hiệu với MTB.
* Quy trình đã xây dựng được thực nghiệm trên 50 mẫu bệnh phẩm lao đã được xác định dương tính và đã có kết quả kháng sinh đồ được cung cấp bởi bệnh viện Bạch Mai và Viện lao phổi Trung Ương. Dựa vào kết quả thực nghiệm chúngg tôi có những nhận xét sau :
+ Kết quả cho thấy có 11 trường hợp xuất hiện đột biến tại codon 315
katG, 6 trường hợp xuất hiện đột biến tại codon 516 rpoB, 1 trường hợp xuất hiện đột biến tại codon 306 emb kiểu ATG-GTG và 1 trường hợp hợp đột biến tại codon 306 emb kiểu ATG-ATA. Có 2 trường hợp xuất hiện đa đột biến, trong đó có 1 trường hợp mẫu xuất hiện đột biến ở cả codon 315 katG và codon 516 rpoB, 1 trường hợp còn lại là cùng mang đột biến tại codon 516 rpoB và codon 306 emb.
+ Kết quả hệ số kappa của quy trình real-time PCR xác định các đột biến cho thấy quy trình real-time PCR mà chúng tôi xây dựng có độ đồng thuận cao so với phương pháp kháng sinh đồ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Kết quả kháng sinh đồ trên 50 mẫu bệnh phẩm thấy có 22 mẫu đột biến, quy trình real-time PCR phát hiện được 19 mẫu đột biến. Như vậy tỷ lệ phát hiện của quy trình chúng tôi xây dựng là 86%.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 102 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
4.2 Kiến nghị
Về cơ bản, chúng tôi đã khảo sát và xây dựng thành công quy trình phát hiện các đột biến kháng INH, RIF và EMB của MTBbằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò TaqMan. Để quy trình này được đưa vào chẩn đoán thường quy và sử dụng rộng rãi tại các phòng xét nghiệm cũng như các cơ sở y tế, chúng tôi có một số kiến nghị sau:
* Tiếp tục khảo sát để hoàn thiện quy trình nâng cao tỷ lệ phát hiện lao kháng thuốc.
* Tiếp tục khảo sát trên số lượng bệnh phẩm lớn hơn nhằm khẳng định độ tin cậy, chuẩn xác của quy trình.
* Tiến hành so sánh các kết quả thu được khi áp dụng quy trình này với kết quả của một số phương pháp khác như PCR RFLP, lai mẫu dò…
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 103 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Bệnh Viện Phạm Ngọc Thạch – CTCL Tp.HCM. Báo cáo Hoạt động chống lao 2008 – Phương hướng hoạt động 2009. Tháng 01/2009.
2. Chƣơng Trình Chống Lao Quốc Gia, Báo cáo tổng kết Chương trình Chống lao Quốc gia năm 2010 và phương hướng hoạt động năm 2011.
3. Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng (2008), Sinh học phân tử (khái niệm, phương pháp, ứng dụng), Nhà xuất bản giáo dục, tr. 196-197.
4. Lê Huy Chính (2001), Họ Mycobacteriaceae, Vi sinh Y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, Tr. 207-14.
5. Nguyễn Văn Hƣng (1997), "Những kỹ thuật mới trong chẩn đoán vi khuẩn học bệnh lao", Nội san lao và bệnh phổi, 26 tr. 80 – 84.
6. Võ Thị Thƣơng Lan (2008), Sinh học phân tử, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
7. Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền và ứng dụng, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội
8. Cao Minh Nga, Phan Quốc Việt, Hồ Thị Thanh Thủy (2008), “Tài liệu tập huấn: Ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh nhiễm ở người”,
Công ty cổ phần Công nghệ Việt Á.
9. Khuất Hữu Thanh (2005), Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
10. Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR và ứng dụng trong phân tích DNA – tập 2, Nhà xuất bản Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Hà Nội.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 104 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
Tiếng Anh
11. Abdelaal A., El-Ghaffar H.A., Zaghloul M.H.E., et al. (2009), "Genotypic detection of Rifampin and isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis strains by DNA sequencing: a randomized trial", Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials,8 (4): doi:10.1186/1476-0711-8-4.
12. Alcaide F, Pfyffer GE, Telenti A. “Role of embB in natural and acquired resistance to ethambutol in mycobacteria”. Antimicrob Agents Chemother 1997;41:2270–3.
13. Banaiee N., Bobadilla-del-Valle M., Riska P.F., et al. (2003), "Rapid identification and susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis from MGIT cultures with luciferase reporter mycobacteriophages", J Med Microbiol, 52: 557-6.
14. Banerjee A. Dubnau E., Quemard A., et al (1994), "inhA, a gene encoding a target for isoniazid and ethionamide in Mycobacterium tuberculosis." Science,
263 227–230.
15. Canetti G., Froman S., Grosset J., et al. (1963), "Mycobacteria: laboratory methods for testing drug sensitivity and resistance", Bull World Health Organ,
29: 565-78. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
16. Caviedes L., Lee T.S., Gilman R.H., et al. (2000), "Rapid, efficient detection and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in sputum by microscopic observation of broth culture", J Clin Microbiol, 38: 1203.
17. Cengiz Cavusoglu et al. (2002). Characterization of rpoB mutation in rifampin-resistant clinical isolates of mycobacterium tuberculosis form Turkey by DNA sequencing and line mẫu dò assay. Journal of Clinical Microbiology. P. 4435-4438
18. D. Garcíade Viedma (2003). Rapid detection of resistance in Mycobacterium tuberculosis: a review discussing molecular approaches. Clin Microbiol Infect. 9: 349-359.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 105 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
19. El Hajj H.H., Marras S.A., Tyagi S., et al. (2001), "Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacons", J. Clin. Microbiol, 39: 4131–4137.
20. Espasa M., Gonzalez-Martin J., Alcaide F., et al. (2005), "Direct detection in clinical samples of multiple gene mutations causing resistance of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and Rifampin using fluorogenic mẫu dòs", J Antimicrob Chemother, 55: 860-5.
21. Hirano et al. (1999). Mutations in the rpoB gene of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolate mostly in Asian contries and their rapid detection by line mẫu dò assay. J. Clin. Microbiol. 37:2663-2666.
22. Hausdorfer J., Sompek E., Allerberger F., et al. (1998), "E-test for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis", Int J Tuberc Lung Dis,
2: 751.
23. Hillemann D., Rusch-Gerdes S. and Richter E. (2006), "Application of the Genotype MTBDR assay directly on sputum specimens", Int J Tuberc Lung Dis, 10: 1057-9.
24. Igor Mokrousov, Tatiana Otten, Maxim Filipenko, Anna Vyazovaya, Eugeny Chrapov, Elena Limeschenko, Lidia Steklova, Boris Vyshnevskiy, and Olga Narvskaya. July 2002. Detection of Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis Strains by a Multiplex Allele-Specific PCR Assay Targeting katG Codon 315 Variation. Journal of Clinical Microbiology
25. Igor Mokrousov et al (2003). Allele-specific rpoB PCR assays for detection of Rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis in Sputum Smears. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, p.2331-2235.
26. Iseman M. D. Madsen L. A. (1989), "Drug-resistant tuberculosis", Clin. Chest Med, 10 341–353.
27. James B. Whitney and Mark A. Wainberg. 2002. Isoniazid, The Frontline of Resistance in Mycobacterium tuberculosis. MJM 6: 114-123
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 106 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
28. Johnson R., Streicher E.M., Louw G.E., et al. (2006), "Drug Resistance in Mycobacterium tuberculosis", Curr. Issues Mol. Biol., 8: 97-111.
29. Kent P.T. and Kubica G.P. (1985), "Public Health Mycobacteriology. A guide for the Level III Laboratory", Atlanta, GA: CDC,
30. Kim S.Y., Park Y.J., Song E., et al. (2006), "Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug- Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis", Diagn Microbiol Infect Dis, 54: 203-10.
31. Le T.K., Bach K.H., Ho M.L., et al. (2000), "Molecular fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Vietnam using IS6110 as mẫu dò", Tuber Lung Dis, 80 (2): 75-83.
32. Lety MA, Nair S, Berche P, Escuyer V. A single point mutation in the embB gene is responsible for resistance to ethambutol in Mycobacterium smegmatis. Antimicrob Agents Chemother 1997;41:2629–33.
33. Luo T, Jiang L, Sun W, Fu G, Mei J, Gao Q (2011), “Multiplex Real-time PCR Melting Curve Assay To Detect Drug-Resistant Mutation of Mycobacterium tuberculosis”, J Clin Microbiol 49 (9) 3123-8.
34. Mariaj.Torres, Antoniocriado,Josec.Palomares, And Javieraznar. Sept.2000. Use of Real-Time PCR and Fluorimetry for Rapid Detection of Rifampin and Isoniazid Resistance-Associated Mutations in Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology, P.3194-3199.