* Cơ chế tác động của Rifampin (RIF) : Rifampin được đưa vào sử dụng trong điều trị chống lao vào đầu những năm 1970 và là một thành phần rất quan trọng trong điều trị. Cơ chế tác động của RIF liên quan đến ức chế enzyme RNA polymerase phụ thuộc DNA, enzyme này là một phức oligomer bao gồm 4 tiểu đơn vị khác nhau (α, , ’ và )và được mã hoá bởi các gen rpoA, rpoB, rpoC, rpoD) có thể xẩy ra một trong hai dạng là core enzyme (a2bb9) và holoenzyme (a2bb9 plus s) [11,17].
RIF gắn với tiểu đơn vị b của RNA polymerase (rpoB), enzyme chịu trách nhiệm cho sao chép và biểu hiện của các gen ở mycobacteria, kết quả là ức chế hoạt động sao chép của vi khuẩn.
*Cơ chế kháng Rifampin của vi khuẩn lao : Chẩn đoán phân tử của tính kháng rifampin là phù hợp nhất vì các nghiên cứu chỉ ra rằng tính kháng thuốc là do đột biến ở vùng lõi của gen rpoB. Các phương pháp phân tử đã được tận dụng bao gồm đọc trình tự tự động trực tiếp vùng đích đã được khuếch đại của gen rpoB. Khuếch đại vùng đích bằng PCR tiếp đó là bằng phân tích tính đa hình các sợi đơn (SSCP) và thử nghiệm có thể thương mại hoá dựa trên khuếch đại vùng đích bằng PCR sau đó lai mẫu dò thẳng với các đầu dò oligonucleotide (INNO-LiPA Rif. TB kit, Innogenetics, Zwijnaarde, Belgium). Dữ liệu từ một số nghiên cứu chỉ ra rằng
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 21 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
khoảng 95% chủng M. tuberculosis lâm sàng kháng rifampin mang các đột biến điểm riêng biệt hoặc các đột biến thêm đoạn, mất đoạn định vị trong vùng lõi 81 bp (vùng xác định tính kháng rifampin) của rpoB (các codon 507 đến 533) mã hoá cho 27 acid amin [12,20]. Đây là mối tương quan chặt chẽ của sự thay thế acid amin đặc biệt và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc. Các đột biến mất nghĩa tiêu biểu ở codon 516/ 526/531 cho kết quả kháng rifampin ở mức cao trong khi đó những sự thay đổi acid amin ở vị trí 514 hoặc 533 thường cho kết quả kháng rifampin ở mức thấp. Trên 95% khả năng kháng rifampin liên quan đến các đột biến trong vùng lõi gồm 81 bp của gene rpoB ở các vi khuẩn lao, từ codon 507 đến codon 533 với sự thay đổi thường nhất là ở codon 516: Asp-516-Val (GAC GTC) . Tuy nhiên, các nghiên cứu cụ thể hơn được tiến hành từ các vùng khác nhau trên thế giới đã chỉ ra rằng tần số của các đột biến đặc biệt thay đổi đáng kể giữa các cộng đồng dân tộc và các vùng địa lý. Tuy nhiên cơ chế kháng thuốc chưa được xác định ở gần 5% các chủng lâm sàng kháng rifampin khi không có đột biến nào được phát hiện ở vùng lõi 81 bp hoặc ở đâu đó trong gen rpoB khi những chủng này được xác nhận tính kháng rifampin bởi xét nghiệm tính mẫn cảm chuẩn, điều này cho thấy một phần nhỏ của các chủng kháng rifampin sẽ không được phát hiện bởi các phương pháp phân tử so với thử nghiệm tính mẫn cảm thuốc kiểu hình thông thường [21,25].
1.3.7 Cơ chế tác động của ethambutol và cơ chế kháng ethambutol của vi khuẩn lao
* Cơ chế tác động của ethambutol (EMB) : Ethambutol (một chất có cấu trúc tương tự arabinose) là một thuốc chống lao cơ bản cũng ức chế sự kết hợp của acid mycolic với thành tế bào mycobacteria. EMB là một thuốc kìm khuẩn chỉ có tác động lên quá trình phát triển của vi khuẩn mà không có hiệu lực lên quá trình sao chép. EMB can thiệp lên qua trình sinh tổng hợp arabinogalactan tế bào. Nó ức chế trùng hợp arabinan từ arabinogalactan và lipoarabinomannan ở thành tế bào và gây ra tích luỹ D-arabinofuranosyl-P-decaprenol, một trung gian trong quá trình sinh tổng hợp arabinan [12,18].
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 22 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
* Cơ chế kháng ethambutol của vi khuẩn lao :Các nghiên cứu di truyền và hoá sinh chỉ ra rằng tính kháng với ethambutol liên quan với đột biến trong gen embB[33], một trong 3 gen được mã hoá bởi operon embCAB. Gen embB mã hoá một arabinosyl transferase, một protein màng trọn vẹn với 12 domain xuyên màng bị ức chế bởi thuốc. Phân tích trình tự DNA của gen embB từ các chủng kháng ethambutol chỉ ra rằng vùng xác định kháng EMB (ERDR) ở embB được định vị trong vòng tế bào chất của domain xuyên màng. Gần 50 đến 70% các chủng kháng ethambutol chứa các đột biến mất nghĩa bên trong ERDR của gen embB với phần lớn chủng mang các thay đổi ở codon 306. Các nghiên cứu khác nhau dã xác định được 5 vị trí đột biến ở codon 306 (ATG →GTG/CTG/ATA/ATC/ATT)) dẫn tới sự thay thế 3 axit amin (Val, Leu and Ile) của các chủng kháng EMB [43,44]. Các đột biến này chiếm 70- 90% ở các chủng kháng EMB [39,32].. Tuy nhiên cũng có khoảng 30% số chủng có kiểu hình đề kháng EMB mà vẫn không xác định được đột biến trên gen emb. Tại nghiên cứu này chúng tôi tập trung vào xác định 2 loại đột biến kháng thuốc tại gen emb là ATG→ GTG(Met306Val) và ATG→ ATA(Met306Ile) là hai đột biến có nghĩa và thường gặp khi vi khuẩn lao kháng Ethambutol [44].
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 23 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
1.4 Các phƣơng pháp xác định lao kháng thuốc
Phát hiện sớm tính kháng thuốc chính là một trong những ưu tiên trong chương trình kiểm soát bệnh lao. Nó cho phép bắt đầu điều trị thích hợp ở những bệnh nhân cũng như giám sát kháng thuốc. Phát hiện kháng thuốc bằng phương pháp truyền thống đã được thực hiện dựa trên phát hiện sự phát triển của M.
tuberculosis với sự có mặt của các kháng sinh. Tuy nhiên, do các nhược điểm của các phương pháp này mà hầu hết là do mất nhiều thời gian để có được kết quả, trong những năm gần đây, công nghệ mới và cách tiếp cận đã được đề xuất. Chúng bao gồm cả hai phương pháp kiểu hình và kiểu gen
Phương pháp kiểu hình dựa trên cơ sở sự sinh trưởng của vi khuẩn lao trên môi trường chứa thuốc kháng sinh, phương pháp kiểu gen dựa trên cơ sở phát hiện đột biến liên quan đến kháng thuốc kháng sinh bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng nhưng cả hai đều hỗ trợ nhau trong việc chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc.
Phương pháp kiểu gen có lợi thế là thời gian xác định ngắn hơn, không phải nuôi cấy, có thể thực hiện trực tiếp trong các mẫu lâm sàng, nguy cơ nhiễm sinh học thấp và có thể tự động hóa. Tuy nhiên, không phải tất cả các cơ chế phân tử của sự kháng thuốc đều đã được biết đến. Phương pháp kiểu hình, nói chung thực hiện đơn giản và dễ dàng tiếp cận hơn trong các labo chẩn đoán lao. Phần sau đây mô tả các phương pháp kiểu hình và kiểu gen cũng như các phương pháp mới gần đây đã đề xuất để phát hiện kháng thuốc ở vi khuẩn lao.
1.4.1 Phƣơng pháp xác định kiểu hình
Nói chung phương pháp kiểu hình đánh giá dựa trên ức chế sự phát triển của vi khuẩn lao trong điều kiện có thuốc kháng sinh để phân biệt các chủng nhạy cảm và đề kháng. Điều này là có thể thực hiện khi các chủng MTB phân lập được từ bệnh nhân chưa từng điều trị lao trước đó rất giống nhau về mức độ nhạy cảm, thể hiện như phạm vi hẹp của nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các thuốc chống lao chính [5]. Định nghĩa cổ điển cho một chủng lao kháng thuốc là nó hiển thị mức độ
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 24 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
nhạy cảm thấp hơn đáng kể hơn so với một chủng hoang dại mà chưa được tiếp xúc với thuốc[2].
Có ba phương pháp kiểu hình truyền thống được thực hịên trên môi trường đặc: phương pháp tỷ lệ, phương pháp tỷ lệ nồng độ ức chế tối thiểu và phương pháp nồng độ tới hạn. Các phương pháp cải tiến gần đây được thực hiện trên môi trường lỏng bao gồm phương pháp.
Vi khuẩn lao được nuôi cấy trong môi trường có thuốc kháng sinh. Mức độ kháng thuốc của vi khuẩn được đánh giá thông qua số khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy.
1.4.1.1 Phương pháp truyền thống
1.4.1.1.1 Phương pháp tỷ lệ
Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất. Chủng vi khuẩn lao được nuôi cấy trên môi trường có chứa chất kháng sinh và môi trường đối chứng không chứa chất kháng sinh với các nồng độ như nhau. Kết quả được kiểm tra lần đầu sau 28 ngày ủ ở 37oC. Nếu tỷ lệ giữa số khuẩn lạc phát triển trên môi trường chứa chất kháng sinh so với số khuẩn lạc phát triển trên môi trường kiểm chứng lớn hơn 1% (đối với INH, RIF và axit para-aminosalycilic) hoặc hơn 10% (đối với các thuốc kháng sinh khác) thì chủng đó được kết luận là kháng thuốc[5]. Sau 42 ngày nuôi cấy, đếm lại số khuẩn lạc để đánh giá xem chúng có nhạy cảm với loại thuốc kháng sinh nào hay không.
Nếu thử nghiệm được thực hiện trên môi trường thạch, môi trường 7H10/11 Middlebrook được sử dụng và được ủ trong khí trường có CO2 10%. Kết quả được phân tích sau 21 ngày hoặc thậm chí sớm hơn nếu xuất hiện chủng đề kháng [15]. Nồng độ tới hạn của các loại thuốc chính được sử dụng trong phương pháp tỷ lệ được thể hiện trong bảng sau:
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 25 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
Kháng sinh Löwenstein-Jensen 7H10 agar 7H11 agar
Isoniazid 0.2 0.2, 1.0 0.2, 1.0 Rifampin 40.0 1.0 1.0 Ethambutol 2.0 5.0 7.5 Streptomycin 4.0 2.0 2.0, 10.0 Pyrazinamide 100 - - PAS 0.5 2.0 8.0 Kanamycin 20.0 5.0 6.0 Ethionamide 20.0 5.0 10.0 Ofloxacin 2.0 2.0 2.0 Capreomycin 20.0 10.0 10.0 Cycloserine 40.0 - -
Bảng 1.2 Nồng độ đánh giá của các loại thuốc kháng sinh chính trong phương pháp tỷ lệ[5]
Phương pháp tỷ lệ là phương pháp lựa chon hiện tại cho việc ước tính kháng thuốc và nguyên tắc này được áp dụng cho ácc phương pháp kiểm tra test nhanh sau đây: BACTEC 460 (thuốc chống lao dòng 1 và 2), MGIT 960, MB/BacT system và ESP II system [13,16].
1.4.1.1.2 Phương pháp tỷ lệ nồng độ ức chế tối thiểu (Resistance ratio method) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hai hệ thống môi trường nuôi cấy được chuẩn bị với hàm lượng kháng sinh được pha loãng giảm dần bậc hai. Hệ thống thứ nhất dùng để nuôi cấy chủng vi khuẩn lao cần kiểm tra. Hệ thống thứ hai nuôi cấy chủng M. tuberculosis H37Rv với lượng nuôi cấy tương đương. Kiểm tra kết quả sau 4 tuần ủ ở nhiệt độ 370
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 26 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
đề kháng được thể hiện ở tỷ lệ MIC của chủng kiểm tra so với MIC của chủng chuẩn. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc được xác định là nồng độ kháng sinh pha loãng cao nhất trong môi trường mà số khuẩn lạc vi khuẩn lao phát triển thấp hơn 20. Nếu tỷ số giữa MIC của chủng được kiểm tra với MIC của chủng chuẩn H37Rv nhỏ hơn 2 thì kết luận chủng cần xác định là nhạy cảm với thuốc, còn nếu lớn hơn hoặc bằng 8 thì kết luận là chủng kháng lại thuốc kháng sinh [5,16,26].
Thử nghiệm này cũng bị ảnh hưởng nhiều bởi nồng độ cấy truyền cũng như sự sống sót của các chủng. Hơn nữa những khác biệt trong tính nhạy cảm của chủng chuẩn cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ đề kháng (RR) của các chủng kiểm tra.
1.4.1.2 Phương pháp nồng độ tới hạn
Cũng sử dụng hai hệ thống nuôi cấy, hệ thống 1 là dãy ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy có chứa thuốc kháng sinh được pha loãng giảm dần bậc hai và hệ thống 2 là môi trường kiểm chứng không có thuốc kháng sinh. Tính kháng thuốc của chủng được thể hiện là nồng độ thuốc pha loãng cao nhất có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Nồng độ tới hạn trong môi trường được xác định giống như trong phương pháp tỷ lệ nhưng nồng độ được cho là tới hạn lại được xác định tùy theo mỗi phòng thí nghiệm nghiên cứu [12]. Đọc kết quả sau 4 tuần/37oC hoặc 5-6 tuần nếu chưa đạt đủ mức độ sinh trưởng. Nếu trên môi trường chứa thuốc kháng sinh có ít hơn 20 khuẩn lạc so với trên môi trường đối chứng thì được xác định là nhạy cảm với thuốc kháng sinh. Phương pháp này cũng bị ảnh hưởng nhiều bởi sự sống sót của vi khuẩn [26].
1.4.2. Các phƣơng pháp nuôi cấy cải tiến
Phương pháp nuôi cấy truyền thống trên môi trường thạch tốn thời gian do tốc độ sinh trưởng chậm của các chủng vi khuẩn. Vì vậy một số hệ thống nuôi cấy cải tiến đã ra đời nhằm khác phục nhược điểm này, có thể rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống còn 1-2 tuần.
1.4.2.1 Phương pháp sử dụng hệ thống nuôi cấy BACTEC
Sử dụng môi trường lỏng Middlebrook 7H9 biến đổi với nguồn cacbon duy nhất là axit palmitic được đánh dấu phóng xạ 14C. Trong môi trường chứa thuốc kháng sinh, chủng kháng thuốc sẽ sinh trưởng và chuyển hóa axit palmitic giải
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 27 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
phóng CO2 chứa 14C. Sự gia tăng CO2 chứa phóng xạ 14C trong môi trường được tự động phát hiện bằng máy BACTEC 460.
Để thực hiện phương pháp này, sử dụng một lọ môi trường có chứa chất kháng sinh cần nghiên cứu và lọ kia là môi trường kiểm chứng không có thuôc kháng sinh rồi dược ủ ở 370C. Nếu sử dụng 2 ống chứng được nuôi cấy với huyền dịch vi khuẩn có độ pha loãng cách nhau 100 lần, thì kết quả được xác định giống như phương pháp tỷ lệ với tỷ lệ sinh trưởng là 1%.
Phương pháp này đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược Phẩm (FDA) của Hoa Kỳ (Mỹ) phê duyệt và cũng được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định sự nhạy cảm với các thuốc chống lao dòng 1 [40].
Phương pháp có thể này rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống còn 2-4 tuần. Tuy nhiên do chi phí cao trong đầu tư thiết bị và khó khăn trong xử lý chất thải phóng xạ nên việc áp dụng phương pháp này trong chẩn đoán lâm sàng còn hạn chế.
1.4.2.2 Phương pháp sử dụng hệ thống nuôi cấy MGIT
Phát hiện sự có mặt của vi khuẩn lao dựa trên việc phát hiện tín hiệu huỳnh quang khi vi khuẩn sinh trưởng trên môi trưởng lỏng Middlebrook 7H9. Gắn phức hợp huỳnh quang (muối ruthenium) ở đáy ống môi trường. Phức hợp này nhạy cảm với sự có mặt của O2
hòa tan trong môi trường, O2 trong môi trường có tác dụng làm mất tín hiệu hiệu huỳnh quang của muối ruthenium.. Lúc đầu do lượng O2
hòa tan trong môi trường lớn nên kìm chế sự phát quang của phức hợp. Khi có mặt của vi khuẩn trong môi trường, do hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn đã tiêu thụ bớt lượng O2
dẫn đến việc phát sáng của huỳnh quang. Sự phát triển của vi khuẩn cũng có thể được phát hiện bởi sự xuât hiện độ đục không đồng nhất hoặc những hạt nhỏ hay mảnh vụn trong môi trường nuôi cấy.
Để thực hiện phương pháp này, sử dụng một ống nghiệm có chứa kháng sinh và một ống đối chứng, được nuôi cấy với huyền dịch vi khuẩn và ủ ở 370C (ngày 0). Bắt đầu từ ngày thứ ba (ngày 2), các ống được kiểm soát hàng ngày với một bóng đèn tia cực tím. Sự hiện diện của một chất huỳnh quang màu da cam trong ống chứa kháng sinh tại cùng thời điểm như trong ống chứng hoặc trong vòng hai ngày kể từ
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 28 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
ngày kiểm soát được xác định là sự đề kháng với thuốc, nếu không, được coi là nhạy cảm. Thời gian đọc kết quả tối đa là 14 ngày sau nuôi cấy [13].
Hệ thống nuôi cấy MGIT đã được phê chuẩn để xác định nhanh chóng sự đề kháng của vi khuẩn với thuốc chống lao dòng 1, với kết quả tương dương như các phương pháp truyền thống trên môi trường rắn và hệ thống BACTEC-460.
Hình 1.6. Các ống MGIT cho kết quả dương tính và âm tính
Hệ thống MGIT là một phương pháp thuận tiện, nhanh, tin cậy để thực hiện các thử nghiệm xác định độ nhạy cảm kháng sinh (DST) trực tiếp và gián tiếp ở những nước nghèo, đặc biệt sử dụng khá thành công như một phương pháp phát hiện trực tiếp từ các bệnh phẩm lâm sàng bị nhiễm (đờm) [41]. Tuy nhiên, do chi phí cao trong đầu tư đã hạn chế việc sử dụng rộng rãi hệ thống chẩn đoán này.