Luận văn :Định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 bằng kỹ thuật Real-time PCR

Định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 bằng kỹ thuật Real-time PCR

Mở đầu

Theo thống kê của Tổ chức Nghiên cứu ung thư Thế giới (InternationalAgency for Research on Cancer_ IARC), ung thư phổi là nguyên nhân gây tửvong hàng đầu trong số các bệnh về ung thư Tổng số người chết vì ung thư phổi

hàng năm cao hơn tổng số người chết vì ung thư vú, ung thư ruột và ung thưtuyến giáp, và đứng thứ hai trong tổng số tử vong vì bệnh sau các bệnh về tim

mạch Các thống kê từ hiệp hội Ung thư quốc gia của Việt Nam cũng đưa ranhững cảnh báo tương tự, số bệnh nhân ung thư phổi gia tăng liên tục trongnhững năm gần đây Phần lớn bệnh nhân ung thư khi được phát hiện đã ở giai

đoạn cuối không chữa trị được, đa số bệnh nhân bị tử vong Vì rất nhiều lí donhư: hút thuốc lá, môi trường sống bị ô nhiễm, thực phẩm không an toàn… nên

căn bệnh nguy hiểm này ngày càng trở nên phổ biến Mặc dù đây là một cănbệnh rất nguy hiểm nhưng nếu bệnh nhân được phát hiện sớm và được điều trịtheo những phác đồ thích hợp thì người bệnh vẫn có cơ hội được cứu sống, thậm

chí là khỏi bệnh Ngoài những phương pháp chẩn đoán ung thư truyền thốngnhư: chụp hình phổi bằng X_quang, chụp CT Scan phổi….các nhà khoa họcđang nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra cách chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh

ung thư Sự phát triển như vũ bão của ngành sinh học phân tử đã mở ra mộthướng mới trong nghiên cứu Sinh_Y_Dược học Việc tìm ra những chỉ thị sinhhọc đã giúp cho các bác sĩ chẩn đoán và phát hiện bệnh một cách nhanh chóng,có độ chính xác cao hơn Các chỉ thị sinh học có liên quan đến chẩn đoán bệnhung thư cũng đang được quan tâm Trong đo, Cyfra21-1 là một chỉ thị có độ

nhạy tương đối cao đối với ung thư phổi và đang được nghiên cứu.

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH1

Do đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Định lượng kháng nguyênCyfra 21-1 bằng kỹ thuật Real-time PCR” Để từ đó nghiên cứu và tạo ra một

bộ Kít định lượng để có thể chẩn đoán Ung thư phổi một cách nhanh chóng, cóđộ chính xác cao.

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Ung thư phổi

1.1.1 Khái niệm chung về ung thư phổi

Ung thư phổi còn được gọi là ung thư phế quản – phổi nguyên phát, gây ra do tếbào ung thư phát triển từ biểu mô phế quản (hiếm khi phát triển từ biểu mô phếnang) Ung thư phổi khi đã phát hiện được thường là một khối rắn chắc có đường

kính từ 2- 10cm, thậm chí còn lớn hơn Mặt ngoài khối u thường gồ ghề, nhiềumúi, nhăn nhúm Mặt cắt khối u thường đồng nhất, hay có mầu trắng như tổ chức

1.1.2 Phân loại ung thư phổi

Tùy thuộc vào hình dạng quan sát được dưới kính hiển vi mà người ta phân chiaung thư phổi thành hai loại chính: ung thư phổi tế bào nhỏ và ung thư phổikhông phải tế bào nhỏ Mỗi loại ung thư phát triển theo những cách khác nhau và

được điều trị theo những phác đồ điều trị khác nhau.

- Ung thư phổi tế bào nhỏ (small_cell carcinoma) chiếm khoảng 20% trong số

các bệnh ung thư phổi, loại này thường phát triển ở phế quản – phổi (không ở

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH3

Hình 1: Ung thư phổi

ngoại vi phổi) Mặc dù tế bào ung thư là những tế bào nhỏ, nhưng chúng pháttriển rất nhanh và tạo thành những khối u lớn, có khả năng lan rất xa trước khi có

triệu chứng lâm sàng Nhiều trường hợp khi phát hiện không thể mổ được nữa,tử vong nhanh Đây là loại ung thư có quan hệ mật thiết với thuốc lá và là loại

ung thư ác tính nhất.[3]

- Ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (non small _cell carcinoma) chiếm

khoảng 80% trong số các bệnh ung thư phổi, ung thư phổi không phải tế bào nhỏthường gặp hơn ung thư phổi tế bào nhỏ Nó thường phát triển và lan chậm hơnung thư phổi tế bào nhỏ Có ba loại ung thư phổi không phải tế bào nhỏ chủ yếu,

chúng được đặt tên theo loại tế bào mà từ đó ung thư phát triển.[3]

+ Ung thư tế bào tuyến (adenocarcinoma, AC): xuất phát từ tế bào tuyến

nhầy trong thành phế quản, chiếm tỷ lệ khoảng 30-45% trong các loại ung thưphổi Đây là loại ung thư phổi phổ biến nhất ở phụ nữ và những người không hút

+ Ung thư tế bào sừng (squamous_cell carcinoma; SCC): hay xuất hiện ở phế

quản lớn và làm chít hẹp lòng phế quản.Đây là loại ung thư phổi phổ biến nhất ởnam giới, chiếm tỷ lệ khoảng 30-35% trong các loại ung thư phổi.[3]

+ Ung thư tế bào lớn (large_cell carcinoma; LCC): hình thành gần bề mặt

phổi, chiếm tỷ lệ khoảng 10-15% trong các loại ung thư phổi.[3]

1.1.3 Triệu chứng của bệnh ung thư phổi

Những người mắc bệnh ung thư phổi thường có các triệu chứng sau:- Ho không khỏi và ngày càng nặng hơn.

- Thường xuyên thấy đau ngực.- Ho ra máu.

- Khó thở, ngạt mũi, khản giọng.- Phù nề vùng mặt và cổ.

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH4

- Mệt mỏi.

- Mất cảm giác ngon miệng, sút cân.- Thường xuyên bị viêm phổi và viêm phế quản.

1.1.4 Chẩn đoán bệnh ung thư phổi

Khi người bệnh bị nghi ngờ mắc ung thư phổi, các bác sĩ sẽ xem xét tiền sửngười bệnh, tiền sử hút thuốc, tiếp xúc với các chất ở môi trường tự nhiên và môi

trường lao động, các yếu tố di truyền… Sau đó, các bác sĩ có thể cho chụpX_Quang lồng ngực, xét nghiệm tế bào trong đờm (quan sát dưới kính hiển vi

những tế bào lấy từ mẫu dịch nhầy ở phổi khi ho), đây là một xét nghiệm đơngiản mà có thể có ích cho việc phát hiện ra bệnh ung thư phổi Ngoài ra, con có

thể sử dụng kĩ thuật Sinh thiết (lấy một mẫu mô nhỏ ở phổi để quan sát dướikính hiển vi Qua đó có thể cho biết một người có bị ung thử phổi hay không).Một số thủ thuật dùng để lấy mẫu bệnh phẩm: nội soi phế quản, chọc hút bằng

kim, chọc dịch màng phổi, mở lồng ngực… Hiện nay, còn có thêm các xétnghiệm mẫu máu, sử dụng các chỉ thị như Cyfra 21-1 để chẩn đoán bệnh.[1]

1.1.5 Các nguyên nhân dẫn đến bệnh ung thư phổi

Các công trình nghiên cứu hiện nay chưa cho biết chính xác nguyên nhân gây raung thư phổi Tuy vậy, người ta cũng xác định được những yếu tố gắn liền vớiquá trình phát sinh bệnh như: hút thuốc lá, tiếp xúc nhiều với các hóa chất độc

hại như amiang, niken….

1.1.5.1 Nghiện hút thuốc lá, thuốc lào

Trong khói thuốc lá có chứa các chất Hydrocacbua thơm nhiều vòng, trong số đóđộc nhất là chất 3,4 benzopyrene với hàm lượng 0.5 µg/1 điếu thuốc lá(P.Freour, 1979) Chất này đóng vai trò quan trọng trong phát sinh ung thư phổi.

Ngoài ra trong khói thuốc lá còn chứa các chất gây ung thư khác như

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH5

nitrosamine, benzanthracene Các chất này cũng là nguyên nhân gây ra bệnh Ungthư phổi.

Trong khóa họp vào tháng 11 năm 1982 tại Geneve, các chuyên gia về ung thưphổi đã thống nhất kết luận rằng 80-90% nguyên nhân dẫn đến ung thư phổi làdo hút thuốc lá Tại Việt Nam, theo thống kê trên 389 bệnh nhân mắc ung thưphổi đã được phẫu thuật thì: 70% số bệnh nhân có hút thuốc lào, 52% hút thuốclá, 10,49% hút cả thuốc lá và thuốc lào Những người hút các loại khác và những

người hít phải khói thuốc lá (hút thuốc lá thụ động) cũng có nguy cơ tương tự.Ngừng hút thuốc lá sẽ làm giảm đáng kể khả năng mắc ung thư phổi.

1.1.5.2 Radon

Radon là một chất khí phóng xạ không màu, không mùi và không nhìn thấy bằngmắt thường Trong tự nhiên radon có trong sỏi đá Nó có thể làm tổn hại tới phổivà từ đó có thể dẫn đến ung thư phổi Những người làm việc trong hầm mỏ cóthể tiếp xúc với khí radon Ở một số vùng ở Mỹ, người ta còn tìm thấy khí radon

trung biểu mô.

1.1.5.4 Nghề nghiệp

Các thống kê bệnh học cho thấy, chất phóng xạ đóng vai trò quan trọng trongphát sinh bệnh ung thư Những người thường xuyên tiếp xúc với các chất phóng

xạ, niken, cromat, amian và các chất sinh ra do chưng cất hắc ín thường dễ bị

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH6

ung thư Các chất này cũng là nguyên nhân dẫn đến Ung thư phổi ở những ngườikhông hút thuốc (chiếm khoảng 15-20%).

Nghiên cứu của Doll (1958) cho thấy: công nhân làm việc trong công nghiệpniken bị chết do Ung thư phổi là 26%, cao hơn 9 lần so với những công nhân làm

việc trong các ngành công nghiệp khác.

1.1.5.5 Môi trường

Các nhà nghiên cứu đã tìm ra mối liên kết giữa bệnh ung thư phổi và sự phơinhiễm với một số chất gây ô nhiễm môi trường không khí nhất định (ví dụ: cácsản phẩm phụ sinh ra trong quá trình đốt dầu Diezen và những nguyên liệu hóathạch) Tuy nhiên, mối quan hệ này vẫn chưa được xác định một cách rõ ràng và

vẫn đang tiếp tục được nghiên cứu.

Nhiều thống kê cho thấy, tỉ lệ mắc ung thư phổi ở các thành phố công nghiệp,đặc biệt là các thành phố có ngành công nghiệp hóa chất cao hơn hẳn so với cácvùng nông thôn Trong bầu khí quyển của các thành phố này có chứa nhiều chấtđộc hại như benzopyren… Các chất này kích thích và gây ra phản ứng với lớpniêm mạc của đường hô hấp làm cho quá trình tiết chất nhầy bị chậm lại, sau đóbiểu mô bị bong ra, rồi lại được tái sinh Những chu kì như vậy liên tiếp diễn rađã kích thích sự tăng sản của tế bào đáy, dị sản của tế bào biểu mô đẫn đến sự

hình thành và phát triển của các tế bào ung thư.

so với một người chưa bao giờ mắc bệnh ung thư phổi.Bỏ hút thuốc sau khi đượcchẩn đoán ung thư phổi có thể ngăn ngừa nguy cơ bị ung thư phổi lần hai.Các nhà nghiên cứu vẫn tiếp tục tìm hiểu những nguyên nhân gây ra bệnh ungthư phổi và tìm kiếm những cách thức để phồng chống căn bệnh này Chúng tađã biết, cách tốt nhất để phòng chống bệnh ung thư phổi là bỏ hút thuốc lá, càng

bỏ hút thuốc lá sớm thì càng tốt Thậm chí, nếu bạn đã hút thuốc lá trong mộtthời gian dài thì việc bỏ hút thuốc lá cũng vẫn không bao giờ là quá muộn.

1.2 Kháng nguyên Cyfra 21-1

1.2.1 Kháng nguyên1.2.1.1 Định nghĩa

Kháng nguyên được định nghĩa là một chất tương tác với các phân tử kháng thểvà thụ thể kháng nguyên trên các tế bào lympho Một chất gây miễn dịch là mộtkháng nguyên được cơ thể nhận biết như một chất ngoại lai và kích thích phảnứng miễn dịch thích ứng Để đơn giản hóa, kháng nguyên và chất gây miễn dịch

đều được xem là kháng nguyên.[2,3]

1.2.1.2 Bản chất hóa học của kháng nguyên

Về bản chất hóa học, kháng nguyên là những phân tử protein có khối lượng phântử lớn (kể cả các protein cộng hợp như các glycoprotein, lipoprotein vànucleoprotein) và các polysaccharide (kể cả lipopolysaccharide) Các khángnguyên protein và polysaccharide này được tìm thấy trên bề mặt của virus, tế

bào vi khuẩn, nấm, đơn bào và tế bào người.[3]

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH8

1.2.1.3 Nguồn gốc kháng nguyên1.2.1.3.1 Kháng nguyên ngoại sinh

Kháng nguyên ngoại sinh là kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể từ bên ngoài do:hít, ăn, tiêm Bằng quá trình nhập nội bào hoặc thực bào, các kháng nguyên này

được đưa vào tế bào trình diện kháng nguyên (ACP) và được xử lí thành cácmảnh nhỏ Sau đó các ACP trình diện các mảnh nhỏ này cho tế bào Lympho T

giúp đỡ (CD4+) bằng cách dung phân tử phù hợp mô loại II trên bề mặt củachúng Một số tế bào Lympho T đặc hiệu cho phức hợp peptide: MHC Chúngtrở nên hoạt hoá và bắt đầu tiết Cytokine Cytokine là các chất có khả năng hoạt

hoá Lympho bào T độc tế bào (CLL), tế bào Lympho B tạo kháng thể, đại thựcbào và các tế bào khác.

1.2.1.3.2 Kháng nguyên nội sinh

Kháng nguyên nội sinh là các kháng nguyên được sản xuất bên trong tế bào, làkết quả của quá trình chuyển hoá tế bào bình thường, hoặc do nhiễm khuẩn nộibào hay nhiễm virus Sau đó các mảnh kháng nguyên được trình diện trên bề mặt

tế bào trong phức hợp phân tử phù hợp mô loại I Nếu tế bào Lympho T CD8+độc tế bào nhận ra chúng, các tế bào Llympho T này bắt đầu tiết các loại độc tốkhác nhau gây ly giải hoặc chết theo chương trình (apoptosis) tế bào bị nhiễm.Để giữ tế bào độc tế bào khỏi giết nhầm các tế bào vốn chỉ sản xuất protein củachính nó, các tế bào lympho T tự đáp ứng được loại ra khỏi quá trình miễn dịchqua cơ chế dung nạp trung ương (cũng được biết là quá trình chọn lọc âm tínhxảy ra ở tuyến ức) Chỉ những Lympho bào T độc tế bào nào không phản ứngvới peptide của chính nó (peptide này được trình diện trong tuyến ức qua phân tử

MHC loại I) mới được phép vào máu.

Có một ngoại lệ không thuộc ngoại sinh lẫn nội sinh được gọi là trình diện chéo.

1.2.1.4 Kháng nguyên khối u

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH9

Kháng nguyên khối u là các kháng nguyên được trình diện bởi các phân tử MHCI trên bề mặt tế bào khối u Đôi khi các kháng nguyên này chỉ được trình diệnbởi các tế bào khối u và không có ở tế bào thường Trong trường hợp này, chúngđược gọi là kháng nguyên đặc hiệu khối u và thường là kết quả của một đột biếnđặc hiệu cho khối u Phổ biến hơn, các kháng nguyên này được trình diện ở tế

bào khối u lẫn tế bào thường, khi đó chúng được gọi là kháng nguyên liên hệkhối u Nếu lympho bào T độc bào nhận ra kháng nguyên này, chúng có thể tiêu

diệt tế bào khối u trước khi tế bào khối u tăng sinh và di căn.

Kháng nguyên khối u cũng có thể có trên bề mặt khối u ở dạng thụ thể bị độtbiến Trong trường hợp này chúng bị nhận diện bởi tế bào B.

1.2.1.5 Các loại kháng nguyên

-Miễn dịch nguyên: kháng nguyên loại này kích thích đáp ứng miễn dịch khi

được đưa vào trong cơ thể Miễn dịch luôn luôn là một đại phân tử (protein,polysaccharide) Khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của nó phụ thuộc vào

tính lạ đối với vật chủ, kích thước phân tử, thành phần hoá học và tính khôngđồng nhất (vd: phân tử protein chứa nhiều loại amino axit khác nhau).

-Dung nạp nguyên: kháng nguyên loại này kích thích tình trạng không đáp

ứng miễn dịch đặc hiệu do hình dạng phân tử của nó Khi thay đổi hình dạng, nócó thể trở thành miễn dịch nguyên.

-Dị ứng nguyên: đây là chất gây phản ứng dị ứng Chúng có thể xâm nhập

vào cơ thể qua nhiều con đường như: ăn, hít, tiêm hoặc tiếp xúc với da.Tế bào trình diện với kháng nguyên của chúng qua phân tử phù hợp mô Các tếbào miễn dịch khác nhau có thể được hoạt hoá tuỳ thuộc vào kháng nguyên được

trình diện và loại phân tử phù hợp mô.

1.2.2 Kháng nguyên Cyfra 21-1

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH10

Trên thế giới hiện nay có khá nhiều chỉ thị sinh học liên quan đến ung thư phổi,trong đó các nhà khoa học đang rất quan tâm đến một chỉ thị mới, có độ nhạycao với ung thư phổi là Cyfra 21-1 nằm trong nhóm chỉ thị Cytokeratin, một cấu

trúc trong bộ khung tế bào.

1.2.2.1 Cytokeratin

Cytokeratin thuộc họ sợi trung gian, đặc biệt hữu ích trong chẩn đoán bất thườngở tế bào, chẳng hạn như ung thư Bởi vậy, các nhà ung thư học hiện nay đangtích cực nghiên cứu kỹ hơn về cấu trúc và vai trò của Cytokeratin, nhằm tìm ra

giải pháp chống lại sự hoành hành của căn bệnh toàn cầu – Căn bệnh ung thư.Cấu trúc sợi đã được quan sát trong nhân và tế bào chất từ rất lâu Nhưng chỉngần đây, những kiến thức về chức năng thực sự của bộ khung tế bào mới đượctìm hiệu cặn kẽ và chi tiết Ở tế bào nhân chuẩn, bộ khung tế bào được tạo thànhtừ 3 loại cấu trúc sợi, khác nhau về hình thái: vi sợi (microfilament), sợi trung

gian (intermidiatefilament) và vi ống (microtubules) Bộ khung xương tế bàohợp nhất được hình thành từ hệ thống 3 loại sợi là yếu tố then chốt trong một quá

trình như phân bào, vận động và tương tác tế bào với tế bào.

Trong cấu trúc sợi, họ protein sợi trung gian là phức tạp nhất, bao gồm vài trămthành viên khác nhau Dựa trên những đặc điểm như sự tương đồng về trình tựvà cách biểu hiện, người ta phân loại chúng thành một vài nhóm Sợi trung gian

nhóm I và II tạo thành Cytokeratine (theo thứ tự là các protein axit và bazo),trong khi đó sợi trung gian nhóm III gồm các protein axit dạng sợi desmin,vimentin và glial Loại IV bao gồm các sợi protein thần kinh (NF-L, NF-M và

NF-H) và internexin, còn protein nhóm V được gọi là các lamin nhân (chỉ cởnhân tế bào) Các protein cytokeratin còn lại đôi khi được xếp vào nhóm VI,

gồm có felensin và phakinin.

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH11

Cytokeratin biểu mô (sợi trung gian nhóm I và II) được hình thành trong quátrình phát sinh và có liên quan gần gũi về mặt sinh hóa và miễn dịch Ngày nay,

hơn 20 loại Cytokeratin khác nhau đã được biết đến và được chia thành cácnhóm I và II dựa vào tính tương đồng trình tự Các Cytokeratin từ 1-8 tạo thành

nhóm II (53-68 kDa, các thành phần protein trunng tính đến bazo), cònCytookeratin 9-20 tạo thành nhóm I (40-56 kDa, các protein axit), trong đó các

Cytokeratin 8, 18, 19 có nhiều nhất ở các tế bào biểu mô đơn giản.Các Cytokeratin khi giải phóng khỏi các tế bào đang tăng sinh hoặc chết theochương trình, tạo ra các chỉ thị hữu ích cho khối u biểu mô ác tính, phản ánh rõ

nét hoạt động của tế bào Những chỉ thị này xuất hiện đặc trưng cho cácCytokeratin nhất định và sự giải phóng tiểu đơn vị của chúng diễn ra liên quan

đến apoptosis.[9,11,13,14]

1.2.2.1.1 Cấu trúc chung của một Cytokeratin

Một Cytokkeratin điển hình bao gồn 3 vùng: vùng đầu N (không xoắn), vùngtrung tâm (chủ yếu có cấu trúc xoắn) và đầu C (không xoắn).

Phần xoắn ở vùng trung tâm (chủ yếu là cấu trúc xoắn alpha) gồm 300-320 axitamin có tính bảo tồn về trình tự và được chia thành 4 vùng khác nhau: 1A, 1B,2A và 2B Thành phần axit amin của cá vùng xoắn được bảo toàn về kích thước

và chứa các trình tự axit amin lặp lại ở phần dư Các đoạn xoắn tách biệt nhaunhờ các vùng liên kết ngắn hơn là L1, L1-2 và L2.[9,11,13,14,15]

1.2.2.1.2 Biểu hiện của Cytokeratin

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH12

Hình 2: Cấu tạo của Cytokeratin

Cytokeratin biểu hiện khác nhau ở các dạng tế bào biểu mô, ở quy mô phát triểnvà quá trình biệt hóa của các mô Trong suốt quá trình biến đổi của tế bào từ bình

thường thành tế bào ác tính, đặc tính của Cytokeratin thường được duy trì Ưuđiểm này làm cytokeratin được ứng dụng như các chỉ thị khối u Những biến đổi

sau khi dịch mã của các vùng ở trung tâm rất hiếm thấy, nhưng những biến đổinày xuất hiện khá nhiều ở vùng đầu N và C, bao gồm sự phosphoryl hóa,glycosyl hóa và sự vận chuyển glutamine hóa Những biến đổi này làm tăng tính

tan và gây ra sự sắp xếp lại các sợi.

Trong bộ khung, Cytokeratin là điển hình cho tính tan rất thấp, nhưng khi lưuthông người ta nhận thấy rằng các Cytokeratin đều bắt nguồn từ các sợi protein

nguyên vẹn bị biến tính một phần tạo thành các phức hệ nhỏ hoặc các polymerprotein lớn Các phân tử Cytokeratin nguyên vẹn không tham gia trong lưuthông Thời gian bán hủy của sợi Cytokeratin trong lưu thông khoảng 10-15h,phụ thuộc vào kích thước sợi Quá trình giải phóng sợi Cytokeratin tan vào lưu

thông diễn ra rất phức tạp và chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn.

Trong lúc giải phóng tự khối u, có thể nhận ra Cytokeratin với một lượng lớntrong dịch thể gồm: máu, nước tiểu, dịch tế bào và dịch màng phổi Thôngthường trong các cá thể khỏe, nông độ Cytokeratin lưu thông rất thấp Nồng độ

tăng một cách đặc biệt trong những người bệnh có bệnh Ung thư biểu mô.[10]

1.2.2.2 Cyfra 21-1

Cyfra 21-1 là một phân đoạn của cytokeratin 19 (đặt tên theo chữ viết tắt củacytokeratin fragment) tiết ra mạnh khi tế bào biểu mô phổi tăng sinh bất thường.Cytokeratin 19 có cấu trúc giống các cytokeratin khác với kích thước khoảng 40

kDa, gồm 400 axit amin Gene mã hóa cho cytokeratin 19 nằm trên nhiễm sắcthể 17 có kích thước 4667bp với 6 exon mã hóa cho mARN kích thước 1382bp.

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSHHình 3: Sơ đồ gene mã hóa cho Cytokeratin 1913

Fujita.J và các cộng sự cho rằng, sở dĩ cytokeratin 19 (40kDa) mất một phần đầuC để trở thành Cyfra 21-1 (37kDa) có liên quan đến vị trí Met-Asp nhậy cảm với

một số protease.[12,16]

1.3 Kháng thể1.3.1 Đinh nghĩa

Kháng thể là một sản phẩm đặc hiệu được hệ miễn dịch tổng hợp giúp cơthể tấn công các tác nhân gây bệnh Kháng thể là các Immunoglobiulin (có bảnchất glycoprotein), do các tế bào Lympho B, các tương bào (biệt hoá từ LymphoB) tổng hợp và tiết ra giúp hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hoá các tác nhân lạ.

(Vd: các vi khuẩn hoặc virut).[3]

vùng gắn kết kháng nguyên (vùng quyết định bổ trợ, CDR) và thân (Fc) là mộtvùng hằng định Các vùng hằng định chứa “lẫy khởi động” chức năng phản ứng

lại kích thích bằng việc gắn kết các phức hệ của tế bào khác của hệ miễn dịch.Kháng thể thực hiện các chức năng cơ bản như liên kết đặc hiệu với kháng

nguyên, hoạt hoá các bổ thể, hoạt hoá các tế bào miễn dịch.

1.3.3 Phân loại kháng thể1.3.3.1 Kháng thể đa dòng

Là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau trên mộtkháng nguyên cho trước Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp nhiều khángthể tương ứng với các epitope của cùng một kháng nguyên Đáp ứng như vậy gọilà đa dòng Các kháng thể đa dòng, mỗi kháng thể liên kết với một epitope khác

1.3.3.2 Kháng thể đơn dòng

Là những kháng thể được tổng hợp từ một dòng tế bào Lympho B Chúng chỉnhận biết một epitope đặc hiệu trên một kháng nguyên cho sẵn.[3]

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH15

Hình 4: Cấu tạo của kháng thể

Để tăng hiệu quả điều trị của các kháng thể đơn dòng, các nhà khoa học đãkết hợp các gene tái tổ hợp mã hoá các kháng thể đơn dòng có vùng gắn kết vớicùng một vị trí (một epitope) của kháng nguyên Các kháng nguyên đơn dòng có

thể là:

- Kháng thể đơn dòng chuột- Kháng thể đơn dòng khỉ- Kháng thể đơn dòng gà- Kháng thể đơn dòng người

1.3.3.3 Phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng

- Kỹ thuật hybridoma

- Tạo mảnh kháng thể đơn dòng bằng kỹ thuật gene

- Kỹ thuật phage display (được dùng để tạo kháng thể đơn dòng dạng đơnchuỗi_scFv).

1.3.3.4 Kháng thể đơn chuỗi (scFv)

Cùng với sự phát triển của công nghệ sản xuất kháng thể, các mảnh khángthể được tạo ra bằng kỹ thuật sinh học đã đạt được những tiến bộ đáng kể Kháng

thể đơn chuỗi (scFv) là một trong những kháng thể phổ biến nhất.

Kháng thể đơn chuỗi bao gồm vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ (VL

và VH) của phân tử kháng thể hoàn chỉnh được nối với nhau bằng linkerpolypeptide linh động.

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH16

Hình 5: Cấu tạo của kháng thể và kháng thể đơn chuỗi

So với kháng thể đơn dòng thì kháng thể đơn chuỗi (scFv) có một số ưu điểmsau:

- Chúng dễ dàng được sản xuất với số lượng lớn và giá thành.

- Kích thướng nhỏ của chúng cho phép chúng dễ dàng xâm nhập vào mô và khốiu rắn, có tính hướng đích cao.

- Kháng thể đơn chuỗi dễ dàng được dung hợp với một protein khác như enzymhap protein phát huỳnh quang để tạo thành phân tử hoàn chỉnh dùng cho những

thử nghiệm miễn dịch.

1.4 Phương pháp Real-time PCR

1.4.1 Kỹ thuật PCR1.4.1.1 Định nghĩa

PCR là tên gọi tắt của phản ứng chuỗi polymedase (Polymedase Chain Reaction =PCR) để nhân các bản của đoạn DNA trong ống nghiệm.

nhân bản bằng Enzyme này bao gồm 3 bước lặp lại nhiều lần.

- Bước 1: Biến tính DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng cách nâng caonhiệt độ lên 94-95 oC trong khoảng thời gian ngắn.

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH17

- Bước 2: Tiếp hợp đoạn mồi (primer) thông qua hạ nhiệt độ xuống 40-60oC Haiđoạn mối là các oligonucletid dài khoảng 18-24 bazo sẽ tiếp hợp theo nguyên tắc

bổ sung với đoạn DNA tương đồng ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân.- Bước 3: Phản ứng polymedase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi Hai

phản ứng DNA mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu phân tửban đầu.

Để tránh hiện tượng tiếp hợp không đặc thù, phản ứng tổng hợp được thực hiện ở72 oC

Loại polymedase thường dùng trong PCR là loại chịu nhiệt (Taq DNApolymedase) được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus hoặc chủ yếu là

Real-time PCR là PCR tại thời điểm thực, nghĩa là quá trình khuếch đại DNAđang diển ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp Real-time PCR gồm

hai quá trình diễn ra đồng thời:- Quá trình khuếch đại DNA bằng PCR

- Đo độ phát quang tỷ lệ thuận với số lượng phân đoạn DNA tạo thành.Hệ thống Real-time PCR bao gồm máy chu trình nhiệt (PCR) được nối vớimáy phát hiện quang phổ huỳnh quang và máy vi tính Nguyên lý chủ yếu củaReal-time PCR là dựa trên cơ sở phát hiện và định lượng thể thông báo huỳnhquang (fluorescent reporter) Hàm lượng sản phẩm PCR bắt đầu tăng lên cao từ

chu kỳ ngưỡng (CT: threshold cycle) tương quan chặt chẽ với hàm lượng DNA

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH18

đích ban đầu Người ta thường sử dụng 3 dạng đầu dò để định lượng DNA bằngReal-time PCR:

- Các chất liên kết DNA như: SYBA Green…

- Các đầu dò thủy phân như: TaqMan, Beacons, Scorpions….-Các loại đầu dò lai như: Light Cycler…

Chu kỳ ngưỡng: là chu kỳ mà tại đó phần mềm máy tính bắt đầu đọc được

ΔRn, deltaRn là tham sử dụng trong định lượng Giá trị CRn, deltaRn là tham sử dụng trong định lượng Giá trị CT là 40 hay hơn 40 cónghĩa là không diễn ra sự khuếch đại và không thể tính toán được lượng sản

1.4.2.2 Cơ chế hoạt động của Real-time PCR

Số chu kỳ PCR và tín hiệu huỳnh quang từ phản ứng tỷ lệ với lượng sảnphẩm khuếch đại trong ống.

Sự khuếch đại thể hiện qua 2 giai đoạn: giai đoạn một theo hàm mũ và giai đoạnhai bão hoà không theo hàm mũ.

-Trong giai đoạn một, lượng sản phẩm PCR gần như được gấp đôi sau mỗichu kỳ Khi phản ứng tiếp diễn, các thành phần phản ứng được sử dụng.- Trong giai đoạn hai, một hay nhiều thành phần đã trở nên cạn kiệt, phản ứng

bắt đầu chậm lại và bước vào giai đoạn bão hoà.[6]

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH19

Hình 6: Đồ thị khuếch đại dựa trên hiệu số của tín hiệu nền huỳnh quang

1.4.2.3 Ưu điểm của Real-time PCR

Ưu điểm chính của Real-time PCR so với PCR truyền thống là cho phép xácđịnh số lượng bản sao khuôn mẫu ban đầu với sự chính xác và độ nhậy cao trong

một phạm vi biến thiên rộng Kết quả của Real-time PCR có thể là kết quả địnhtính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự DNA) hay định lượng (số lượng bản

sao DNA) Thêm vào đó, dữ liệu của Real-time PCR có thể được đánh giá màkhông cần phải điện di trên gel để kiểm tra, giúp tiết kiệm thời gian và gia tăng

số lượng thực hiện Việc tiến hành và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống ốngđóng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm và loại bỏ những thao tác sau phản

ứng khuếch đại.

Real-time PCR sử dụng để định lượng DNA được gọi là PCR định lượng.[6]

CHƯƠNG II:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Sinh phẩm

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH20

- Thư viện thực khuẩn thể Griffin.1 (Human Synthetic VH, vL scFvLibrary)_Trung tâm nghiên cứu protein (Cambridge, Anh).

- Hyperphage

- Vi khuẩn E.coli chủng TG1.

- Kháng thể: Kháng thể cộng hợp kháng M13 (anti-M13 horseradishperoxidase-conjugate, Amersham Biosciences, Pícâty, NJ, USA).

- Kháng nguyên: Kháng nguyên Cyfra 21-1 (Phòng Công nghệ Tế bào Độngvật - Viện Công Nghệ Sinh Học - Viện Khoa học Việt Nam).

- Mẫu máu do bệnh viện Bạch Mai và bệnh viện Phổi Trung Ương cung cấp.- Cặp mồi:

+ CyfprobF: 5'-GGC GGT AGT GCA CTT GAG A-3'+ CyfprobR: 5'-AAG GGT GAC AGG TGA GGA GA-3'

- Máy lắc ổn nhiệt; Bể ổn nhiệt; Tủ lạnh (4o -20o -80o).

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH21

- Máy đo pH; Máy voltex; Tủ cấy vô trùng; Pipetman các loại.- Các trang thiết bị khác thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm gene_Viện

Công nghệ Sinh học_Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong bình tam giác với thể tích từ 50ml chứa 5-15 ml môi trường thích hợp cho từng loại.

20-Bình nuôi cấy được đặt trong máy lặc ổn nhiệt ở 37oC hoặc 30oC với tốc độ220 vòng/phút.

2.2.2 Phương pháp tạo phage_DNA2.2.2.1 Chuẩn bị

- Box cấy vô trùng- Môi trường 2xTY- Kháng sinh: Ampicilin

- Glucose 20 %- Pipetman các loại

- Đèn cồn- Ống phancol

- Ủ trong nước 30 phút cở 37oC (không lắc);- Ly tâm các tế bào nhiễm ở 3300g trong 10 phút;

- Loại bỏ dịch, thu phần cặn tế bào;

- Lấy 30 ml môi trường 2xTY, bổ sung 25μg/ml Ampicilin và 1% glucose;g/ml Kanamycine và 100μg/ml Ampicilin và 1% glucose;g/mlAmpicilin;

- Hòa lại cặn tế bào thu được ở trên vào trong môi trường;- Nuôi lắc qua đêm ở 30oC;

- Ly tâm dịch nuôi cấy qua đêm ở 10800g trong 10 phút;- Thu dịch nổi chứa phage;

- Kết tủa các hạt phage bằng cách cho thêm 1/5 thể tích PEG/NaCl;- Để ở 4oC trong ít nhất 1 giờ;

- Sau đó, ly tâm 10800g trong 30 phút;- Loại bỏ dịch sau ly tâm, thu phần cặn;

- Hòa lại cặn trong 40ml H20;

- Bổ sung thêm 8ml PEG/NaCl, trộn đều và để 20 phút ở 4 oC;- Ly tâm 10800g trong 30 phút, loại bỏ phần dịch và thu phần cặn;