Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên mặt ngoài bằng kỹ thuật Gins potx

TCNCYH 27 (1) - 2004 Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên mặt ngoài bằng kỹ thuật GINs Nguyễn Kim Giao Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng GINS là kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử, kết hợp kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gián tiếp với kỹ thuật nhuộm âm để nghiên cứu kháng nguyên mặt ngoài của các mẫu hạt vi sinh vật nh vi rút, vi khuẩn, các mảnh vỡ tế bào.v.v. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này trên vắc xin viêm não Nhật Bản, vắc xin viêm gan B và vi khuẩn salmonella. Những kết quả chứng tỏ rằng các mẫu trên không những có cấu trúc hoàn chỉnh mà kháng nguyên mặt ngoài có tính đặc hiệu cao I. Đặt vấn đề Miễn dịch hiển vi điện tử (IEM) là sự kết hợp kỹ thuật miễn dịch với kỹ thuật hiển vi điện tử để định vị các thành phần miễn dịch đặc hiệu, các đại phân tử sinh vật. Khi mà hoá mô miễn dịch sử dụng hiển vi quang học để nghiên cứu phản ứng miễn dịch xẩy ra ở mức mô và tế bào thì hoá miễn dịch tế bào sử dụng EM để nghiên cứu phản ứng miễn dịch xẩy ra ở mức các đại phân tử và siêu cấu trúc tế bào. Nhờ kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử có thể xác định vị trí của các chất nh định vị các protein đặc hiệu trong hoặc trên mặt vi khuẩn, tế bào, bào quan; dò tìm các kháng nguyên mặt ngoài của vi rút; định vị các chuỗi DNA hoặc RNA đặc hiệu trong các tế bào.v.v. Hiện nay phơng pháp miễn dịch hiển vi điện tử bao gồm nhiều kỹ thuật, sử dụng những thiết bị và hoá chất chuyên dụng khác nhau đã đợc ứng dụng rộng rãi. Kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử đợc ứng dụng tại phòng thí nghiệm hiển vi điện tử của Viện Vệ sinh dịch tễ trung ơng (VSDTTU) là kết hợp kỹ thuật miễn dịch với kỹ thuật nhuộm âm và kỹ thuật lát cắt siêu mỏng sau đúc. Trong bài này chúng tôi trình bầy việc ứng dụng kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gắn vàng gián tiếp với kỹ thuật nhuộm âm bản và gọi tắt là kỹ thuật GINS. II. Vật liệu, thiết bị và phong pháp 1. Vật liệu và mẫu - Vật liệu: gồm lới niken với màng đỡ phủ các bon và các hoá chất là glutaraldehyde, đệm PBS, BSA, ammonium acetate, uranyl acetate, uranyl formate - Mẫu: Mẫu nghiên cứu thờng là mẫu bệnh phẩm dạng lỏng có chứa virut, vi khuẩn, các văc xin vi rút v.v. Sau khi xử lý theo những phơng pháp riêng (loại bỏ bất kỳ những dung dịch, hóa chất hoặc những phụ gia nào bao quanh mà có thể làm thay đổi hoặc ngăn cản thuốc nhuộm âm thâm nhập vào mẫu) mẫu cần phải có ít nhất về nồng độ là 5.0x10 7 hạt/ ml và thể tích là 50àl. Ba loại mẫu sau dùng trong nghiên cứu: - Mẫu vi rút vắc xin viêm não Nhật Bản loạt số L24/1999 và kháng thể dặc hiệu, - Mẫu kháng nguyên bề mặt vi rút vắc 17 TCNCYH 27 (1) - 2004 xin viên gan B loạt số L44/2000 và kháng thể đặc hiệu. Cả hai loại mẫu trên và các kháng thể đặc hiệu tơng ứng nhận từ Công ty văc xin và sinh vật phẩm số 1. - Mẫu vi khuẩn salmonella và kháng thể đặc hiệu H (nhận từ Khoa vi khuẩn, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ơng). 2. Thiết bị - Kính hiển vi điện tử truyền qua: JEM 1010 (JEOL, Japan) với điện áp gia tốc chùm điện tử 30-100KV, độ phóng đại 50-600.000x, độ phân giải 3A 0. Các ảnh đợc chụp trên phim FUJI-FG, in trên giấy ảnh Sterlin và lu trên đĩa cứng của hệ Digital camera-Computer đi kèm với JEM1010. 3. Phơng pháp 3.1. Kỹ thuật đánh dấu kháng nguyên gián tiếp: Nguyên tắc của kỹ thuật là trớc tiên kháng nguyên kết hợp với kháng thể đặc hiệu trong một thời gian nhất định. Sau khi rửa để loại các kháng thể đặc hiệu thừa không kết hợp, cho kháng kháng thể phát hiện và liên kết với phức hợp kháng nguyên - kháng thể kể trên. Do Protein A có thể liên kết với phần Fc của một số Immunoglobulin (đặc biệt là IgG) của vài loài lại có thể cộng hợp với các chất đánh dấu siêu cấu trúc-các đích điện tử là các hạt vàng có đờng kính từ 5 tới 10nm, nên thay vì sử dụng kháng kháng thể (kháng thể thứ hai) là dùng ProteinA có gắn vàng. Dới kính hiển vi điên tử có thể thấy đợc các hạt vàng, tức là thấy đợc vi trí kháng nguyên trong mẫu. Hình 1 minh hoạ kỹ thuật đánh dấu gián tiếp kháng nguyên. KN I g G đặc hiệu KN - I g G đặc hiệu ProteinA-Au KN - I g G đặc hiệu - Protein A-Au Hình 1. Kỹ thuật đánh dấu kháng nguyên gián tiếp 3.2. Kỹ thuật nhuộm âm: Đây là kỹ thuật làm mẫu hiển vi điện tử đơn giản nhanh và có độ phân giải cao. Mẫu dạng dịch treo của những hạt nh vi rút, vi khuẩn đợc đa lên lới và sau đó trải đều một lớp thuốc nhuộm bao quanh những hạt mẫu. Thuốc nhuộm cản chùm tia điện tử còn hạt mẫu cho chùm tia điện tử đi qua và hoạ lên cấu trúc của hạt mẫu nghiên cứu trên màn quan sát. 3.3. Kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gắn vàng với nhuộm âm - Kỹ thuật GINS Kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gắn vàng và nhuộm âm (kỹ thuật GINS) xuất phát từ kỹ thuật đơn giọt (Hayat và Miller 1990) và đợc tiến hành nh sau: 1. Các giọt 20àl mẫu vi rút đặt trên bề mặt một miếng parafilm sạch. 2. Lới có màng collodium phủ các bon ngậm nớc còn ớt (làm bằng cách ngâm 18 TCNCYH 27 (1) - 2004 trong dung dịch bacitracin 0,01%) đợc đặt lên giọt mẫu để thu lấy các vi rút trong 5- 10 phút. 3. Rửa lới bằng cách đặt liên tiếp trên 2-3 giọt PBS. 4. Đặt nổi lới trên giọt PBS-BSA 2% để phóng bế các vị trị kháng nguyên không đặc hiệu, trong 20 phút . 5. Đặt nổi lới trên giọt kháng thể đặc hiệu thứ nhất pha loãng trong PBS-BSA 0,5%, trong 20 phút. 6. Rửa lới thận trọng bằng PBS - BSA 0,2%. 7. ủ lới trong protein-A gắn vàng (5 hoặc 10nm) trong 20 phút. 8. Rửa lới bằng cách đặt liên tiếp trên 2-3 giọt PBS. 9. Cố định nhanh trong glutaraldehyde 0,1% trong 1 phút. 10. Rửa kỹ lới với ammonium acetate 0,1% 11. Nhuộm âm với uranyl acetate hoặc uranyl formate 1%, pH 5,4. 12. Các lới đợc làm khô dần trớc khi quan sát. Trong quá trình tiến hành, các lới không đợc để khô và thận trọng giữ cho l- ới nổi trên mặt giọt. Hình 2 là qui trình làm mẫu kể trên. 19 Hình 2: Đánh dấu miễn dịch gắn vàng và nhuộm âm tiêu bản. III. Kết quả 1. Vi rút vắc xin viêm no Nhật Bản và kháng nguyên bề mặt HBsAg. Hình 3 và hình 4 là các ảnh của vi rút vắc xin viêm não Nhật Bản và HBsAg. Chúng tôi nhận thấy quanh những hạt vi rút của cả hai loại đều đợc bám bởi Vi rút Lới BSA 2 % PBS 5-10 phút Phón g b ế 20 phút Lới Khán g thể kháng virút 20 phút Parafilm Rửa 3 lần 5 phút BSA 0.2% Lới A A- Au Protein 20 phút Parafilm Glu 0,1% PBS A mmonium acetate 0,1% PBS 1 % UA H 2O Quan sát trên kính HVĐTTQ Rửa 3 lần 5 phút Rửa 3 lần 5 phút Rửa 3 lần 5 phút Cố đ ị nh Nhu ộ m 5 phút Parafilm Parafilm TCNCYH 27 (1) - 2004 những hạt vàng (hạt đen tròn với đờng kính dAu=5nm dùng cho VXVNNB () và dAu=10nm dùng cho HBsAg (). Những kết quả thu đợc trên ảnh xác nhận rằng cả hai loại mẫu không những có cấu trúc hoàn chỉnh mà còn mang đặc tính kháng nguyên cao. 2. Mẫu vi khuẩn samonella Hình 5 là ảnh của vi khuẩn salmonella. Thân vi khuẩn dầy nên nhận đợc ảnh tối không rõ siêu cấu trúc. Trên những lông của vi khuẩn () bám đầy những hạt vàng xác nhận rằng trên lông vi khuẩn mang kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể H. Hình 3. ảnh vi rút vắc xin viêm não Nhật Bản đánh dấu MDHVĐT theo kỹ thuật GINS Hình 4. ảnh của HBsAg đánh dấu MDHVĐT theo kỹ thuật GINS 20 TCNCYH 27 (1) - 2004 Hình 5. ảnh của vi khuẩn salmonella đánh dấu MDHVĐT theo kỹ thuật GINS IV. Bàn luận Kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gắn vàng nhuộm âm đợc sử dụng để phát hiện ra sự có mặt hoặc sự vắng mặt của những protein, những kháng nguyên và những đại phân tử khác ở trên bề mặt những mẫu sinh vật trong dịch treo. Những hạt virút, những mảnh tế bào, vi khuẩn, những mẫu lipoprotein và những mẫu sinh vật nhỏ khác đều có thể đánh dấu miễn dịch khi sử dụng kỹ thuật này. Về mặt kỹ thuật các kháng nguyên mặt ngoài của vi sinh vật hay kháng nguyên nằm mặt ngoài tế bào là các kháng nguyên có thể quan sát dễ dàng nhất, vì các kháng thể và các phần tử đánh dấu có thể đi đến một cách tự do. Trong nghiên cứu ứng dụng này chúng tôi sử dụng chất đánh dấu là keo vàng gắn trớc với Protein A nên tính ổn định của nó rất cao đồng thời lại có thể lựa chọn Protein A gắn hạt vàng có các đờng kính khác nhau (5- 10nm) cho phù hợp với từng mẫu nghiên cứu Kỹ thuật miễn dịch gắn vàng thực hiện trên mẫu sinh vật trớc khi cố định hóa học nên có nhiều lợi thế hơn những kỹ thuật đánh dấu miễn dịch chuẩn khác. Kỹ thuật cho thấy đợc siêu cấu trúc của mẫu bao gồm những chi tiết trên mặt, các thành phần bên trong, cung cấp những thông tin trực tiếp và đầy đủ về mặt hình thái và nguyên tắc cấu tạo của các vi rút và xác định đợc vị trí các kháng nguyên protein hoặc đại phân tử nhờ những hạt vàng định vị. Thực tế cho thấy những lợng nhỏ các immunoglobulin không bị phát hiện bằng các phơng pháp phân tích sinh hoá hoặc miễn dịch, nhng một lợng rất nhỏ IgG của ngời cũng có thể nhận ra đợc trong các mẫu HBsAg bằng phơng pháp GINS. Điều đó chứng tỏ rằng phơng pháp này là thích hợp để kiểm tra chất lợng các mẫu văc xin trong quá trình tinh chế. Những điều lập luận trên cũng hoàn toàn có giá trị với vi khuẩn kích thớc nhỏ cỡ hơn àm mà ở đây là tiêm mao của 21 TCNCYH 27 (1) - 2004 Salmonella. Kỹ thuật GINS cho phép quan sát trực tiếp vi khuẩn không những hình thái cấu trúc mà còn xác định đợc chính xác vị trí kháng nguyên trên vi khuẩn góp phần định loại. III. Kết luận Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật GINS trên vắc xin viêm não Nhật Bản, vắc xin viêm gan B và vi khuẩn salmonella. Những kết quả chứng tỏ rằng các mẫu trên không những có cấu trúc hoàn chỉnh mà kháng nguyên mặt ngoài có tính đặc hiệu cao. Tài liệu tham khảo 1. Dawes, C. J. 1971. Biological Techniques in Electron Microscopy. Barnes and Noble Inc., New York. 233 pp. 2. Doane, F. W., and N. Anderson. 1987. Electron Microscopy and Diagnostic Virology. Cambridge University Press, Cambridge. 194 pp. 3. Hayat, M. A. 1989. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications. CRC Press, Boca Raton, FL 469 pp. 4. Hayat, M. A., and S. E. Miller. 1990. Negative Staining. McGraw Hill, New York. 345 pp. 5. Miller SE. Diagnostic virology by electron microscopy. ASM News 1988; 54:475. Summary Immunoelectronmicroscopic localization of surface Antigens by GINS technique GINS is immunoelectronmicroscopic technique combinated indirect immunolabelling technique and negative stainning technique in order to investigate surface antigens of particle specimens, such as virus, bacteria, debris of cell. This applicant investigation carry out on virus of JEV, HBsAg and salmonella. The results proved that samples not only have complete structure but also surface antigens with high specifity. 22 . Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên mặt ngoài bằng kỹ thuật GINs Nguyễn Kim Giao Vi n Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng GINS là kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử, kết hợp kỹ. Miễn dịch hiển vi điện tử (IEM) là sự kết hợp kỹ thuật miễn dịch với kỹ thuật hiển vi điện tử để định vị các thành phần miễn dịch đặc hiệu, các đại phân tử sinh vật. Khi mà hoá mô miễn dịch. Nhờ kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử có thể xác định vị trí của các chất nh định vị các protein đặc hiệu trong hoặc trên mặt vi khuẩn, tế bào, bào quan; dò tìm các kháng nguyên mặt ngoài