Phát Mycobacterium Tuberculosis kháng Isoniazid, Rifampin Ethambutol kỹ thuật Real-time PCR Khổng Thị Minh Ngân Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS Chuyên ngành: Vi sinh vật học; Mã số 60 42 40 Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thái Sơn Năm bảo vệ: 2014 Abstract Xây dựng quy trình real-time PCR phát nhanh mẫu lao đột biến kháng Isoniazid (đột biến gen katG codon 315 AGC-ACC (Ser315Thr)), Rifampin (đột biến gen rpoB codon 516 GAC-GTC (Asp516Val)) Ethambutol (đột biến gen emb codon 306 với loại: ATG-GTG (Met306Val) ATG-ATA(Met306Ile) ) Ứng dụng quy trình mẫu bệnh phẩm thực tế Keywords Vi sinh vật học; Kỹ thuật Real- time PCR; Vi khuẩn lao; Lao kháng thuốc Content MỞ ĐẦU Bệnh lao vi khuẩn gây bệnh lao biết rõ từ kỷ Những liệu pháp chữa trị kháng sinh tỏ hiệu từ năm 1960 Tuy nhiên, thập niên 90 đến nay, xuất nhiều chủng vi khuẩn lao kháng thuốc, khó chữa trị có nguy lây lan nhanh, đe dọa hàng triệu người giới Y học giới năm gần ghi nhận chủng vi khuẩn gây bệnh lao kháng đa thuốc gọi lao siêu kháng thuốc Những người mắc bệnh lao với chủng vi khuẩn cần phải điều trị năm so với từ 6-8 tháng trước chi phí điều trị tăng lên gấp 100 lần WHO ước tính, đến có 27 ngàn ca bệnh lao kháng thuốc 41 quốc gia [47] Việc điều trị cho bệnh nhân lao kháng đa thuốc nghiêm ngặt, cần phải theo dõi liên tục năm Một số bệnh nhân sau thời gian uống thuốc, thấy khỏe khơng có triệu chứng gì, cho khỏi bệnh nên tự ý bỏ trị lao Bệnh nhân vi trùng lao “sống dai” nguy hiểm Sau thời gian “nằm ẩn mình” tìm cách chống lại thuốc lao, chúng hoạt động gây bệnh trở lại Lúc này, người bệnh trở nên bị lao kháng thuốc, bệnh nguy hiểm lúc phát bệnh lao ban đầu Ngồi ra, có bệnh nhân bị khó chịu tác dụng phụ thuốc lao q trình điều trị, khơng đến tái khám để bác sỹ điều chỉnh thuốc, mà tự bỏ trị nửa chừng Cũng có bệnh nhân uống thuốc lao không đặn, hay uống không đủ liều thuốc… Tất trường hợp tạo điều kiện thuận lợi cho vi trùng lao trở nên kháng thuốc Nếu điều trị không đầy đủ, vi khuẩn kháng thuốc mạnh khả hồi phục trở nên mong manh Và nguy hiểm cho cộng đồng, lao kháng đa thuốc khỏe từ bệnh nhân lây lan cộng đồng bị phát tán khơng khí, mơi trường sinh hoạt [26,28] Việt Nam đứng thứ 12 22 nước có số bệnh nhân lao cao toàn cầu [2] Năm 2007, Việt Nam ước tính có 150 ca nhiễm lao mới/nghìn dân tỷ lệ mắc bệnh 192 ca/nghìn dân Tỷ lệ lao đa kháng thuốc tổng số ca nhiễm lao 2.7%, tổng số ca qua điều trị 19% Theo số liệu bệnh nhân lao đăng ký điều trị lao TP HCM năm 2008, với tỷ lệ kháng đa thuốc (kháng với Rifampin Isoniazid) vào khoảng 3.8% số bệnh nhân 22% bệnh nhân lao tái điều trị [1,2] Ở nghiên cứu tập trung nghiên cứu phát vi khuẩn lao kháng loại thuốcchủ yếu điều trị lao Rifampin, Isoniazid, Ethambutol Để phát lao đa kháng thuốc có phương pháp : làm xét nghiệm nuôi cấy vi trùng lao từ mẫu bệnh phẩm đờm, dịch thể… làm kháng sinh đồ lao Q trình ni cấy vi trùng thử kháng sinh đồ khoảng đến tháng có kết Hiện nay, Việt Nam có xét nghiệm giúp phát kháng thuốc sớm nhanh Hain test (thời gian thực xét nghiệm khoảng ngày) Xpert MTB/RIF (thời gian thực xét nghiệm khoảng giờ) Tuy nhiên, hai xét nghiệm có giá thành đắt, khơng dùng phổ biến cho bệnh nhân bị lao[5] Hiện tiến lĩnh vực công nghệ sinh học mang tới nhiều lợi ích ứng dụng y học Một số kỹ thuật real-time PCR, sử dụng kỹ thuật real-time PCR kỹ thuật hồn tồn mở, nhanh, nhạy, xác, khơng lệ thuộc vào hãng sản xuất kít nước ngồi, giá thành rẻ hơn,… nên chọn real-time PCR để phát đột biến kháng isoniazid, Rifampin ethambutol vi khuẩn lao mẫu bệnh phẩm Chính lý nhóm nghiên cứu định thực đề tài: “ Phát Mycobacterium tuberculosis kháng Isoniazid, Rifampin Ethambutol kỹ thuật realtime PCR” Đề tài nhằm mục tiêu sau : Xây dựng quy trình real-time PCR phát nhanh mẫu lao đột biến kháng Isoniazid (đột biến gen katG codon 315 AGC-ACC (Ser315Thr)), Rifampin (đột biến gen rpoB codon 516 GAC-GTC (Asp516Val)) Ethambutol (đột biến gen emb codon 306 với loại: ATG-GTG (Met306Val) ATG-ATA(Met306Ile) ) Ứng dụng quy trình mẫu bệnh phẩm thực tế Reference TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bệnh Viện Phạm Ngọc Thạch – CTCL Tp.HCM Báo cáo Hoạt động chống lao 2008 – Phương hướng hoạt động 2009 Tháng 01/2009 Chương Trình Chống Lao Quốc Gia, Báo cáo tổng kết Chương trình Chống lao Quốc gia năm 2010 phương hướng hoạt động năm 2011 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2008), Sinh học phân tử (khái niệm, phương pháp, ứng dụng), Nhà xuất giáo dục, tr 196-197 Lê Huy Chính (2001), Họ Mycobacteriaceae, Vi sinh Y học, Nhà xuất Y học, Hà Nội, Tr 207-14 Nguyễn Văn Hưng (1997), "Những kỹ thuật chẩn đoán vi khuẩn học bệnh lao", Nội san lao bệnh phổi, 26 tr 80 – 84 Võ Thị Thương Lan (2008), Sinh học phân tử, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội Cao Minh Nga, Phan Quốc Việt, Hồ Thị Thanh Thủy (2008), “Tài liệu tập huấn: Ứng dụng sinh học phân tử chẩn đoán bệnh nhiễm người”, Công ty cổ phần Công nghệ Việt Á Khuất Hữu Thanh (2005), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 10 Quyền Đình Thi, Nơng Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích DNA – tập 2, Nhà xuất Khoa học Tự nhiên Công nghệ Hà Nội Tiếng Anh 11 Abdelaal A., El-Ghaffar H.A., Zaghloul M.H.E., et al (2009), "Genotypic detection of Rifampin and isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis strains by DNA sequencing: a randomized trial", Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, (4): doi:10.1186/1476-0711-8-4 12 Alcaide F, Pfyffer GE, Telenti A “Role of embB in natural and acquired resistance to ethambutol in mycobacteria” Antimicrob Agents Chemother 1997;41:2270–3 13 Banaiee N., Bobadilla-del-Valle M., Riska P.F., et al (2003), "Rapid identification and susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis from MGIT cultures with luciferase reporter mycobacteriophages", J Med Microbiol, 52: 557-6 14 Banerjee A Dubnau E., Quemard A., et al (1994), "inhA, a gene encoding a target for isoniazid and ethionamide in Mycobacterium tuberculosis." Science, 263 227–230 15 Canetti G., Froman S., Grosset J., et al (1963), "Mycobacteria: laboratory methods for testing drug sensitivity and resistance", Bull World Health Organ, 29: 565-78 16 Caviedes L., Lee T.S., Gilman R.H., et al (2000), "Rapid, efficient detection and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in sputum by microscopic observation of broth culture", J Clin Microbiol, 38: 1203 17 Cengiz Cavusoglu et al (2002) Characterization of rpoB mutation in rifampinresistant clinical isolates of mycobacterium tuberculosis form Turkey by DNA sequencing and line mẫu dò assay Journal of Clinical Microbiology P 4435-4438 18 D Garcíade Viedma (2003) Rapid detection of resistance in Mycobacterium tuberculosis: a review discussing molecular approaches Clin Microbiol Infect 9: 349359 19 El Hajj H.H., Marras S.A., Tyagi S., et al (2001), "Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacons", J Clin Microbiol, 39: 4131–4137 20 Espasa M., Gonzalez-Martin J., Alcaide F., et al (2005), "Direct detection in clinical samples of multiple gene mutations causing resistance of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and Rifampin using fluorogenic mẫu dòs", J Antimicrob Chemother, 55: 860-5 21 Hirano et al (1999) Mutations in the rpoB gene of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolate mostly in Asian contries and their rapid detection by line mẫu dò assay J Clin Microbiol 37:2663-2666 22 Hausdorfer J., Sompek E., Allerberger F., et al (1998), "E-test for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis", Int J Tuberc Lung Dis, 2: 751 23 Hillemann D., Rusch-Gerdes S and Richter E (2006), "Application of the Genotype MTBDR assay directly on sputum specimens", Int J Tuberc Lung Dis, 10: 1057-9 24 Igor Mokrousov, Tatiana Otten, Maxim Filipenko, Anna Vyazovaya, Eugeny Chrapov, Elena Limeschenko, Lidia Steklova, Boris Vyshnevskiy, and Olga Narvskaya July 2002 Detection of Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis Strains by a Multiplex Allele-Specific PCR Assay Targeting katG Codon 315 Variation Journal of Clinical Microbiology 25 Igor Mokrousov et al (2003) Allele-specific rpoB PCR assays for detection of Rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis in Sputum Smears Antimicrobial Agents and Chemotherapy, p.2331-2235 26 Iseman M D Madsen L A (1989), "Drug-resistant tuberculosis", Clin Chest Med, 10 341–353 27 James B Whitney and Mark A Wainberg 2002 Isoniazid, The Frontline of Resistance in Mycobacterium tuberculosis MJM 6: 114-123 28 Johnson R., Streicher E.M., Louw G.E., et al (2006), "Drug Resistance in Mycobacterium tuberculosis", Curr Issues Mol Biol., 8: 97-111 29 Kent P.T and Kubica G.P (1985), "Public Health Mycobacteriology A guide for the Level III Laboratory", Atlanta, GA: CDC, 30 Kim S.Y., Park Y.J., Song E., et al (2006), "Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug- Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis", Diagn Microbiol Infect Dis, 54: 203-10 31 Le T.K., Bach K.H., Ho M.L., et al (2000), "Molecular fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Vietnam using IS6110 as mẫu dò", Tuber Lung Dis, 80 (2): 75-83 32 Lety MA, Nair S, Berche P, Escuyer V A single point mutation in the embB gene is responsible for resistance to ethambutol in Mycobacterium smegmatis Antimicrob Agents Chemother 1997;41:2629–33 33 Luo T, Jiang L, Sun W, Fu G, Mei J, Gao Q (2011), “Multiplex Real-time PCR Melting Curve Assay To Detect Drug-Resistant Mutation of Mycobacterium tuberculosis”, J Clin Microbiol 49 (9) 3123-8 34 Mariaj.Torres, Antoniocriado,Josec.Palomares, And Javieraznar Sept.2000 Use of Real-Time PCR and Fluorimetry for Rapid Detection of Rifampin and Isoniazid Resistance-Associated Mutations in Mycobacterium tuberculosis Journal of Clinical Microbiology, P.3194-3199 35 Martin A., Portaels F and Palomino J.C (2007), "Colorimetric redox-indicator methods for the rapid detection of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review and meta-analysis." J Antimicrob Chemother, 59: 175-83 36 Martilla H.J Soini H., Eerola E., Vyshevskaya E., Vyshnevskyi B.I., and Otten T.F (1998), "A Ser315Thr substitution in katG is predominant in genetically heterogeneous multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis isolates originating from the St Petersburg area in Russia", Antimicrob Agents Chemother, 42 2443–5 37 Morcillo N., Zumarraga M., Alito A., et al (2002), "A low cost, home-made, reverse-line blot hybridisation assay for rapid detection of Rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis", Int J Tuberc Lung Dis, 6: 959-65 38 Musa H.R., Ambroggi M., Souto A., et al (2005), "Drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis by a nitrate reductase assay applied directly on microscopy-positive sputum samples", J Clin Microbiol, 43: 3159-61 39 Niemann S., Rusch-Gerdes S,, Richter E, (1997), "IS6110 fingerprinting of drugresistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Germany during 1995", J Clin Microbiol, 35 3015–20 40 Ramaswamy SV, Amin AG, Goksel S, Stager CE, Dou SJ, El Sahly H, et al Molecular genetic analysis of nucleotide polymorphisms associated with ethambutol resistance in human isolates of Mycobacterium tuberculosis Antimicrob Agents Chemother 2000;44:326–36 41 Palomino J C., Sylvia Cardoso Leão, Viviana Ritacco (2007), Tuberculosis 2007: From basic science to patient care, WWW.TuberculosisTextbook.com 42 Palomino J.C., Traore H., Fissette K., et al (1999), "Evaluation of Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis", Int J Tuberc Lung Dis, 3: 344-8 43 Smith I (2003), "Mycobacterium tuberculosis pathogenesis and molecular determinants of virulence", Clin Microbiol Rev, 16 463–496 44 Sreevatsan S, Stockbauer KE, Pan X, Kreiswirth BN, Moghazeh SL, Jacobs Jr WR, et al Ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis: critical role of embB mutations Antimicrob Agents Chemother 1997;41:1677–81 45 Telenti A, Philipp WJ, Sreevatsan S, Bernasconi C, Stockbauer KE, Wieles B, et al The emb operon, a unique gene cluster of Mycobacterium tuberculosis involved in resistance to ethambutol Nat Med 1997;3:567–70 46 Van Doorn Hr D.H.P., Kremer K, Vandenbroucke-Grauls Cm, Borgdorff Mw, Van Soolingen D (2006), "Public health impact of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a mutation at amino-acid position 315 of katG: a decade of experience in The Netherlands", Clin Microbiol Infect, 12 769-75 47 World Health Organization (2010), Multidrug and extensively drug-resistant TB (M/XDR-TB): 2010 global report on surveillance and response, WHO/HTM/TB/2010.3 48 World Health Organization (2011), Automated Real-time Nucleic Acid Amplification Technology for Rapid and Simultaneous Detection of Tuberculosis and Rifampin Resistance: Xpert MTB/RIF System Policy Statement, WHO/HTM/TB/2011.4 49 World Health Organization (2011), Global Tuberculosis Control, WHO report 2012 50 www.nihe.org.vn 51 www.wikipedia.org ... tài: “ Phát Mycobacterium tuberculosis kháng Isoniazid, Rifampin Ethambutol kỹ thuật realtime PCR Đề tài nhằm mục tiêu sau : Xây dựng quy trình real-time PCR phát nhanh mẫu lao đột biến kháng. .. biến cho bệnh nhân bị lao[5] Hiện tiến lĩnh vực công nghệ sinh học mang tới nhiều lợi ích ứng dụng y học Một số kỹ thuật real-time PCR, sử dụng kỹ thuật real-time PCR kỹ thuật hồn tồn mở, nhanh,... nhanh, nhạy, xác, khơng lệ thuộc vào hãng sản xuất kít nước ngồi, giá thành rẻ hơn,… nên chúng tơi chọn real-time PCR để phát đột biến kháng isoniazid, Rifampin ethambutol vi khuẩn lao mẫu bệnh