Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên trong tế bào pptx

TCNCYH 26 (6) - 2003 Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên trong tế bào Nguyễn Kim Giao Viện Vệ sinh dịch tễ trung ơng Sự kết hợp các kỹ thuật miễn dịch với kỹ thuật hiển vi điện tử đã đợc sử dụng từ lâu trong sinh học tế bào (TB). Hiện nay phơng pháp miễn dịch hiển vi điện tử (MDHVĐT) đợc áp dụng rộng rãi đặc biệt là nghiên cứu chẩn đoán vi sinh vật. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật đánh dấu miễn dịch bằng vàng gián tiếp sau khi đúc với tế bào Vero nuôi cấy nhiễm vi rút sởi và tế bào TVP nuôi cấy nhiễm vi rút rota SA11. Theo dõi các hạt đen trên ảnh, chúng tôi đã định vị đợc các vi rút rota trong tế bào TVP và nhận biết đợc quá trình hình thành của vi rút sởi trong TB Vero. I. Đặt vấn đề Miễn dịch hiển vi điện tử là phơng pháp kết hợp kỹ thuật miễn dịch với kỹ thuật hiển vi điện tử để định vị các thành phần miễn dịch đặc hiệu, các đại phân tử sinh vật. Phơng pháp định vị hiển vi điện tử các thành phần miễn dịch trong tế bào có thể tiến hành theo nhiều phơng pháp khác nhau. Trớc tiên tế bào cần cắt mỏng tại nhiệt độ thấp (không đúc) hoặc tại nhiệt độ phòng (có đúc). Việc đánh dấu miễn dịch có thể thực hiện trực tiếp hoặc gián tiếp trớc khi đúc, sau khi đúc hoặc trên lát cắt lạnh [1, 3]. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài nhằm: 1. Lựa chọn và xác định đợc những điều kiện, những thông số tốt nhất làm tiêu bản miễn dịch hiển vi điện tử phát hiện kháng nguyên mặt ngoài tế bào phù hợp với điều kiện Việt Nam. 2. Nghiên cứu xác định sự tồn tại của vi rút rota trên tế bào TVP và sự nhân lên của vi rút sởi trên tế bào Vero trong quá trình nuôi cấy II. Vật liệu, mẫu, thiết bị và qui trình kỹ thuật nghiên cứu 1. Nguyên lý chung chất đúc WF lát cắt tế bào tiêu bản chất cố định (4,5% PFA 0,1% GA) lới cắt lát mỏng cố định đúc Khử nớc tím lới lới Quan sát HVĐTTQ p arafilm rửa đánh dấu miễn d ị ch Nhu ộ m dơn g bản 6 TCNCYH 26 (6) - 2003 Hình 1: Qui trình làm tiêu bản định vị kháng nguyên trong tế bào sau đúc mẫu Những tế bào hoặc mô đợc cố định và đúc trong những khuôn đúc bằng những chất đặc biệt để giữ cấu trúc và bảo toàn chức năng miễn dịch. Những mẫu đúc đợc cắt thành những lát cực mỏng và đặt lên trên các lới nicken. Tiếp đó những lát cắt đ- ợc bộc lộ tới cả kháng thể thứ nhất, kháng thể thứ hai rồi đợc rửa và nhuộm trớc khi kiểm tra ở kính hiển vi điện tử truyền qua tại độ phóng đại cao. Kỹ thuật cắt cực mỏng không những cho phép định vị những kháng nguyên ở phía trong mẫu mà còn tiếp cận đợc tới những protein, những kháng nguyên và những đại phân tử khác trên bề mặt của lát cắt vì chúng sẽ bị bộc lộ trong quá trình cắt. Hình 1 là sơ đồ chung làm tiêu bản để định vị kháng nguyên trong tế bào sau đúc mẫu . Hình 2 là sơ đồ đánh dấu miễn dịch hiển vi điện tử trên lát cắt mỏng. Điều cần chú ý ở đây là kháng kháng thể hoặc kháng thể thứ hai đợc thay bằng ProteinA-Au. Hình 2: Sơ đồ định vị kháng nguyên trên lát cắt bằng đánh dấu miễn dịch gắn vàng gián tiếp 2. Vật liệu - Hoá chất: paraformaldehyde, glutaraldehyde, OsO4, đệm PBS, BSA, ethanol, uranyl acetate, lead citrate . - Lới nicken, giấy ảnh đen trắng Sterlin. phim FUJI-FG 3. Mẫu nghiên cứu - Tế bào nuôi cấy TVP nhiễm vi rút Rota dòng SA11 và kháng thể đặc hiệu (nhận từ POLYOVAC) - Tế bào vero nuôi cấy nhiễm vi rút sởi chủng vác xin Moraten và kháng thể đặc hiệu (nhận từ Khoa vi rút Viện VSDTTW) 4. Thiết bị nghiên cứu 4.1. Máy cắt tiêu bản siêu mỏng: Ultramicrotome III (LKB, Thuỵ Điển). 4.2. Kính hiển vi điện tử truyền qua: JEM 1010 (JEOL, Japan) với các thông số: + Điện áp gia tốc điện tử 30-100KV, + Độ phóng đại x 50-600.000, + Độ phân giải 3A 0 Các ảnh chụp trên phim FUJI-FG, in trên giấy ảnh Sterlin hoặc lu trên đĩa cứng của hệ Digital camera-Computer kèm với JEM1010. 5. Qui trình kỹ thuật Qui trình kỹ thuật gồm hai bớc nh 7 TCNCYH 26 (6) - 2003 sau. 5.1. Cố định, đúc và cắt mẫu a. Cố định: 3% paraformaldehyde+0,2% glutaraldehyde trong đệm phosphate pH 7,2-74 tại 4 0 C. trong 40 phút đến 1 giờ b. Rửa: 0,1M đệm phosphate 2 lần 10 phút c. Rửa: trong dung dịch NH 4 Cl 0,05M hoặc 0,1M đệm phosphate (pH 7,2-74). d. Khử nớc: + 30% ethanol (10 phút) + 50% ethanol (10 phút) + 70% ethanol (2 lần, 20 phút,) + 90% ethanol (2 lần, 20 phút,) + 100% ethanol (2 lần, 30phút) e. Tẩm: + 2/3 ethanol+1/3 LRWhite, 30 phút + 1/2 ethanol+1/2 LRWhite, 30 phút + 1/3 ethanol+2/3 LRWhite, 30 phút f. Ngâm: + LR White, 1 giờ + LR White, 18 giờ + LR White qua đêm + LRWhite, 1-3 giờ g. Đúc: trong khuôn đúc nh capsule gelatin h. Làm cứng: để tủ ấm 40-45 0 C, từ 1-3 ngày. i. Cắt tiêu bản trên máy cắt siêu mỏng với độ dầy 400-500A 0 k. Đặt mảnh cắt trên lới nicken có màng formvar phủ các bon 5.2. Thực hiện đánh dấu miễn dịch và nhuộm dơng bản a. Rửa lới nickel với lát cắt bằng 2-3 giọt PBS pH-7.2 b. Đặt nổi lới trên giọt 1% hydrogen peroxide (v/v) trong 5 phút. Quá trình ăn mòn này làm bộc lộ nhiều hơn các kháng nguyên của lát cắt. Rửa kỹ lới trong nớc cất. c. Đặt nổi lới trên giọt 2% PBS-BSA trong 20 phút để phóng bế các vị trí kháng nguyên không đặc hiệu. d. Lới đợc đặt nổi trên giọt kháng thể đặc hiệu thứ nhất pha loãng trong 0,5% PBS-BSA và ủ trong 20 phút. e. Rửa thận trọng bằng 0,2% PBS - BSA, f. Các lới lại đợc ủ tiếp trong proteinA gắn hạt vàng (d=5-10nm) trong 20 phút. h. Rửa trong PBS một số lần i. Cố định nhanh bằng hơi OsO4. k. Rửa kỹ với ammonium acetate 0,1% l. Nhuộm dơng 2 lần theo phơng pháp Reynold (uranyl acetate 5%, lead citrtate 1%). Các lới đợc làm khô từ từ trớc khi quan sát. Chú ý: Trong suốt quá trình tiến hành, các lới không đợc để khô và thận trọng giữ cho nó nổi trên mặt giọt. Iii. Kết quả 8 TCNCYH 26 (6) - 2003 100 nm Hình 3. Một phần của tế bào TVP với vi rút rota đợc nhân lên 0,5 à Hình 4. Quá trình hình thành của vi rút sởi trong tế bào Vero 1. Tế bào nuôi cấy TVP nhiễm vi rút rota dòng SA11 Trong một nghiên cứu về sự nhân lên của các chủng vi rút rota trên các dòng tế bào nuôi cấy, chúng tôi nhận đợc mẫu tế bào nuôi cấy TVP nhiễm vi rút rota dòng SA11. Thực hiện việc định vị kháng nguyên vi rút rota theo qui trình trên và nhận đợc hình 3. Những hạt vàng tròn đen đậm có tại những cấu trúc trên ảnh (x) xác nhận rằng những cấu trúc đó là 9 TCNCYH 26 (6) - 2003 những vi rút rota đợc nhân lên trong tế bào nuôi cấy TVP. 2. Xác định quá trình hình thành của vi rút sởi trong tế bào Vero Hình 4 là lát cắt mỏng của tế bào Vero đã bị huỷ hoại do nhiễm và nhân lên của vi rút rota. Bằng kỹ thuật đánh dấu miễn dịch hiển vi điện tử trên lát cắt mỏng, ta có thể theo dõi đợc vi rút trong quá trình hình thành. Các hạt chấm đen là hạt vàng chỉ các kháng nguyên vi rút sởi nằm rải rác trong bào tơng. Tại một số vùng bào tơng sát màng tế bào hình thành nucleocapcid và chuẩn bị đâm chồi (). Các hạt vi rút sởi tách rời khỏi màng và tập trung ở bên ngoài tế bào (x). IV. Bàn luận Nh đã trình bầy trong phần mở đầu, miễn dịch hiển vi điện tử là kết hợp đồng thời hai phơng pháp nghiên cứu, phơng pháp hiển vi điện tử và phơng pháp miễn dịch. Đứng về mặt sinh học và sinh hoá học, có ba yêu cầu cần thực hiện để định vị chính xác bất cứ đại phân tử miễn dịch nào trong mô, tế bào hoặc ngay trên các vi rút. Đó là có đợc các kháng thể đặc hiệu và các chất đánh dấu, các kháng nguyên có mặt trong mẫu với một số lợng đáng kể và siêu cấu trúc vi sinh vật, tế bào đợc giữ tốt [2, 3]. Về mặt bảo toàn siêu cấu trúc: mẫu sinh vật sẽ giữ đợc siêu cấu trúc với điều kiện là lấy mẫu và cố định mẫu tức thời và xử lý tiếp mẫu theo phơng pháp thờng qui. Có một số chất cố định đợc sử dụng. Tuy nhiên những chất cố định này (nh OsO4) có thể làm giảm tính kháng nguyên của các phân tử quan tâm nên trong nghiên cứu MDHVĐT ngời ta thờng hạn chế sử dụng. Nhng điều bất lợi là không chỉ các tế bào không cố định tốt mà ảnh điện tử sẽ không có độ tơng phản cao vì OsO4 là chất tán xạ điện tử mạnh [4]. Về các kháng nguyên có mặt trong mẫu: các kháng nguyên có thể còn rất ít sau cố địmh với glutaraldehyde, do đó các mô hoặc tế bào thờng cố định bằng formaldehyde (paraformaldehyde) hoặc bằng hỗn hợp của formaldehyde với glutaraldehyde (tỷ lệ formaldehyde là từ 2- 8 % và glutaraldehyde là 0.1-0.5%). Một điều quan trọng là các kháng nguyên nội bào cần dễ dàng tiếp cận đợc với các kháng thể bằng cách tăng tính thẩm thấu qua các màng hoặc bằng cách cắt mẫu thành các lát cắt siêu mỏng. Các tế bào có thể đợc làm tăng tính thấm bằng các dung môi hữu cơ nh aceton, chlorofom, chất tẩy nh saponin hoặc Twen80. Vế kỹ thuật đánh dấu: Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng cách đánh dấu miễn dịch gián tiếp để khắc phục những khó khăn kỹ thuật (kháng thể thứ nhất rất khó thu đợc nhiều, sự cộng hợp của kháng thể thứ nhất với đích điện tử lại rất khó, hiệu suất kém và có thể làm ảnh hởng xấu tới sự kết hợp của kháng thể thứ nhất với kháng nguyên). Việc dễ dàng có đợc kháng thể thứ hai mà ở đây chúng tôi sử dụng ProteinA-Au (đã gắn đích điện tử Au với đờng kính lựa chọn và có bán trên thị trờng) đảm bảo cho nghiên cứu ít bị rủi ro [3] Xuất phát từ yêu cầu bảo toàn siêu cấu trúc sinh vật và giữ đợc tính kháng nguyên của mẫu đồng thời lại có thể thực hiện trong phòng thí nghiệm HVĐT của Viện Vệ sinh dịch tễ trung ơng, chúng tôi đã chọn cách cố định mẫu bằng dung dịch cố định 3-4% paraformaldehyde +0,2% glutaraldehyde trong dung dịch đệm PBS, thời gian 30-40 phút tại 4 0 C, đúc mẫu bằng LR White tại 37-40 0 C và đánh dấu miễn 10 TCNCYH 26 (6) - 2003 dịch gián tiếp trên lát cắt mỏng với kháng thể thứ hai thay bằng proteinA-Au là thích hợp. Những hình ảnh HVĐTTQ của các mẫu chụp đợc xác thực việc lựa chọn của chúng tôi là đúng đắn. V. Kết luận - Thông qua nghiên cứu áp dụng, chúng tôi đã chọn đợc cách cố định mẫu bằng dung dịch cố định 3-4% paraformaldehyde +0,2% glutaraldehyde trong dung dịch đệm PBS, thời gian 30-40 phút tại 4 0 C, đúc mẫu bằng LR White tại 37-40 0 C và đánh dấu miễn dịch gián tiếp trên lát cắt mỏng với kháng thể thứ hai đợc thay bằng proteinA-Au. - Bằng kỹ thuật định vị miễn dịch hiển vi điện tử kháng nguyên trong tế bào, đã xác định đợc chắc chắn vi rút rota có trong tế bào nuôi cấy TVP thông qua sự chỉ điểm của các hạt vàng. - Thấy rõ quá trình nhân lên của vi rút sởi trên tế bào Ve ro, từ giai đoạn tổng hợp các thành phần acide nucleic và protein của vi rút trong tế bào đến giai đoạn những virion hoàn chỉnh nh mọc chồi để tách khỏi tế bào ở đó vỏ ngoài của vi rút sởi đợc tạo ra bởi màng tế bào. Tài liệu tham khảo 1. Bozzola, J. J., and L. D. Russell. (1992). Electron Microscopy. Jones and Bartlett, Boston, MA. 132 pp. 2. Dawes, C. J. (1971). Biological Techniques in Electron Microscopy. Barnes and Noble Inc., New York. 240 pp. 3. Hayat, M. A. (1989). Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications. CRC Press, Boca Raton, FL 469 pp. 4. Miller SE. Detection and identification of viruses by electron microscopy. J Electron Microsc Tech, 1986; 4:265-301. 5. Payne CM. Electron microscopy in the diagnosis of infectious diseases. In: Connor DH, Chandler FW, Payne CM. Electron microscopy in the diagnosis of infectious diseases. In: Connor DH, Chandler FW. Summary Immunoelectronmicroscopic localization of Antigen in cells The Combination between Immunological techniques and Electron microscopy had been used in cellular biology for a long time. At present, Immunoelectronmicroscopic methods (IEM) are applied more, specially in the microbial diagnosis. In this study, We had used indirect immunogoldlabelling technique after embedding on Vero cells infected by measles viruses and TVP cells infected by rotavirus SA11. According to black particles in Immuno-electron microscopic figures, We localized rotaviruses in the TVP cells and realized the formaton of measles virus in the Vero cells. 11 . Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên trong tế bào Nguyễn Kim Giao Vi n Vệ sinh dịch tễ trung ơng Sự kết hợp các kỹ thuật miễn dịch. để định vị các thành phần miễn dịch đặc hiệu, các đại phân tử sinh vật. Phơng pháp định vị hiển vi điện tử các thành phần miễn dịch trong tế bào có