Nhiệt độ lai (nhiệt độ bắt cặp) của phản ứng phụ thuộc trực tiếp vào độ dài và thành phần của các oligonucleotide. Nên sử dụng nhiệt độ bắt cặp Ta (annealing temperature) thấp hơn 50C so với nhiệt độ nóng chảy Tm của cặp mồi sử dụng. Nếu tạo ra sản phẩm không đặc hiệu, nhiệt độ bắt cặp phải được tối ưu bằng cách tăng từng bước từ 1-20C. Khi nhiệt độ bắt cặp Ta quá thấp, các mồi có thể bắt cặp với các trình tự đích khác do những base đơn bắt cặp nhầm có thể xảy ra. Điều này rất tốt với mục đích khuếch đại các trình tự tương tự hay họ hàng. Tuy nhiên, nó có thể dẫn tới khuếch đại không đặc hiệu và giảm hiệu suất sản phẩm mong muốn nếu base đầu 3’ của mồi bắt cặp với trình tự đích. Nếu giá trị Ta quá cao, rất ít sản phẩm
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 51 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
được tổng hợp do sự bắt cạp của mồi bị giảm. Thời gian bắt cặp không lâu, hầu hết trong 30 giây hoặc ít hơn [3,8,9,10]. Do vậy, nhiệt độ lai tối ưu của phản ứng sẽ khắc phục được các sai sót trên và cho hiệu quả khuếch đại tối đa.
Tiến hành khảo sát nhiệt độ lai theo dãy Gradient nồng độ sau: 70,0; 69,3; 68,1; 66,2; 63,6; 62; 60,8; 60,00 C trên máy BIORAD – CFX 96.
2.3.3.4 Khảo sát nồng độ mồi của phản ứng
Mồi là yếu tố quan trọng quyết định độ đặc hiệu và ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng. Việc thiết kế mồi đặc hiệu và sử dụng nồng độ mồi thích hợp sẽ dẫn đến phản ứng có sản phẩm hay không. Nồng độ mồi quá cao có thể cho kết quả không đặc hiệu và tạo ra cấu trúc nhị phân mồi. Nồng độ mồi quá thấp sẽ ảnh hưởng đến kết quả phản ứng, trừ khi mồi có độ suy biến cao[17]. Khi tiến hành khảo sát nồng độ mồi, chúng tôi thực hiện các phản ứng real-time PCR ở cùng một điều kiện với nhiệt độ lai là nhiệt độ lai tối ưu đã khảo sát ở trên. Thành phần các chất trong phản ứng cũng giống nhau, chỉ có một sự khác biệt giữa các phản ứng là nồng độ mồi có trong phản ứng. Trong nội dung đề tài này, để tìm nồng độ mồi tối ưu, chúng tôi khảo sát nồng độ mồi theo dãy nồng độ sau: 100, 200, 300, 400, 500nM trong một thể tích phản ứng.
2.3.3.5 Khảo sát nồng độ mẫu dò của phản ứng
Mẫu dò (mẫu dò) phải đặc hiệu với trình tự đích và để tạo ra tín hiệu huỳnh quang thì mẫu dò phải nằm giữa hai mồi xuôi và ngược. Trong phản ứng real-time PCR với mẫu dò TaqMan, khuếch đại không đặc hiệu do mồi sai vị trí hoặc do hiện tượng nhị phân mồi cũng không tạo ra tín hiệu [8,10]. Do vậy, nồng độ mẫu dò cũng ảnh hưởng đến sự phát huỳnh quang và đọc tín hiệu sau mỗi chu kỳ của phản ứng. Nồng độ mẫu dò quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng xấu đến kết quả phản ứng. Để lựa chọn nồng độ mẫu dò tối ưu, chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ mẫu dò theo dãy nồng độ sau: 100, 200, 300, 400, 500nM. Thành phần phản ứng đều như nhau, nhiệt độ lai và nồng độ mồi tối ưu đã khảo sát ở trên, chỉ có nồng độ mẫu dò là thay đổi
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 52 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
2.3.3.6 Khảo sát nồng độ Mg2+ của phản ứng
Ion Mg2+ cũng là một trong những thành phần ảnh hưởng tới kết quả phản ứng. Ở một nồng độ tối ưu, ion này làm tăng khả năng bắt cặp của mồi vào bản mẫu và hoạt động kéo dài của Taq DNA polymerase, tạo sự kết hợp chặt chẽ giữa các dNTP. Nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq DNA polymerase bị ức chế. Ngược lại, nếu nồng độ Mg2+ quá cao sẽ không cho sản phẩm khuếch đại hoặc cho sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Vì vậy để xác định nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng, chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ Mg2+ theo dãy nồng độ sau: 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0mM. Trong phản ứng khảo sát nồng độ Mg2+, các chỉ tiêu về nhiệt độ lai tối ưu, nồng độ mồi, mẫu dò tối ưu được giữ nguyên, chỉ có nồng độ Mg2+ là thay đổi.
2.3.3.7 Khảo sát độ lặp lại của phản ứng real-time PCR
Tính biến động của phản ứng real-time PCR là một yếu tố rất quan trọng, chính điều này có thể làm sai lệch kết quả. Trên cùng một mẫu bệnh phẩm, kết quả thu được có thể khác nhau giữa các lần thí nghiệm, cũng như giữa các phòng thí nghiệm khác nhau. Khả năng gây ra sự khác biệt này có thể là do thao tác của người tiến hành, sự biến động của các thành phần hóa chất trong phản ứng hoặc do sự khác biệt giữa các phương pháp chuẩn bị mẫu, cũng như phương pháp tách chiết HBV DNA… Để đánh giá độ lặp lại của phản ứng real-time PCR, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại trong cùng một lần thí nghiệm (intra-assay) và độ lặp lại giữa các lần thí nghiệm khác nhau (inter-assay).
2.3.3.8 Khảo sát độ nhạy của phản ứng
Dung dịch MTB DNA gốc có nồng độ 1 x 107 copies/ml được pha loãng bậc 10 liên tiếp trước khi tiến hành khảo sát độ nhạy của phản ứng. Chuẩn bị các eppendorf vô trùng chứa 90μl dung dịch TE 1X đã vô trùng. Sử dụng pipetman và đầu tip vô trùng, hút 10μl dung dịch MTB DNA gốc cho vào eppendorf có chứa sẵn 90μl dung dịch TE 1X, đồng nhất mẫu bằng máy vortex và ly tâm ở tốc độ dưới 2000 vòng/phút để được dung dịch có độ pha loãng ở nồng độ 10-1. Tiếp tục thực hiện các thao tác tương tự để được dung dịch MTB DNA có độ pha loãng 10-2, 10-
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 53 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
3… Dung dịch MTB DNA sau khi được pha loãng thành nhiều nồng độ bậc 10 liên tiếp được sử dụng để khảo sát độ nhạy. Độ nhạy của phản ứng tương ứng với nồng độ DNA đột biến thấp nhất cho kết quả dương tính.
2.3.3.9 Phương pháp khảo sát độ đặc hiệu của hệ mồi, mẫu dò
Nhằm xác định khả năng nhân bản chọn lọc của mồi và mẫu dò đã thiết kế, đầu tiên chúng tôi tiến hành kiểm tra trên lý thuyết bằng cách sử dụng phần mềm Annhyb để kiểm tra sự bắt cặp của mồi trên genome của một số loài vi sinh vật thường gặp trong huyết thanh như MTB, EBV, HCV,HPV, CMV. Về mặt thực nghiệm, để đảm bảo các cặp mồi và mẫu dò được sử dụng trong phản ứng real-time PCR là đặc hiệu cho MTB, các phản ứng real-time PCR giữa các cặp mồi và mẫu dò cùng với DNA tách chiết của một số đối tượng vi sinh vật khác sẽ được thiết lập. Hệ primer, mẫu dò được xem là đặc hiệu đối với đột biến kháng isoniazid, Rifampin, ethambutol của MTB sẽ cho kết quả dương tính với mẫu chứng dương và cho kết quả âm tính với mẫu chứng âm và các chủng vi sinh vật khác.
2.3.4 Thiết lập quy trình chẩn đoán và thực hiện trên mẫu bệnh phẩm
Từ kết quả của các thí nghiệm tối ưu hóa sản phẩm PCR, chúng tôi thiết lập lên quy trình tối ưu nhất sau đó thử nghiệm trên 50 mẫu bệnh phẩm. Kết quả được trình bày ở chương 3. . 100ul dung dịch MTB DNA có nồng độ 1x 107 copies/ml
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 54 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Đánh giá các thông số của các oligonucleotide thiết kế 3.1.1 Trình tự và vị trí của các oligonucleotide
Trình tự của các primer và mẫu dò phát hiện đột biến INH tại vị trí codon 315, kháng RIF tại vị trí codon 516 và kháng EMB tại vị trí codon 306 đã được trình bày trong bảng 2.1 ở chương 2. Vì các đột biến kháng thuốc trong đề tài nghiên cứu thuộc dạng đột biến điểm, do vậy trình tự hoang dại và trình tự đột biến chỉ khác nhau bởi một nucleotide. Để phân biệt sự khác nhau này chúng tôi thiết kế các đoạn mồi ngược bắt cặp hoàn toàn với trình tự đột biến và có một trình tự bất đối xứng ở nucleotide thứ nhất tính từ đầu 3’-OH khi bắt cặp với trình tự hoang dại. Các mồi này đi kèm với các mồi xuôi bắt cặp hoàn toàn với cả trình tự hoang dại lẫn trình tự đột biến.
Sau đó, chúng tôi sử dụng phần mềm Annhyb để kiểm tra lại trình tự và vị trí của các oligonucleotide thiết kế có đúng với mục đích của đề tài hay không.
Hình 3.1 : Kết quả kiểm tra hệ mồi và mẫu dò của phản ứng1 bằng phần mềm Annhyb
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 55 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
Kết quả như hình 3.1 cho thấy cặp mồi katG315R và katG315F hoàn toàn đặc hiệu với MTB cho phép nhân bản trình tự có độ dài 92bp.
Hình 3.2 : Kết quả kiểm tra hệ mồi và mẫu dò của phản ứng 2 bằng phần mềm Annhyb
Kết quả hình 3.2 cho thấy hệ mồi rpoB516F và rpoB516R hoàn toàn đặc hiệu với MTB cho phép khuếch đại đoạn trình tự có độ dài 99bp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.3: Kết quả kiểm tra hệ mồi và mẫu dò của phản ứng 3 bằng phần mềm Annhyb
Hình 3.3 cho thấy hệ mồi và mẫu dò chúng tôi thiết kế hoàn toàn đặc hiệu với MTB cho phép nhân lên đoạn trình tự có độ dài 90bp.
Vị trí đột biến
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 56 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
Hình 3.4: Kết quả kiểm tra hệ mồi và mẫu dò của phản ứng 4 bằng phần mềm Annhyb
Kết quả so hệ mồi và mẫu dò với trình tự cho thấy hệ mồi và mẫu dò hoàn toàn đặc hiệu với MTB. Hệ mồi khếch đại trình tự có độ dài 74bp.
3.1.2 Đặc tính của các oligonucleotide
Tính chất vật lý của các oligonucleotide được thiết kế và kiểm tra bằng phần mềm OligoAnalysis trên IDT (Hoa Kỳ) về các thông số như chiều dài, thành phần %GC, nhiệt độ nóng chảy (Tm), cấu trúc kẹp tóc, cấu trúc tự thân giữa các oligonucleotide giống nhau được tổng hợp ở bảng 2.1.
Tên Số bp %GC Tm Năng lượng tự do ∆G kcal.mol-1 Hairpin Selff-dimer katG 315F 19 56% 520C -4.3 -11.3 katG 315R 18 61% 570C -1.8 -9.75 Mẫu dò katG315 25 60% 620C -1.24 -9.75 rpoB 516F 18 50% 530C -1.84 -5.3 rpoB 516R 18 61% 580C -4.1 13.3 Mẫu dò rpoB516 23 65% 660C -2.7 -7.48 Vị trí đột biến
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 57 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn emb 306F1 18 66% 600C -2.1 -3.61 emb 306R12 18 66% 620C -3.03 -9.75 Mẫu dò 306R12 25 50% 59.50C 0.41 -16 Emb 306F345 25 60% 58.40C -1.4 -5.38 Emb 306R3 17 76% 63.50C -0.46 -6.53 Mẫu dò emb306-345 24 65% 63.40C -3.06 -10.014
Bảng 3.1 : Bảng thông số kỹ thuật của mồi và mẫu dò
Ghi chú:
- Tm : Nhiệt độ nóng chảy (nhiệt độ biến tính)
- ∆G: Chỉ số xác định độ bền của một cấu trúc bậc hai.
Qua bảng 3.1, chúng tôi nhận thấy:
- Kích thước và tỷ lệ các base trong các primer và mẫu dò đều phù hợp với tiêu chuẩn thiết kế.
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi chênh lệch nhau không quá 50
C; - Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi và mẫu dò chênh lệch nhau từ 5-8 0C hoàn toàn phù hợp với tiêu chuẩn.
- Về thành phần GC: nằm trong khoảng tỷ lệ tốt nhất 40-65%. Tuy nhiên trong bảng có thể thấy các mồi ngược của phản ứng xác định đột biến trên gen emb đều có tỷ lệ G/C cao nhưng vẫn đảm bảo Tm <650
C.
- Năng lượng tự do (∆G) của các cấu trúc thứ cấp như cấu trúc kẹp tóc (Hairpin), cấu trúc self-dimer và cấu trúc hetero-dimer càng lớn hơn -9 kcal.mol-1 thì các cấu trúc đó càng kém bền vững và không ảnh hưởng đến phản ứng. Trong bảng trên, ta thấy ∆G trong cấu trúc self-dimer của mẫu dò có một dạng có ∆G <- 9,20kcal.mol-1. Vì nó không quá nhỏ so với -9kcal.mol-1 nên có thể chấp nhận được và chúng ta có thể tăng nhiệt độ bắt cặp của phản ứng để khắc phục.
Kết quả kiểm tra cấu trúc thứ cấp của các oligonucleotide khác nhau trong các phản ứng được thể hiện trong bảng 3.2,3.3,3.4 và 3.5.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 58 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn katG315F katG315R Mẫu dò katG315 katG315F - -6.68 -8.6 katG315R -6.68 - -9.75 Mẫu dò katG315 -8.6 -9.75 -
Bảng 3.2: Kiểm tra năng lượng liên kết hetero-dimer trong phản ứng 1 – xác định đột biến gen katG tại vị tí 315
rpoB516F rpoB516R Mẫu dò rpoB516
rpoB516F -- >-8.7 >-5.02
rpoB516R >-8.07 -- >-6.07
Mẫu dò rpoB516 >-5.02 >-6.07 --
Bảng 3.3: Kiểm tra năng lượng liên kết hetero-dimer trong phản ứng 2- xác định đột biến gen rpoB tại vị trí 516
emb306F1 emb306R2 Mẫu dò emb306R2 emb306F1 -- >-9.8 >-9.8 emb306R2 >-9.8 -- >-9.8 Mẫu dò emb306R2 >-9.8 >-9.8 -- (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.4: Kiểm tra năng lượng liên kết hetero-dimer trong phản ứng 3- xác định đột biến gen emb306 (A→G)
emb306F1 Emb306R2 Mẫu dò emb306R2 emb306F1 -- >-5.19 >-5.19 emb306R2 >-5.19 -- >-6.53 Mẫu dò emb306R2 >-5.19 >-6.53 --
Bảng 3.5 : Kiểm tra năng lượng liên kết hetero –dimer trong phản ứng 4 – xác định đột biến gen emb306 (G→A)
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 59 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
Từ các bảng kiểm tra năng lượng của cấu trúc thứ cấp của các mồi và mẫu dò trong từng phản ứng chúng ta thấy có những phản ứng có mức năng lượng như - 9,75kcal/mol ở phản ứng 1 hay -9,8kcal/mol ở phản ứng 3, mức năng lượng như vậy là thấp nhưng không quá nhiều so với -9kcal/mol. Để khắc phục chúng tôi tăng nhiệt độ bắt cặp của phản ứng (Tm) lên để phá vỡ năng lượng liên kết.
3.1.3 Khả năng bắt cặp của hệ mồi, mẫu dò trên ly thuyết
Để xác định khả năng bắt cặp đặc hiệu của các primer, mẫu dò thiết kế ở trên, chúng tôi thực hiện ClustalX với 123 trình tự gen của HBV từ NCBI. Đồng thời, chúng tôi kiểm tra độ đặc hiệu của các oligonucleotide bằng công cụ Blast trên NCBI
3.1.3.1 Khả năng bắt của mồi katG315F
Hình 3.5 : Khả năng đặc hiệu của mồi katG-315F đối với gen katG của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast (NCBI)
Căn cứ vào hình 3.5, khả năng đặc hiệu của katG-315F đối với MTB rất cao vì các chỉ số Query coverage và Max ident lần lượt là 100%. Kết quả ClustalX cũng cho thấy trình tự mồi hoàn toàn đặc hiệu với hệ gen MTB.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 60 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
3.1.3.2 Khả năng bắt cặp của mồi ngược katG-315R
Hình 3.6: Khả năng đặc hiệu của mồi katG-315R đối với gen katG của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast (NCBI)
Căn cứ vào kết quả ClustalX mồi ngược katG-315R trong hình 3.6, các nucleotide hoàn toàn tương đồng, duy chỉ có một nucleotide ở đầu 3’ của mồi là không bảo tồn. Vì đây là mồi phát hiện đột biến nên có sự sai khác tại vị trí này giữa các trình tự không chứa đột biến và trình tự đột biến từ ngân hàng dữ liệu gen. Các chỉ số Query coverage và Max ident trong hình 3.3 đều đạt 100% nên mồi ngược katG315R là hoàn toàn đặc hiệu với MTB.
HVCH: Khổng Thị Minh Ngân 61 GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn
3.1.3.3 Khả năng bắt cặp của mẫu dò Mẫu dò katG315
Hình 3.7: Khả năng đặc hiệu của Mẫu dò katG 315 đối với gen katG của MTB bằng công cụ ClustalX và Blast(NCBI)
Mẫu dò katG315 hoàn toàn tương đồng với các trình tự gen MTB khi so hàng bằng phần mềm ClustalX ở hình 3.7. Khi so sánh mẫu dò katG315 với các trình tự trên