KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4.1.Đường chuẩn nồng độ
Để tiến hành phân tích định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 trong các mẫu phân tích, cần xây dựng đường chuẩn nồng độ.
Probe No115 của hãng Roche được sử dụng để thực hiện Real-time PCR. Cụ thể, chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn mã hóa scFv của
kháng thể đặc hiệu Cyfra 21-1 và probe No115. (Trình tự mồi và Probe No155 được thiết kế dựa trên phần mềm thiết kế Primer của Probe).
Trình tự của probe No 115: gacccaga và trình tự mồi là:
CyfprobF:5'-ggcggtagtgcacttgaga-3'
CyfprobR:5'-aagggtgacaggtgaggaga-3’
Đoạn mồi trên được sử dụng để khuếch đại DNA mã hóa cho scFv đặc hiệu kháng nguyên Cyfra 21-1được gắn trong vector pHEN2. Mẫu đối chứng âm tính
khơng chứa DNA khuôn trong thành phần phản ứng.
Theo lý thuyết, chu kỳ ngưỡng của một phản ứng được xác định chủ yếu bởi lượng khuôn mẫu hiện diện lúc phản ứng khuếch đại bắt đầu. Chính vì vậy,
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH34
Hình 14: Sơ đồ mồi, Probe và đoạn DNA được khuếch đại trong phản ứng định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1
nếu lượng ban đầu của mẫu lớn thì chỉ sau một vài chu kỳ, sản phẩm khuếch đại đã được tích lũy đủ để phát ra tín hiệu huỳnh quang cao hơn tín hiệu nền ban đầu. Như vậy, phản ứng xảy ra sớm hay có chu kỳ ngưỡng thấp. Ngược lại, nếu lượng mẫu ban đầu thấp, thì phải cần nhiều chu kỳ hơn để có thể phát ra được tín
hiệu huỳnh quang cao hơn tín hiệu nền. Do đó, phản ứng sẽ trễ hay có chu kỳ ngưỡng cao. Kết quả cho thấy sự tương quan giữa tín hiệu huỳnh quang nhận
được trong Real-time PCR với lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 đã sử dụng. Kết quả cho thấy, nồng độ kháng nguyên ở mẫu số 1 ( 2.106) cao nhất nên có tín hiệu huỳnh quang sớm nhất với Cp= 19,36. Các nồng độ tiếp theo giảm
dần và mẫu có tín hiệu huỳnh quang muộn nhất là mấu số 4 (2.103) với Cp= 31,46; mấu đối chứng khơng có tín hiệu huỳnh quang. Điều này chỉ ra rằng, số
lượng khn DNA càng lớn thì lượng sản phẩm gắn với chất phát quang càng nhiều, tín hiệu huỳnh quang đạt ngưỡng càng sớm.
Đường cong đặc trưng cho sự khuếch đại DNA với các nồng độ kháng nguyên Cyfra 21-1 được pha loãng theo dãy pha lỗng 10 lần được thể hiện trên hình 15.
Dãy pha loãng này tạo ra những đường đồ thị khuếch đại với khoảng cách khá đều nhau. Qua kết quả chu kỳ ngưỡng Cp với các nồng độ khác nhau đã biết trước, chúng tôi đã dựng được đường hồi quy tuyến tính của tín hiệu nhận được
đối với logarit nồng độ kháng nguyên Cyfra 21-1 ban đầu. Với những kết quả thu được, chúng tơi có thể khảng định được primer, probe đã được thiết kế tốt và
điều kiện tối ưu hóa cho phản ứng là phù hợp.
Mối liên hệ giữa nồng độ Cyfra 21-1 được cố định ở các giếng thử và giá trị Cp trong thí nghiệm xây dựng đường chuẩn được thể hiện ở bảng 3.
Mẫu Cp Nồng độ DNA theo Real-time PCR Nồng độ kháng nguyên (ng/ ml) Kết quả OD trong ELISA Tỉ lệ tương quan giữa nồng độ DNA và KN 10-4 19,36 9,56.109 2.106 0,815 0,21.10-3 10-5 23,31 1,09.109 2.105 0,766 0,18.10-3 10-6 27,71 9,61.107 2.104 0,731 0,21.10-3 10-7 31,46 1,00.107 2.103 0,628 0,20.10-3 H2O _ _ _ _ _
Bảng 3: Mối tương quan giữa nồng độ Cyfra 21-1 với giá trị Cp và kết quả ELISA
Bảng phân tích trên cho thấy sự tương quan chặt chẽ giữa lượng DNA xác định theo Real-time PCR với nồng độ kháng nguyên được cố định ở các giếng của khay thử. Từ bảng trên ta có thể thấy, nồng độ kháng nguyên tỷ lệ thuận với
DNA. Điều này phù hợp với nhận định đưa ra ban đầu. Theo tính tốn thì nồng độ tương quan trung bình giữa nồng độ kháng nguyên/nồng độ DNA là 0,20.10-3
với độ lệch chuẩn 1,41.10-5.
Ở đây, chúng tôi sử dụng mẫu đối chứng là H2O vì: H2O là nước khử tinh khiết nên trong thành phần của nó khơng có DNA. Chính vì vậy, khi đem đi đo
ELISA sẽ khơng cho giá trị OD và khơng có sự bắt cặp giưa kháng ngun và DNA đích. Và trong q trình chạy Real-time PCR cũng sẽ khơng cho tín hiệu
huỳnh quang.