Từ kết quả của các thí nghiệm tối ưu hóa sản phẩm PCR, chúng tôi thiết lập lên quy trình tối ưu nhất sau đó thử nghiệm trên 50 mẫu bệnh phẩm. Kết quả được trình bày ở chương 3. . 100ul dung dịch MTB DNA có nồng độ 1x 107 copies/ml
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 54 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Đánh giá các thông số của các oligonucleotide thiết kế 3.1.1 Trình tự và vị trí của các oligonucleotide
Trình tự của các primer và mẫu dò phát hiện đột biến INH tại vị trí codon 315, kháng RIF tại vị trí codon 516 và kháng EMB tại vị trí codon 306 đã được trình bày trong bảng 2.1 ở chương 2. Vì các đột biến kháng thuốc trong đề tài nghiên cứu thuộc dạng đột biến điểm, do vậy trình tự hoang dại và trình tự đột biến chỉ khác nhau bởi một nucleotide. Để phân biệt sự khác nhau này chúng tôi thiết kế các đoạn mồi ngược bắt cặp hoàn toàn với trình tự đột biến và có một trình tự bất đối xứng ở nucleotide thứ nhất tính từ đầu 3’-OH khi bắt cặp với trình tự hoang dại. Các mồi này đi kèm với các mồi xuôi bắt cặp hoàn toàn với cả trình tự hoang dại lẫn trình tự đột biến.
Sau đó, chúng tôi sử dụng phần mềm Annhyb để kiểm tra lại trình tự và vị trí của các oligonucleotide thiết kế có đúng với mục đích của đề tài hay không.
Hình 3.1 : Kết quả kiểm tra hệ mồi và mẫu dò của phản ứng1 bằng phần mềm Annhyb
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 55 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
Kết quả như hình 3.1 cho thấy cặp mồi katG315R và katG315F hoàn toàn đặc hiệu với MTB cho phép nhân bản trình tự có độ dài 92bp.
Hình 3.2 : Kết quả kiểm tra hệ mồi và mẫu dò của phản ứng 2 bằng phần mềm Annhyb
Kết quả hình 3.2 cho thấy hệ mồi rpoB516F và rpoB516R hoàn toàn đặc hiệu với MTB cho phép khuếch đại đoạn trình tự có độ dài 99bp.
Hình 3.3: Kết quả kiểm tra hệ mồi và mẫu dò của phản ứng 3 bằng phần mềm Annhyb
Hình 3.3 cho thấy hệ mồi và mẫu dò chúng tôi thiết kế hoàn toàn đặc hiệu với MTB cho phép nhân lên đoạn trình tự có độ dài 90bp.
Vị trí đột biến
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 56 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
Hình 3.4: Kết quả kiểm tra hệ mồi và mẫu dò của phản ứng 4 bằng phần mềm Annhyb
Kết quả so hệ mồi và mẫu dò với trình tự cho thấy hệ mồi và mẫu dò hoàn toàn đặc hiệu với MTB. Hệ mồi khếch đại trình tự có độ dài 74bp.
3.1.2 Đặc tính của các oligonucleotide
Tính chất vật lý của các oligonucleotide được thiết kế và kiểm tra bằng phần mềm OligoAnalysis trên IDT (Hoa Kỳ) về các thông số như chiều dài, thành phần %GC, nhiệt độ nóng chảy (Tm), cấu trúc kẹp tóc, cấu trúc tự thân giữa các oligonucleotide giống nhau được tổng hợp ở bảng 2.1.
Tên Số bp %GC Tm Năng lượng tự do ∆G kcal.mol-1 Hairpin Selff-dimer katG 315F 19 56% 520C -4.3 -11.3 katG 315R 18 61% 570C -1.8 -9.75 Mẫu dò katG315 25 60% 620C -1.24 -9.75 rpoB 516F 18 50% 530C -1.84 -5.3 rpoB 516R 18 61% 580C -4.1 13.3 Mẫu dò rpoB516 23 65% 660C -2.7 -7.48 Vị trí đột biến
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 57 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn emb 306F1 18 66% 600C -2.1 -3.61 emb 306R12 18 66% 620C -3.03 -9.75 Mẫu dò 306R12 25 50% 59.50C 0.41 -16 Emb 306F345 25 60% 58.40C -1.4 -5.38 Emb 306R3 17 76% 63.50C -0.46 -6.53 Mẫu dò emb306-345 24 65% 63.40C -3.06 -10.014
Bảng 3.1 : Bảng thông số kỹ thuật của mồi và mẫu dò
Ghi chú:
- Tm : Nhiệt độ nóng chảy (nhiệt độ biến tính)
- ∆G: Chỉ số xác định độ bền của một cấu trúc bậc hai.
Qua bảng 3.1, chúng tôi nhận thấy:
- Kích thước và tỷ lệ các base trong các primer và mẫu dò đều phù hợp với tiêu chuẩn thiết kế.
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi chênh lệch nhau không quá 50
C; - Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi và mẫu dò chênh lệch nhau từ 5-8 0C hoàn toàn phù hợp với tiêu chuẩn.
- Về thành phần GC: nằm trong khoảng tỷ lệ tốt nhất 40-65%. Tuy nhiên trong bảng có thể thấy các mồi ngược của phản ứng xác định đột biến trên gen emb đều có tỷ lệ G/C cao nhưng vẫn đảm bảo Tm <650
C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Năng lượng tự do (∆G) của các cấu trúc thứ cấp như cấu trúc kẹp tóc (Hairpin), cấu trúc self-dimer và cấu trúc hetero-dimer càng lớn hơn -9 kcal.mol-1 thì các cấu trúc đó càng kém bền vững và không ảnh hưởng đến phản ứng. Trong bảng trên, ta thấy ∆G trong cấu trúc self-dimer của mẫu dò có một dạng có ∆G <- 9,20kcal.mol-1. Vì nó không quá nhỏ so với -9kcal.mol-1 nên có thể chấp nhận được và chúng ta có thể tăng nhiệt độ bắt cặp của phản ứng để khắc phục.
Kết quả kiểm tra cấu trúc thứ cấp của các oligonucleotide khác nhau trong các phản ứng được thể hiện trong bảng 3.2,3.3,3.4 và 3.5.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 58 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn katG315F katG315R Mẫu dò katG315 katG315F - -6.68 -8.6 katG315R -6.68 - -9.75 Mẫu dò katG315 -8.6 -9.75 -
Bảng 3.2: Kiểm tra năng lượng liên kết hetero-dimer trong phản ứng 1 – xác định đột biến gen katG tại vị tí 315
rpoB516F rpoB516R Mẫu dò rpoB516
rpoB516F -- >-8.7 >-5.02
rpoB516R >-8.07 -- >-6.07
Mẫu dò rpoB516 >-5.02 >-6.07 --
Bảng 3.3: Kiểm tra năng lượng liên kết hetero-dimer trong phản ứng 2- xác định đột biến gen rpoB tại vị trí 516
emb306F1 emb306R2 Mẫu dò emb306R2 emb306F1 -- >-9.8 >-9.8 emb306R2 >-9.8 -- >-9.8 Mẫu dò emb306R2 >-9.8 >-9.8 --
Bảng 3.4: Kiểm tra năng lượng liên kết hetero-dimer trong phản ứng 3- xác định đột biến gen emb306 (A→G)
emb306F1 Emb306R2 Mẫu dò emb306R2 emb306F1 -- >-5.19 >-5.19 emb306R2 >-5.19 -- >-6.53 Mẫu dò emb306R2 >-5.19 >-6.53 --
Bảng 3.5 : Kiểm tra năng lượng liên kết hetero –dimer trong phản ứng 4 – xác định đột biến gen emb306 (G→A)
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 59 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
Từ các bảng kiểm tra năng lượng của cấu trúc thứ cấp của các mồi và mẫu dò trong từng phản ứng chúng ta thấy có những phản ứng có mức năng lượng như - 9,75kcal/mol ở phản ứng 1 hay -9,8kcal/mol ở phản ứng 3, mức năng lượng như vậy là thấp nhưng không quá nhiều so với -9kcal/mol. Để khắc phục chúng tôi tăng nhiệt độ bắt cặp của phản ứng (Tm) lên để phá vỡ năng lượng liên kết.
3.1.3 Khả năng bắt cặp của hệ mồi, mẫu dò trên ly thuyết
Để xác định khả năng bắt cặp đặc hiệu của các primer, mẫu dò thiết kế ở trên, chúng tôi thực hiện ClustalX với 123 trình tự gen của HBV từ NCBI. Đồng thời, chúng tôi kiểm tra độ đặc hiệu của các oligonucleotide bằng công cụ Blast trên NCBI
3.1.3.1 Khả năng bắt của mồi katG315F
Hình 3.5 : Khả năng đặc hiệu của mồi katG-315F đối với gen katG của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast (NCBI)
Căn cứ vào hình 3.5, khả năng đặc hiệu của katG-315F đối với MTB rất cao vì các chỉ số Query coverage và Max ident lần lượt là 100%. Kết quả ClustalX cũng cho thấy trình tự mồi hoàn toàn đặc hiệu với hệ gen MTB.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 60 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
3.1.3.2 Khả năng bắt cặp của mồi ngược katG-315R
Hình 3.6: Khả năng đặc hiệu của mồi katG-315R đối với gen katG của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast (NCBI)
Căn cứ vào kết quả ClustalX mồi ngược katG-315R trong hình 3.6, các nucleotide hoàn toàn tương đồng, duy chỉ có một nucleotide ở đầu 3’ của mồi là không bảo tồn. Vì đây là mồi phát hiện đột biến nên có sự sai khác tại vị trí này giữa các trình tự không chứa đột biến và trình tự đột biến từ ngân hàng dữ liệu gen. Các chỉ số Query coverage và Max ident trong hình 3.3 đều đạt 100% nên mồi ngược katG315R là hoàn toàn đặc hiệu với MTB.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 61 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
3.1.3.3 Khả năng bắt cặp của mẫu dò Mẫu dò katG315
Hình 3.7: Khả năng đặc hiệu của Mẫu dò katG 315 đối với gen katG của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI)
Mẫu dò katG315 hoàn toàn tương đồng với các trình tự gen MTB khi so hàng bằng phần mềm ClustalX ở hình 3.7. Khi so sánh mẫu dò katG315 với các trình tự trên NCBI thì các chỉ số đều đạt 100% như trong hình 3.7. Do đó, chúng tôi khẳng định mẫu dò katG315 là hoàn toàn đặc hiệu với MTB.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 62 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
3.1.3.4 Khả năng bắt cặp của mồi xuôi rpoB-516F (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.8: Khả năng đặc hiệu của mồi xuôi rpoB-516F đối với gen rpoB của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI)
Căn cứ vào kết quả ClustalX mồi xuôi rpoB-516F trong hình 3.8, các nucleotide hoàn toàn tương đồng, duy chỉ có một nucleotide ở đầu 3’ của mồi là không bảo tồn. Vì đây là mồi phát hiện đột biến nên có sự sai khác tại vị trí này giữa các trình tự không chứa đột biến và trình tự đột biến từ ngân hàng dữ liệu gen. Các chỉ số Query coverage và Max ident trong hình 3.8 đều đạt 100% nên mồi xuôi rpoB-516F là hoàn toàn đặc hiệu với MTB
3.1.3.5 Khả năng bắt cặp của mồi ngược rpoB-516R
Hình 3.9 : Khả năng đặc hiệu của mồi ngược rpoB-516R đối với gen rpoB của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI)
Căn cứ kết quả Blast hình 3.9, các chỉ số Query coverage và Max ident đều đạt 100%. Kết quả ClustalX cho thấy trình tự mồi hoàn toàn đặc hiệu với MTB.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 63 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
3.1.3.6 Khả năng bắt cặp của mẫu dò Mẫu dò rpoB-516
Hình 3.10 :Khả năng đặc hiệu của Mẫu dò rpoB-516 đối với gen rpoB của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI)
Mẫu dò rpoB-516 hoàn toàn tương đồng với các trình tự gen MTB khi so hàng bằng phần mềm ClustalX ở hình 3.10. Khi so sánh mẫu dò rpoB-516 với các trình tự trên NCBI thì các chỉ số đều đạt 100% như trong hình 3.10. Do đó, chúng tôi khẳng định mẫu dò rpoB516 là hoàn toàn đặc hiệu với MTB.
3.1.3.7 Khả năng bắt cặp của mồi xuôi emb 306F1
Hình 3.11: Khả năng đặc hiệu của mồi xuôi emb 306F1 đối với gen emb của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI)
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 64 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
Căn cứ vào kết quả ClustalX mồi xuôi emb 306F1 trong hình 3.11, các nucleotide hoàn toàn tương đồng, duy chỉ có một nucleotide ở đầu 3’ của mồi là không bảo tồn. Vì đây là mồi phát hiện đột biến nên có sự sai khác tại vị trí này giữa các trình tự không chứa đột biến và trình tự đột biến từ ngân hàng dữ liệu gen. Các chỉ số Query coverage và Max ident trong hình 3.11 đều đạt 100% nên mồi xuôi emb 306F1 là hoàn toàn đặc hiệu với MTB
3.1.3.8 Khả năng bắt cặp của mồi ngược emb 306R12
Hình 3.12: Khả năng đặc hiệu của mồi xuôi emb 306R12 đối với gen emb của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI)
Dựa vào kết quả ClustalX chúng tôi thấy trình tự mồi đặc hiệu với MTB, kết quả các chỉ số Query coverage và Max ident đều đạt 100% vì vậy mồi ngược hoàn toàn đặc hiệu với MTB.
3.1.3.9 Khả năng bắt cặp của Mẫu dò emb 306-12
Hình 3.13:: Khả năng đặc hiệu của Mẫu dò emb306-12 đối với gen emb của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI)
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 65 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
Mẫu dò emb306-12 hoàn toàn tương đồng với các trình tự gen MTB khi so hàng bằng phần mềm ClustalX ở hình 3.13. Khi so sánh mẫu dò emb306-12 với các trình tự trên NCBI thì các chỉ số đều đạt 100% như trong hình 3.13. Do đó, chúng tôi khẳng định mẫu dò emb306-12 là hoàn toàn đặc hiệu với MTB
3.1.3.10 Khả năng bắt cặp của mồi xuôi emb 306-F345
Hình 3.14: Khả năng đặc hiệu của mồi xuôi emb 306-F345 đối với gen emb của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI)
Mồi xuôi emb306-F345 hoàn toàn tương đồng với các trình tự gen MTB khi so hàng bằng phần mềm ClustalX ở hình 3.14. Khi so sánh mồi xuôi emb306-F345 với các trình tự trên NCBI thì các chỉ số đều đạt 100% như trong hình 3.7. Do đó, chúng tôi khẳng định mồi xuôi emb306-F345 là hoàn toàn đặc hiệu với MTB.
3.1.3.11 Khả năng bắt cặp của mồi ngược emb 306R3
Hình 3.15: Khả năng đặc hiệu của mồi ngược emb 306-R3 đối với gen emb của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI)
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 66 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
Căn cứ vào kết quả ClustalX mồi xuôi emb 306-R3 trong hình 3.15, các nucleotide hoàn toàn tương đồng, duy chỉ có một nucleotide ở đầu 3’ của mồi là không bảo tồn. Vì đây là mồi phát hiện đột biến nên có sự sai khác tại vị trí này giữa các trình tự không chứa đột biến và trình tự đột biến từ ngân hàng dữ liệu gen. Các chỉ số Query coverage và Max ident trong hình 3.11 đều đạt 100% nên mồi xuôi emb306-R3 là hoàn toàn đặc hiệu với MTB.
3.1.3.11 Khả năng bắt cặp của Mẫu dò emb 306-345
Hình 3.16: Khả năng đặc hiệu của Mẫu dò 306-345 đối với gen emb của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI)
Mẫu dò emb306-345 hoàn toàn tương đồng với các trình tự gen MTB khi so hàng bằng phần mềm ClustalX ở hình 3.16. Khi so sánh mẫu dò emb306-345 với các trình tự trên NCBI thì các chỉ số đều đạt 100% như trong hình 3.13. Do đó, chúng tôi khẳng định mẫu dò emb306-345 là hoàn toàn đặc hiệu với MTB. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2 Đánh giá khả năng bắt cặp của hệ mồi và mẫu dò
Trong 4 phản ứng theo bảng thông số mồi thì nhiệt độ để phản ứng thực hiện được là 600C nhưng do có một số chỉ số ΔG có mức năng lượng <-9kcal/mol-1
nên chúng tôi quyết định tăng nhiệt độ lai các phản ứng lên 650C để khảo sát trước mắt khả năng bắt cặp.
Phản ứng được thực hiện trên máy BIORAD – CFX 96 với chương trình nhiệt bao gồm 950
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 67 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
Trong thực nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu, độ nhạy, của các hệ mồi và mẫu dò, DNA sử dụng được tách chiết từ các chủng vi khuẩn MTB phân lập từ bệnh phẩm và được kiểm tra tính kháng các kháng sinh quan tâm trong nghiên cứu này bằng
phương pháp kháng sinh đồ. Nguồn vi khuẩn MTB trong lô thí nghiệm này đã được
kiểm chứng bằng real-time PCR và sử dụng cùng một loại mật độ (105 copy/ml) cho tất cả các trường hợp. Các kí hiệu wt và mut tương ứng lần lượt với đặc tính hoang
dại và đột biến.
Các biểu đồ ở các hình 3.14a,3.14b và 3.14c cho thấy các mẫu MTB mang các dạng đột biến (kí hiệu Mut) có tín hiệu huỳnh quang vượt trên tín hiệu nền, các mẫu MTB dạng hoang dại (kí hiệu WT) có tín hiệu huỳnh quang thấp hơn tín hiệu nền.
emb/306 Mut ATGGTG
emb/306 wt
emb/306 Mut ATGATA
Hình 3.14c. Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của các hệ mồi và mẫu dò
nhằm phát hiện đột biến emb/306/ATGGTG (biểu đồ màu xanh) và
emb/306/ATGATA (biểu đồ màu đỏ).
katG/315 Mut
katG/315 wt
Hình 3.14a. Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi và mẫu dò nhằm phát hiện đột
biến katG/315/AGCACC.
Hình 3.14b. Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi và mẫu dò nhằm phát hiện đột