Phát hiện các đột biến trên gen beta globin bằng kỹ thuật ARMS PCR và lai điểm ngược (REVERSE DOT BLOT)

Bên cạnh đó, với ưu điểm cho phép phát hiện đồng thời nhiều đột biến, kỹ thuật lai điểm ngược hiện nay đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như các hãng phát triển t

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Thị Thu Hà

PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN BETA GLOBIN BẰNG KỸ

THUẬT ARMS-PCR VÀ LAI ĐIỂM NGƯỢC (REVERSE DOT BLOT)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Thị Thu Hà

PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN BETA GLOBIN BẰNG KỸ

THUẬT ARMS-PCR VÀ LAI ĐIỂM NGƯỢC (REVERSE DOT BLOT)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu

sắc nhất tới PGS.TS Võ Thị Thương Lan Cô là người trực tiếp hướng dẫn,

chỉ dạy và giúp đỡ em tận tình trong suốt quá trình học tập và làm việc Cô

không chỉ truyền đạt cho em kiến thức mà còn dạy cho em cách giải quyết

vấn đề, cách bố trí thí nghiệm hiệu quả, tác phong làm việc khoa học Cô còn

quan tâm, giúp đỡ em giải quyết những khó khăn trong cuộc sống

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS Tạ Bích Thuận Cô đã luôn động

viên, quan tâm, chỉ dẫn em tận tình trong suốt quá trình thực hiện đề tài Cô

luôn khích lệ em rất nhiều những lúc em gặp khó khăn, giúp em có thêm động

lực để có thể hoàn thành luận văn này

Em xin cảm ơn các thầy cô giáo khoa Sinh học, trường Đại học Khoa

học Tự nhiên đã dạy dỗ, truyền đạt cho em các kiến thức khoa học, tạo điều

kiện thuận lợi cho em thực hiện tốt đề tài này

Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Phạm Anh Thùy Dương, ThS Ngô

Thị Hà, các bạn và các em thuộc Phòng thuộc phòng thí nghiệm Sinh Y,

Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà

Nội đã giúp đỡ nhiệt tình và chia sẻ khó khăn trong suốt quá trình em thực

hiện đề tài

Cuối cùng, em xin gửi lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè thân thiết đã

động viên, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời

gian học tập và thực hiện luận văn này

Hà Nội, tháng 4 năm 2017

Lê Thị Thu Hà

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1- TổNG QUAN 2

1.1 BỆNH Β-THALASSEMIA 2

1.1.1 Tình hình mắc bệnh trên thế giới và tại Việt Nam 2

1.1.2 Vị trí, cấu trúc gen β-globin mã hóa chuỗi β-globin 3

1.1.3 Các đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia 4

1.1.4 Đặc điểm kiểu hình của bệnh β-thalassemia 7

1.1.5 Các phương pháp chẩn đoán bệnh 10

1.2 KỸ THUẬT ARMS-PCR (AMPLIFICATION REFRACTORY MUTATION SYSTEM - PCR) 13

1.2.1 Nguyên tắc của kỹ thuật ARMS-PCR 13

1.2.2 Thiết kế mồi cho phản ứng ARMS-PCR 14

1.2.3 Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật ARMS-PCR 16

1.2.4 Kỹ thuật ARMS-PCR trong chẩn đoán bệnh β-thalassemia 16

1.3 KỸ THUẬT LAI ĐIỂM NGƯỢC (REVERSE DOT BLOT) 17

1.3.1 Nguyên tắc chung của kỹ thuật lai axit nucleic 17

1.3.2 Đầu dò trong kỹ thuật lai điểm ngược 18

1.3.3 Màng sử dụng trong kỹ thuật lai điểm ngược 20

1.3.4 Kỹ thuật lai điểm ngược trong chẩn đoán bệnh β-thalassemia 21

Chương 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 23

2.1.1 Nguyên liệu 23

2.1.2 Hóa chất 23

2.1.3 Trình tự các đầu dò oligo sử dụng trong nghiên cứu 25

2.1.4 Trình tự các mồi 26

2.1.5 Thiết bị 27

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm 28

2.2.2 Tách ADN tổng số 29

2.2.3 Phương pháp PCR 29

2.2.4 Phương pháp ARMS-PCR 31

2.2.5 Phương pháp điện di 33

2.2.6 Quá trình lai điểm ngược 34

2.2.7 Phương pháp tách dòng 35

Chương 3- KẾT QUẢ 38

1 KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN β-GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI 39

2 SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN β-GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT ARMS-PCR 42

2.1 Sàng lọc đột biến Cd 17 trên mẫu thalassemia bằng ARMS-PCR 42

2.2 Sàng lọc đột biến Cd 26 trên mẫu thalassemia bằng ARMS-PCR 43

2.3 Sàng lọc đột biến Cd 41/42 trên mẫu thalassemia bằng ARMS-PCR 44 3 SO SÁNH KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN CÁC MẪU BỆNH PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI VỚI KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN SINH HÓA 47

3.1 Đặc điểm Hb các đột biến trong nghiên cứu 48

3.2 Giá trị HbE ở các mẫu có đột biến Cd 26 52

3.3 So sánh kết quả chẩn đoán sinh hóa với kết quả phân tích PCR đa mồi 53

4 KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN Ở NHÓM NGƯỜI BÌNH THƯỜNG 55

5 BIẾN NẠP, TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN β-GLOBIN 58

5.1 Biến nạp, tách dòng 58

5.2 Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 17 61

5.3 Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 26 62

5.4 Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 41/42 64

5.5 Giải trình tự đoạn gen β-globin không có đột biến 66

6 LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT) 67

6.1 Đánh dấu trình tự đích cho quá trình lai điểm ngƣợc 67

6.2 Tối ƣu điều kiện lai điểm ngƣợc 68

6.3 Kết quả lai một số mẫu bệnh phẩm 73

KẾT LUẬN 76

KIẾN NGHỊ 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT

3‟UTR 3‟ Untranslated Region (Vùng 3‟ không dịch mã)

5‟UTR 5‟ Untranslated Region (Vùng 5‟ không dịch mã)

ADN Acid deoxyribonucleic

ARMS-PCR Amplification Refractory Mutation System-PCR

ARN Acid ribonucleic

BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate- BCIP

DCIP Dichlorophenol Indophenol

dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphates

dTTP Deoxythymidine triphosphate

dUTP Deoxyuridine triphosphate

EDC 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide

hydrochloride

Hb Hemoglobin huyết sắc tố

HbA Adult hemoglobin

HbA2 Adult hemoglobin 2

SA-AP Streptavidine alkaline phosphatase

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SSC Saline Sodium Citrate

TBE Đệm Tris - Borate - EDTA

TBE Tris-Borate-EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid)

WHO World Health Organisation (Tổ chức Y tế Thế giới)

δ Delta

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang Hình 1.1 Cụm gen β-globin (A) và cấu trúc gen β-globin (B) 3 Hình 1.2 Các đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia 6 Hình 1.3 Biểu đồ sàng lọc người bệnh β-thalassemia 11 Hình 1.4 Sơ đồ kỹ thuật ARMS-PCR phát hiện đột biến điểm 13 Hình 1.5 Cấu trúc của oligonucleotide amino-linkers và spacer

arm

17

Hình 1.6 Cơ chế phát hiện màu của quá trình lai điểm ngược 18 Hình 2.1 Sơ đồ minh họa vị trí các mồi sử dụng trong nghiên cứu 24 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm phát hiện các đột biến trên gen β- 26

globin

Hình 3.1 Kết quả điện di minh họa ADN tổng số tách từ mẫu máu 35 Hình 3.2 Kết quả điện di minh họa sản phẩm PCR đa mồi 37 Hình 3.3 Kết quả sàng lọc đột biến Cd 17 bằng kỹ thuật ARMS-

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen

β-globin bằng cặp mồi 95 NF/Control R

Hình 3.10 Kết quả so sánh trình tự đoạn gen β-globin của mẫu T57

với ngân hàng dữ liệu NCBI

54

Hình 3.11 Kết quả so sánh trình tự đoạn gen β-globin của mẫu

T365 với ngân hàng dữ liệu NCBI

56

Hình 3.12 Kết quả so sánh đột biến tại Cd 42 (TTT→CTT) với cơ

sở dữ liệu HbVar

57

Hình 3.13 Kết quả so sánh trình tự đoạn gen β-globin của mẫu T57

với ngân hàng dữ liệu NCBI

58

Hình 3.14 Kết quả so sánh trình tự đoạn gen β-globin của mẫu T99

với ngân hàng dữ liệu NCBI

59

Hình 3.15 Minh họa kết quả đánh dấu đoạn gen β-globin với biotin 60 Hình 3.16 Kết quả tối ƣu điều kiện lai điểm ngƣợc 62 Hình 3.17 Chuẩn hóa nồng độ đầu dò CD26 chấm lên màng 63

Hình 3.18 Kết quả lai điểm ngược trên mẫu ADN người không có 3

đột biến khảo sát với các đầu dò CD 17, CD 26, CD 41/42

64

Hình 3.19 Kết quả lai điểm ngược trên ba mẫu bệnh phẩm phát hiện

ba đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 trên gen β-globin

65

Hình 3.20 Kết quả lai điểm ngược trên một số mẫu bệnh phẩm phát

hiện ba đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 trên gen

β-globin

66

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Đặc điểm kiểu hình của bệnh β-thalassemia 7 Bảng 1.2 Đặc điểm các mồi bình thường và mồi đột biến của phản

Bảng 2.5 Thành phần và điều kiện phản ứng không đánh dấu và

đánh dấu trình tự đích cho kỹ thuật lai điểm ngược

28

Bảng 2.6 Thành phần và điều kiện phản ứng ARMS-PCR đã tối ưu

để sàng lọc kiểu gen đột biến Cd 17

29

Bảng 2.7 Thành phần và điều kiện phản ứng ARMS-PCR đã tối ưu

để sàng lọc kiểu gen đột biến Cd 26

29

Bảng 2.8 Thành phần và điều kiện phản ứng ARMS-PCR đã tối ưu

để sàng lọc kiểu gen đột biến Cd 41/42

30

Bảng 2.9 Thành phần gel polyacrylamide 8% 30 Bảng 2.10 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn

Bảng 3.2 Kết quả sàng lọc đột biến tại Cd 17, Cd 26, Cd 41/42, Cd

95 trên mẫu thalassemia và người bình thường bằng kỹ thuật PCR đa mồi

36

Bảng 3.3 Tỉ lệ các đột biến trên 288 mẫu bệnh phẩm 41 Bảng 3.4 Tỉ lệ các đột biến kép trên 288 mẫu bệnh phẩm 41 Bảng 3.5 Tỉ lệ các loại đột biến β-thalassemia ở người Việt Nam 42 Bảng 3.6 Trung bình thành phần Hb các trường hợp đột biến trong

Bảng 3.10 Tỉ lệ mang gen bệnh β-thalassemia ở một số nghiên cứu

tại Việt Nam

50

Bảng 3.11 Nồng độ các đầu dò chấm lên màng 64

MỞ ĐẦU

Beta thalassemia (β-thalassemia) là bệnh di truyền lặn do đột biến gen

beta globin (β-globin) nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 11 quy định, gây

giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi β-globin Tại Việt Nam, đây là nguyên nhân hàng đầu gây thiếu máu, tan máu nặng ở trẻ em Bệnh gây ra những hậu quả nặng nề về thể chất và tinh thần cho người bệnh Phương pháp điều trị kinh điển là truyền máu định kỳ và thải sắt thường xuyên Ghép tế bào gốc máu là phương pháp điều trị mới nhưng rất tốn kém và hiệu quả chưa cao Vì vậy, chương trình tầm soát bệnh thalassemia trong cộng đồng gồm xét nghiệm trước hôn nhân và chẩn đoán trước sinh được coi là biện pháp hiệu quả làm giảm nguy cơ các ca bệnh nặng

ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System-PCR) là kỹ thuật đang được sử dụng phổ biến để phát hiện các đột biến β-thalassemia Bên cạnh đó, với ưu điểm cho phép phát hiện đồng thời nhiều đột biến, kỹ thuật lai điểm ngược hiện nay đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như các hãng phát triển thành các kit thương mại để phát hiện đột biến β-thalassemia Tuy nhiên tại Việt Nam, ứng dụng của kỹ thuật này vẫn còn rất hạn chế Với mong muốn áp dụng kỹ thuật lai điểm ngược để

phân tích đồng thời một số đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia

ở người Việt Nam, từ đó tự chủ thêm kỹ thuật xét nghiệm hiệu quả, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Phát hiện các đột biến trên gen beta globin

bằng kỹ thuật ARMS-PCR và lai điểm ngược (reverse dot blot)” Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học; Phòng Sinh học Phân

tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

Chương 1- TổNG QUAN

1.1 BỆNH Β-THALASSEMIA

1.1.1 Tình hình mắc bệnh trên thế giới và tại Việt Nam

Beta thalassemia (β-thalassemia) là nhóm các bệnh thiếu máu di truyền,

xảy ra do đột biến gen beta globin (globin) quy định việc tổng hợp chuỗi

β-globin của hemoβ-globin – thành phần chính trong hồng cầu, đảm nhiệm việc vận chuyển oxy trong cơ thể Theo tổ chức Y tế thế giới WHO, hiện nay, ước tính khoảng 1,5% dân số thế giới mang gen bệnh β-thalassemia Hằng năm, khoảng 50000 đến 100000 trẻ bị chết vì mắc bệnh β-thalassemia thể nặng ở những quốc gia có thu nhập thấp và trung bình [73] Bệnh phổ biến ở các khu vực Địa Trung Hải, Đông Nam Á, Ấn Độ, Bắc Phi, Trung Đông và Trung Á [69] Ngày nay, do quá trình di cư và hôn nhân giữa các dân tộc khác nhau, bệnh trở nên phổ biến ở nhiều quốc gia châu Âu, châu Mỹ, châu Úc Khu vực Đông Nam Á chiếm khoảng 50% số người mắc bệnh trên thế giới, xấp xỉ 40 triệu người và khoảng một nửa số đó bị ảnh hưởng sau sinh Tần suất mang gen bệnh ở khu vực này từ 0,5% đến 10% [69] Các nước phát triển châu Âu

và châu Mỹ chỉ chiếm khoảng 10% đến 30% số người mắc bệnh trên thế giới [69] Trung Đông và Tây Á, tần số mắc bệnh từ 2% đến 5% ở hầu hết các nước Tại Bắc Phi, tần số mắc bệnh từ 2 đến 9%, trong khi Mỹ có tần số mắc bệnh thấp, chủ yếu ở dân nhập cư [14]

Việt Nam là một trong những nước có tỉ lệ mắc bệnh cao trên bản đồ thalassemia thế giới Ước tính hiện nay có khoảng 20000 người bị thalassemia thể nặng, mỗi năm có thêm khoảng 2000 trẻ em sinh ra bị bệnh, có khoảng 10 triệu người mang gen bệnh thalassemia [76] Đặc biệt, tỷ lệ gặp cao ở một số dân tộc ít người khi vấn đề hôn nhân cận huyết vẫn còn tồn tại như: Stiêng (63,9%), Êđê (32,2%), Khơme (28,2%), Mường (21,74%) [76]

β-1.1.2 Vị trí, cấu trúc gen β-globin mã hóa chuỗi β-globin

Gen β-globin nằm trong cụm gen dài 70 kb thuộc cánh ngắn nhiễm sắc thể 11 (11p15.4) Cụm gen bao gồm các gen chức năng: ε - G γ - A γ - ѱβ - δ - β

được sắp xếp theo thứ tự biểu hiện trong quá trình phát triển của cơ thể Cách

gen ε khoảng 6-20 kb về phía đầu 5‟ là vùng điều khiển nhóm gen (Locus

Control Region) chứa các vị trí HS từ HS1 đến HS5 rất nhạy với DNAse 1 (DNase 1 hypersensitive) (Hình 1.1A) Các vị trí này có motif gắn yếu tố hoạt

hóa phiên mã giúp điều khiển mở các vùng domain của nhóm gen β-globin và

tăng cường biểu hiện gen [9]

Gen β-globin dài 1600 bp, bao gồm 3 exon, 2 intron, vùng 5‟ và 3‟

không dịch mã, mã hóa cho 146 axit amin Exon đầu tiên dài 89 bp, exon 2 dài 221 bp và exon 3 dài 123 bp Intron 1 có kích thước nhỏ, dài 130 bp, trong khi intron 2 có kích thước lớn hơn, dài 850 bp (Hình 1.1B) [18]

Các trình tự bảo thủ có vai trò quan trọng đối với sự biểu hiện của gen

β-globin được tìm thấy ở các vùng promoter, chỗ nối intron-exon, vùng 5‟ và

3‟ không dịch mã Một số đột biến tại các trình tự này là nguyên nhân dẫn tới β-thalassemia [70]

Hình 1.1 Cụm gen β-globin (A) và cấu trúc gen β-globin (B) [61]

Promoter gen β-globin chứa các trình tự bảo thủ TATA box (từ vị trí –

28 đến –31), CCAAT box (từ vị trí –72 đến –76) và vùng lặp lại CACCC (từ

vị trí –86 đến –90 và vị trí –101 đến –105) có vai trò điều hòa hoạt động gen [18]

Vùng 5‟ không dịch mã (5‟-UTR) dài 50 bp, nằm giữa vị trí CAP và codon mở đầu ATG Có hai trình tự bảo thủ là CTTCTG nằm trước vị trí CAP 8-13 nucleotide và trình tự CACCATG [18]

Vùng 3‟ không dịch mã (3‟-UTR) nằm giữa codon cuối cùng TAA và đuôi poly A, dài 132 bp, chứa trình tự bảo thủ AATAAA Trình tự bảo thủ này là tín hiệu gắn đuôi poly A vào sợi mARN [18]

1.1.3 Các đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia

Có khoảng 200 đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia đã

được tìm thấy, chủ yếu là các đột biến điểm, rất ít đột biến mất đoạn [70] Các đột biến này có thể xảy ra tại các trình tự exon hoặc intron, promoter, vùng 3‟

và 5‟ không dịch mã (Hình 1.2)

Tùy theo đột biến làm giảm hay mất khả năng tổng hợp chuỗi β-globin

mà có thể dẫn tới mức độ nặng của bệnh β-thalassemia Trường hợp hoàn

toàn không còn sự tổng hợp chuỗi β-globin dẫn tới kiểu hình βo-thalassemia Trường hợp giảm tổng hợp một phần chuỗi β-globin dẫn tới kiểu hình β+-thalassemia Trong khi đó, giảm tổng hợp chuỗi β-globin rất nhẹ dẫn tới kiểu hình β++-thalassemia [11]

Đột biến điểm ảnh hưởng tới sự biểu hiện của β-globin được chia thành

ba nhóm chính:

 Đột biến ảnh hưởng đến quá trình phiên mã

 Đột biến vùng promoter: Các đột biến trên vùng promoter xảy ra tại các trình tự bảo thủ là vị trí bám của các nhân tố phiên mã có vai trò trong việc điều hòa biểu hiện gen, làm giảm hiệu suất quá trình phiên

mã từ 20-30% so với bình thường [70] Ví dụ, đột biến tại các vị trí -28 (A→G) và -29 (A→G) phổ biến ở người Trung Quốc và da đen, đột biến tại các vị trí -87 (C→G) và -101 (C→T) phổ biến ở khu vực Địa Trung Hải [70]

 Đột biến vùng 5’ không dịch mã: Bao gồm các đột biến đơn và mất đoạn nhỏ Đột biến ở vùng 5‟ không dịch mã làm giảm hiệu suất dịch

mã Ví dụ, đột biến tại vị trí +33 (C→G) làm giảm hiệu suất dịch mã khoảng 33% so với bình thường [70]

 Đột biến ảnh hướng đến quá trình cải biến mARN

 Đột biến trình tự bảo thủ: Quá trình cắt nối intron và exon xảy ra sau phiên mã cần các nucleotide GT (vị trí cho nối) ở đầu 5‟, AG (vị trí nhận nối) ở đầu 3‟ của các intron và vùng trình tự bảo thủ xung quanh [70] Vùng trình tự bảo thủ bao gồm 3 nucleotide cuối của exon và 6 nucleotide đầu tiên của intron ở vị trí cho nối đầu 5‟, 10 nucleotide cuối của intron và nucleotide đầu tiên của exon ở vị trí 3‟ nhận nối Đột biến tại các nucleotide GT và AG dẫn tới kiểu hình βo-thalassemia, trong khi

đó, các đột biến trong vùng trình tự bảo thủ dẫn tới giảm hiệu quả của

quá trình ghép nối, tạo kiểu hình β-thalassemia từ nhẹ tới nặng Ví dụ, đột biến IVS1.6 (T→C) dẫn tới kiểu hình β++-thalassemia trong khi đột biến IVS1.5 (G→C, G→T, hoặc G→A) làm giảm tổng hợp chuỗi β-globin, dẫn tới kiểu hình β+-thalassemia [58]

 Đột biến tạo vị trí ghép nối giả tại vùng intron và exon: Dọc các exon và intron đều chứa các trình tự giống với trình tự bảo thủ ở vùng biên intron-exon nhưng thường không được sử dụng cho quá trình cắt nối Các đột biến xảy ra tại các vị trí trên tạo ra các trình tự gần giống với trình tự cắt nối bình thường Có 2 đột biến tại intron 1 và 3 đột biến tại intron 2 tạo vị trí ghép nối giả [70] Trong một số trường hợp, các vị trí này được ưu tiên sử dụng cho quá trình cắt nối (90% tại đột biến thay thế IVS1.110 (G→A) và 100% tại đột biến IVS1.116 (T→G) tạo kiểu hình βo-thalassemia hoặc β+-thalassemia [39,54] Tại exon 1, có 6 đột biến thay thế dẫn tới hoạt hóa vị trí ghép nối giả bao gồm: đột biến tại Cd 10 (C→A), Cd 19 (A→G) tạo biến thể Hb Malay, Cd 24 (T→A), Cd 26 (G→A) tạo biến thể HbE, Cd 26 (A→C) tạo biến thể

Hb Tripoli hoặc Cd 27 ( G→T) tạo biến thể Hb Knossos [16,43,44,74]

 Đột biến tại vị trí poly A và vùng 3’ không dịch mã: Có 4 đột biến thay thế nucleotide và hai đột biến mất đoạn nhỏ ảnh hưởng tới trình tự bảo thủ AATAAA đã được công bố [70] Các đột biến này thường dẫn tới kiểu hình nhẹ β+-thalassemia Đột biến tại vùng 3‟ không dịch mã (C→G vị trí +1480) gây β+-thalassaemia [70]

 Đột biến ảnh hưởng đến quá trình dịch mã mARN

 Đột biến codon mở đầu: Có 9 đột biến liên quan tới codon ATG là tín hiệu bắt đầu dịch mã dẫn tới kiểu hình βo-thalassemia [70]

 Đột biến vô nghĩa: Một số đột biến thay thế dẫn tới kết thúc sớm chuỗi β-globin Nguyên nhân là do đột biến trực tiếp tạo codon kết thúc hoặc thêm hay mất một vài nucleotide dẫn tới thay đổi khung đọc mở, tạo

codon kết thúc sớm Ví dụ, đột biến tại Cd 17 (A→T) của exon 1, làm thay đổi axit amin lysine chuyển thành thymine, được phiên mã thành

bộ ba kết thúc UAG ở mRNA là đột biến phổ biến ở Thái Lan và Việt Nam [12,57]

 Đột biến khung: Thêm hoặc mất một hoặc vài nucleotide làm thay đổi khung đọc mở tạo kiểu hình β+-thalassemia Điển hình như đột biến mất nucleotide A tại Cd 6 phổ biến ở khu vực Địa Trung Hải, đột biến gây lệch khung đọc do mất 4 nucleotide TCTT tại Cd 41 và 42 phổ biến

ở Trung Quốc, Ấn Độ và Việt Nam [15,57]

Hình 1.2 Các đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia [45]

Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của Svasti cho thấy có 8 đột biến thường gặp, chiếm khoảng 95% các trường hợp β-thalassemia bao gồm: Cd

17 (A→T), Cd 41/42 (-TCTT), -28 (A→G), Cd 71/72 (+A), IVS1.1 (G→T), IVS1.5 (G→C), IVS2.654 (C→T) và Cd 26 (G→A) tạo biến thể HbE [57]

1.1.4 Đặc điểm kiểu hình của bệnh β-thalassemia

Dựa vào biểu hiện lâm sàng, bệnh β-thalassemia được chia thành ba thể chính: thể nặng, thể trung gian, thể nhẹ (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Đặc điểm kiểu hình của bệnh β-thalassemia [30]

Kiểu hình Kiểu gen đột biến Chỉ số hồng cầu Đặc điểm Hb

HbA2 tăng HbF: 70-90%

Hb: 6-10 g/dL MCV: 55-70 fL MCH: 15-23 pg

HbA2 tăng HbF tăng đến 100%

Hb nữ: 9-13 g/dL

MCV: 55-75 fL

MCH: 19-25 pg

HbA2 >3.2% HbF: 0,5-6%

β-thalassemia thể nặng: Trẻ sơ sinh mắc bệnh β-thalassemia thể nặng

có biểu hiện lâm sàng rất sớm, từ 6 tháng đến 24 tháng tuổi Trẻ bị tình trạng thiếu máu nghiêm trọng Do đó, cần được điều trị bằng truyền máu thường xuyên Trẻ kém phát triển, có thể gặp các vấn đề như tiêu chảy, sốt, bụng to, lách to, xanh xao, vàng da, dị tật xương bao gồm xương dài ở chân, điển hình

là thay đổi hộp sọ và mặt [23] Bệnh nhân thalassemia thể nặng có số lượng tế bào hồng cầu tăng lên, thể tích trung bình của hồng cầu (MCV) thấp, lượng hemoglobin trung bình trong mỗi hồng cầu (MCH) ở mức trung bình [13]

β-thalassemia thể trung gian: Bệnh nhân β-thalassemia thể trung gian

có biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn thể nặng, không yêu cầu hoặc chỉ thỉnh thoảng phải truyền máu Trẻ em biểu hiện bệnh rõ ràng ở độ tuổi từ 2 đến 6 Trẻ bị chậm phát triển hoặc hoàn toàn không có biểu hiện gì cho tới khi trưởng thành ngoại trừ thiếu máu nhẹ [23]

β-thalassemia thể nhẹ: Bệnh nhân thể nhẹ thường không có biểu hiện

lâm sàng, nhưng thỉnh thoảng thiếu máu nhẹ Khi cả hai bố mẹ bị thể nhẹ thì xác suất 25% con sinh ra có nguy cơ mắc bệnh β-thalassemia thể nặng [23]

Các đặc điểm huyết học đặc trưng là tế bào hồng cầu nhỏ và nhợt nhạt hơn so với bình thường, tăng HbA2 [13]

Ngoài ra, còn có các thể β-thalassemia khác như: thể phối hợp Hemoglobin E (HbE) và β-thalassemia; thể phối hợp β-thalassemia và α-thalassemia

Thể phối hợp Hemoglobin E (HbE) và β-thalassemia: Đột biến ở Cd

26 (G→A) thuộc exon 1, làm thay đổi axit amin glutamate thành lysin, tạo thể HbE [70] Kiểu gen dị hợp tử hoặc đồng hợp tử HbE mà không phối hợp với β-thalassemia chỉ gây kiểu hình β-thalassemia thể nhẹ Tuy nhiên ở những trẻ này vẫn có biểu hiện chậm phát triển ở mức độ vừa phải, thiếu máu nhẹ, ảnh hưởng đến phát triển thể lực và tinh thần [70]

Sự kết hợp của HbE với β-thalassemia làm cho biểu hiện lâm sàng trở nên đa dạng, có thể thay đổi giống như thalassemia từ thể nặng đến thể nhẹ [70]:

- β-thalassaemia/HbE thể nhẹ: không cần điều trị và hiếm khi biểu hiện các triệu chứng lâm sàng, nồng độ hemoglobin từ 9-12 g/dl Thể HbE kết hợp với các đột biến -28 (A→G) hoặc Cd 19 (A→G) có thể dẫn tới kiểu hình thể nhẹ [70]

- thalassaemia/HbE thể trung gian: triệu chứng giống với thalassemia thể trung gian, nồng độ hemoglobin từ 6-7 g/dl Thể HbE kết hợp với đột biến IVS1.5 (G→C) có thể tạo kiểu hình thể trung gian [70]

β ββ thalassaemia/HbE thể nặng: triệu chứng giống với ββ thalassemia thể nặng, nồng độ hemoglobin thấp, chỉ từ 4-5 g/dl Thể HbE kết hợp với các đột biến Cd 17 (A→T) hoặc Cd 41/42 (-TCTT) có thể dẫn tới kiểu hình thể nặng [70]

Thể phối hợp β-thalassemia và thalassemia: Sự kết hợp đột biến

α-thalassemia có thể làm giảm mức độ nghiêm trọng của β-α-thalassemia thể nặng thành thể trung gian Trong hầu hết các trường hợp bệnh đều có liên quan đến

kết hợp 3 gen α-globin (ααα/) Thừa hai gen α-globin (ααα/ααα) hoặc (αααα/αα) kết hợp với β-thalassemia thể nhẹ tạo thalassaemia thể trung gian [8,24] Tuy nhiên, khi thừa một gen α (ααα/αα) thì kiểu hình lâm sàng phụ

thuộc vào mức độ nghiêm trọng của đột biến β-thalassemia [10,62]

1.1.5 Các phương pháp chẩn đoán bệnh

1.1.5.1 Chẩn đoán lâm sàng

Trẻ bị thalassemia thể nặng sau hai tuổi bị nghi ngờ mắc bệnh thalassemia với các biểu hiện thiếu máu nặng, vàng da, lách to Trẻ bị thalassemia thể trung gian có biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn Với trẻ mang gen bệnh thường không có triệu chứng, đôi khi chỉ là thiếu máu nhẹ [22]

β-1.1.5.2 Chẩn đoán huyết học

Chỉ số hồng cầu: Bệnh nhân thalassemia thể nặng có nồng độ

hemoglobin (Hb) giảm (<7 g/dl), thể tích trung bình hồng cầu (MCV) trong khoảng 50-60 fl và lượng hemoglobin trung bình trong một hồng cầu (MCH)

từ 14-20 pg Bệnh nhân thalassemia thể trung bình có nồng độ Hb từ 6-10 g/dl, MCV từ 55-70 fl và MCH từ 15-23 pg Bệnh nhân thalassemia thể nhẹ

có nồng độ Hb từ 9-15 g/dL đối với nam và 9-13 g/dL (đối với nữ), MCV từ 55-75 fL, MCH từ 19-25 pg (Bảng 1) [30]

Phân tích tế bào máu ngoại vi: Quan sát dưới kính hiển vi, người bị

bệnh thalassemia có hồng cầu nhợt nhạt, nhỏ hơn so với bình thường, phần lớn có hình dạng bất thường [13]

Phân tích hemoglobin: Hầu hết các quy trình chẩn đoán bệnh nhân

thalassemia hiện nay đều sử dụng phương pháp phân tích các chỉ số hồng cầu

để sàng lọc ban đầu Sau đó, sử dụng kỹ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) để phân tích hemoglobin trong mẫu dựa trên các chỉ số MCV nhỏ hơn 78 fl và/hoặc MCH nhỏ hơn 27 pg [19] Tuy vậy, quy trình này không được sử dụng phổ biến ở vùng nông thôn các khu vực Đông Nam Á, Nam Á do điều kiện vật chất và thiết bị không đủ Thay vào đó, tại các quốc gia như Thái Lan và Ấn Độ, việc sử dụng xét nghiệm tủa HbE để sàng lọc HbE (Dichlorophenol Indophenol Test - DCIP)

là lựa chọn thay thế đơn giản và chi phí thấp để sàng lọc sơ bộ β-thalassemia [22]

Hemoglobin trong hồng cầu thay đổi tùy từng giai đoạn phát triển của

cơ thể Hemoglobin thời kì bào thai (từ tháng thứ 3 đến khi sinh) là HbF, được tạo thành từ 2 chuỗi alpha globin và gamma globin (α2γ2) Sau khi sinh, chuỗi γ (HbF) không được tổng hợp, thay thế vào đó là chuỗi β, tạo hemoglobin ở người trưởng thành gồm HbA1 với 2 chuỗi alpha globin và beta globin (α2β2) và HbA2 với 2 chuỗi alpha globin và delta globin (α2δ2) [11] Trong điều kiện bình thường, hồng cầu người trưởng thành có khoảng 98% HbA1, 2% HbA2 và rất ít HbF [11] Các trường hợp bệnh β-thalassemia, chuỗi β-globin không được tổng hợp đầy đủ, làm tăng sản xuất các chuỗi γ, δ,

α dẫn tới tình trạng giảm HbA1, tăng HbF và HbA2 Đối với các trường hợp

có đột biến Cd 26 gây thể HbE sẽ có hiện diện HbE≥25% trên điện di Hb [11] Do đó, HbA1, HbF, HbA2, HbE được coi là các tiêu chuẩn điện di hemoglobin đóng vai trò quyết định để chẩn đoán bệnh β-thalassemia [11] HbA2≥4,0% là chỉ số thường được dùng để chẩn đoán β-thalassemia Trường hợp HbA2≥4,0% và chỉ số hồng cầu giảm, được chẩn đoán là mang gen bệnh β-thalassemia Khi HbA2>4,0%, nhưng chỉ số hồng cầu bình thường, người bệnh có thể thiếu vitamin B12/folate, bệnh gan hoặc nhiễm HIV Các trường hợp có HbA2 từ 3,3-3,9% cần khẳng định bằng phân tích ADN Tuy nhiên,

mức độ HbA2 và/hoặc chỉ số hồng cầu có thể bình thường ở người bệnh

β-thalassemia có gen β-globin bị đột biến vùng promoter hoặc đuôi poly A Khi

đỉnh HbA2>10%, người bệnh có thể có các biến thể hemoglobin khác, ví dụ HbE, HbS, [25] Sơ đồ sàng lọc người lành mang gen bệnh β-thalassemia được trình bày ở Hình 1.3

Hình 1.3 Biểu đồ sàng lọc người bệnh β-thalassemia [14]

1.1.5.3 Phân tích di truyền phân tử

Hầu hết các kỹ thuật phát hiện các đột biến trên gen β-globin hiện nay

thường dựa trên PCR, được chia thành hai nhóm chính: lai oligonucleotide đặc hiệu allen và mồi đặc hiệu allen [23]

Lai oligonucleotide đặc hiệu allen (Allele - specific oligonucleotide hybridization): Trong nhóm phương pháp này, yêu cầu thiết kế hai đầu dò

oligonucleotide, một đầu dò bổ sung với trình tự ADN đột biến và một đầu dò

bổ sung với trình tự bình thường tại cùng vị trí Các đầu dò này thường chỉ sai khác nhau một nucleotide Dựa trên nguyên tắc này, kỹ thuật lai điểm (dot blot) đã được phát triển và áp dụng thành công ở nhiều phòng thí nghiệm Tại Địa Trung Hải năm 1989, kỹ thuật này đã được Ristaldi và cs sử dụng để

sàng lọc 8 đột biến trên gen β-globin [48] Trong kỹ thuật lai điểm, trình tự

ADN đích được cố định trên màng nylon, sau đó lai với đầu dò được đánh dấu Tuy nhiên, trong trường hợp sàng lọc nhiều đột biến, kỹ thuật lai điểm gây tốn thời gian do các bước lai và rửa cần riêng biệt đối với từng đột biến

Do đó, kỹ thuật lai điểm ngược (reverse dot blot) đã được phát triển cho phép phát hiện được đồng thời nhiều đột biến Đầu dò được cố định trên màng nylon, sau đó lai với ADN được đánh dấu Các bước lai và rửa được tiến hành

đồng thời đối với tất cả các đột biến [53]

Mồi đặc hiệu allen (Allele - specific priming): Nhóm phương pháp

này dựa trên nguyên tắc mồi PCR bắt cặp hoàn toàn với khuôn sẽ có hiệu quả kéo dài hơn so với mồi có nucleotide bắt cặp sai, đặc biệt tại đầu 3‟ [42] Trong đó, ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System-PCR) là

kỹ thuật được sử dụng phổ biến tại nhiều quốc gia do các ưu điểm nhanh, đơn giản, ít tốn kém, có thể sàng lọc được nhiều đột biến trong một phản ứng [42]

1.2 KỸ THUẬT ARMS-PCR (AMPLIFICATION REFRACTORY MUTATION SYSTEM - PCR)

1.2.1 Nguyên tắc của kỹ thuật ARMS-PCR

ARMS-PCR còn được gọi là PCR đặc hiệu allen (Allele-specific ASP) hay PCR khuếch đại allen đặc hiệu (PCR Amplification of Specific Alleles-PASA), được sử dụng hiệu quả trong việc phát hiện các đột biến

PCR-điểm Được mô tả lần đầu tiên bởi Newton, kỹ thuật này sau đó đã được phát triển để phát hiện các đột biến β-thalassemia phổ biến ở tất cả các nhóm dân tộc [41,42]

Phương pháp này dựa trên đặc tính DNA polymerase yêu cầu nucleotide ở đầu 3‟ của mồi bắt cặp bổ sung với nucleotide trên sợi khuôn Nếu nucleotide đầu 3‟ của mồi không bổ sung với trình tự đích thì Taq polymerase không thể tổng hợp sợi mới được Do đó, kỹ thuật này đòi hỏi nucleotide đầu 3‟ của mồi phải mang tính đặc hiệu [41] Sơ đồ của kỹ thuật ARMS-PCR được trình bày ở Hình 1.4

Hình 1.4 Sơ đồ kỹ thuật ARMS-PCR phát hiện đột biến điểm [67]

1.2.2 Thiết kế mồi cho phản ứng ARMS-PCR

Mồi sử dụng cho một phản ứng ARMS-PCR bao gồm mồi bình thường

và mồi đột biến Mồi bình thường đặc hiệu cho trình tự ADN bình thường, không khuếch đại được trình tự ADN đột biến và ngược lại Sự có mặt của đột biến được thể hiện bằng sản phẩm ADN được khuếch đại với các kích thước đã biết trước Trong phản ứng ARMS-PCR còn có một cặp mồi nội

chuẩn nhằm khuếch đại vùng gen đích không có đột biến để tránh trường hợp

âm tính giả do các nguyên nhân như: quá ít hoặc quá nhiều ADN, ADN chất lượng không tốt, không có mồi, không có Taq DNA polymerase hay các thành phần khác hoặc có mặt chất ức chế phản ứng PCR [35]

Sự nghiêm ngặt của điều kiện phản ứng có thể ảnh hưởng tới độ nhạy

và độ đặc hiệu của phản ứng ARMS-PCR Do đó, các yếu tố như thiết kế mồi tốt, nhiệt độ gắn mồi cao và số chu kì giới hạn rất quan trọng để cho kết quả chính xác Nhiệt độ gắn mồi quá thấp hoặc số chu kì phản ứng quá cao, đều

có thể dẫn tới kết quả dương tính giả [35]

Việc thiết kế mồi bình thường và mồi đột biến dựa trên các đặc điểm được trình bày ở Bảng 1.2

Bảng 1.2 Đặc điểm các mồi bình thường và mồi đột biến của phản ứng

ARMS-PCR [35]

- Dài khoảng 30 bp

- Thành phần G+C từ 40-60%

- Trình tự các nucleotide tại đầu 3‟

không bổ sung với mồi đột biến hoặc

mồi nội chuẩn

- Không có trình tự nucleotide lặp lại

để tránh hiện tượng bắt cặp nhầm

- Dài khoảng 30 bp

- Nucleotide tận cùng đầu 3‟ của mồi

bổ sung với nucleotide đích Bắt cặp sai tại vị trí này làm giảm hiệu quả khuếch đại Bắt cặp sai giữa các nucleotide A:G, G:A, C:C dẫn tới hiệu quả khuếch đại giảm nhiều nhất, trong khi các bắt cặp sai khác làm giảm khuếch đại ở các mức độ khác nhau

- Bổ sung thêm vị trí bắt cặp sai tại một trong 5 nucleotide cuối cùng của

mồi làm tăng tính đặc hiệu của sản phẩm

1.2.3 Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật ARMS-PCR

Kỹ thuật ARMS-PCR phù hợp để phát hiện các đột biến điểm, cho phép phân biệt giữa trình tự bình thường, đột biến đồng hợp, dị hợp Đây là

kỹ thuật nhanh, ít tốn kém, không yêu cầu mồi phải đánh dấu và hệ thống phát hiện phức tạp [67]

Tuy vậy, kỹ thuật này chỉ có thể phát hiện được các đột biến đã biết và

đa hình Do đó, cần kết hợp với các phương pháp chẩn đoán phân tử khác (ví

dụ giải trình tự) Đối với phản ứng đơn ARMS-PCR, trong một lần thực hiện phản ứng chỉ có thể phát hiện được một đột biến, dẫn tới chi phí khá tốn kém

Để giải quyết vấn đề này, kỹ thuật multiplex ARMS-PCR đã được phát triển cho phép phát hiện nhiều đột biến trong cùng một phản ứng [67] Kỹ thuật multiplex ARMS-PCR do sự kết hợp giữa multiplex PCR và ARMS-PCR, cho phép sử dụng đồng thời allen bình thường và allen đột biến trong cùng một phản ứng để phát hiện trạng thái đồng hợp, dị hợp của các đột biến [51]

1.2.4 Kỹ thuật ARMS-PCR trong chẩn đoán bệnh β-thalassemia

Kỹ thuật ARMS-PCR đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác

nhau để phát hiện đột biến trên gen β-globin Tại Singapore, Tan và cs đã sử

dụng kỹ thuật ARMS-PCR để chẩn đoán trước sinh sáu đột biến phổ biến gây bệnh β-thalassemia là -28 (A→G), IVS1.1 (G→T), IVS1.5 (G→C), Cd 17 (A→T), Cd 41/42 (-TCTT) và IVS2.654 (C→T) [59] Kỹ thuật này cũng đã được áp dụng thành công để phát hiện các đột biến hiếm -29 (A→G), đột biến codon mở đầu ATG→AGG, Cd 8/9 (+G), CAP (+1) (A→C), đột biến đuôi poly A (A→G) của người Malay và Trung Quốc tại Malaysia [20] Trong nghiên cứu năm 2001, Najmabadi và cs đã thiết lập phương pháp ARMS-

PCR để sàng lọc 10 đột biến β-thalassemia phổ biến nhất và HbS trên 82 bệnh nhân thể vừa và nặng tại Iran [40] Tại Pakistan, năm 2009, kỹ thuật ARMS-PCR cũng đã được áp dụng để sàng lọc 5 đột biến phổ biến IVS1.1 (G→T), IVS1.5 (G→C), Cd 8/9 (+G), Cd 41/42 (-CTTT) và đột biến mất đoạn 619 bp [64]

Tại Việt Nam, Lý Thị Thanh Hà và cs (2008) đã áp dụng kỹ thuật ARMS-PCR trong chẩn đoán trước và sau sinh bệnh β-thalassemia tại bệnh

viện Nhi Trung Uơng nhằm phát hiện các đột biến gen β-globin trên bệnh

nhân β-thalassemia Kết quả đã đưa ra tần suất của các đột biến thường gặp và chẩn đoán trước sinh cho thai phụ có nguy cơ sinh con bị β-thalassemia thể nặng [1] Năm 2008, Nguyễn Khắc Hân Hoan và cs đã xây dựng kỹ thuật multiplex ARMS-PCR ứng dụng vào chẩn đoán trước sinh đột biến β-thalassemia cho các cặp vợ chồng bị bệnh β-thalassemia khám thai tại Bệnh viện Từ Dũ Kết quả cho thấy, kỹ thuật ARMS-PCR có chi phí thấp, thời gian chẩn đoán nhanh và độ chính xác 100% [3] Gần đây nhất, năm 2014, Trần Vân Khánh và cs khi áp dụng multiplex ARMS-PCR để xác định đồng thời 9

đột biến phổ biến trên gen β-globin ở bệnh nhân β-thalassemia cho kết quả

39/52 trường hợp mang đột biến chiếm tỷ lệ 75% [5]

1.3 KỸ THUẬT LAI ĐIỂM NGƯỢC (REVERSE DOT BLOT)

1.3.1 Nguyên tắc chung của kỹ thuật lai axit nucleic

Các bazơ nitơ giữa hai mạch đơn polynucleotide liên kết với nhau theo nguyên tắc bổ sung (A liên kết với T và C liên kết với G) thông qua các mối liên kết hydro để tạo nên chuỗi ADN mạch kép [66] Dưới các yếu tố như nhiệt độ cao, urê, kiềm, liên kết hydro có thể bị phá vỡ, phân tử ADN sợi kép

có thể tách thành các sợi đơn Khi các yếu tố biến tính bị loại bỏ, hai mạch đơn có thể tái liên kết thành dạng sợi đôi Trường hợp các sợi đơn ADN từ

các nguồn khác nhau và có trình tự tương đồng, chúng có thể bắt cặp với nhau được gọi là quá trình lai [71]

Lai pha rắn là dạng kỹ thuật lai khi trình tự axit nucleic đích (ADN hoặc ARN) được cố định trên pha rắn, thông thường là màng nitrocellulose hoặc nylon; trong khi đầu dò (đoạn ADN hoặc ARN có độ tương đồng cao với phân tử đích) tự do trong dung dịch Các kỹ thuật lai pha rắn thường là: Southern blots, Northern blot, dot blot Một dạng cải biến của kỹ thuật lai pha rắn đang được sử dụng phổ biến hiện nay là kỹ thuật lai ngược, đầu dò được

cố định trên màng, trình tự đích được đánh dấu và bổ sung vào dung dịch [55] Cả hai kỹ thuật lai đều diễn ra theo 3 bước Đầu tiên, màng được ủ với đệm tiền lai để các vị trí trên màng không có ADN sẽ bị bão hòa đối với các loại ADN và phân tử trùng phân Sau đó, màng được ủ với đệm chứa đầu dò ở điều kiện thích hợp để quá trình lai giữa đầu dò và trình tự ADN đích diễn ra Cuối cùng, màng được rửa với các dung dịch để loại bỏ các liên kết không đặc hiệu Điều kiện rửa ít nghiêm ngặt (nồng độ muối cao và nhiệt độ thấp) làm tăng độ nhạy, tuy nhiên kết quả lai không đặc hiệu và tín hiệu nền cao Ngược lại, điều kiện rửa nghiêm ngặt (nồng độ muối thấp, nhiệt độ cao) làm giảm tín hiệu nền, tăng tính đặc hiệu của kết quả lai [65]

1.3.2 Đầu dò trong kỹ thuật lai điểm ngược

Đầu dò là một phân tử axit nucleic (ADN sợi đơn hoặc ARN sợi đơn)

có ái lực mạnh với đích đặc hiệu (trình tự ADN hoặc ARN) Đầu dò oligonucleotide gắn chính xác với trình tự đích Chiều dài của chúng phù hợp cho phản ứng lai trong các điều kiện ngặt nghèo, giúp phân biệt ADN với những sai khác rất nhỏ trong trình tự Việc thiết kế đầu dò dựa trên các đặc điểm sau [28]:

- Kích thước phổ biến là 18-30 nucleotide

- Thành phần G+C từ 40-60% để tăng khả năng lai đặc hiệu

- Không được có các trình tự bổ sung bên trong đầu dò để tránh hình thành cấu trúc “kẹp tóc” (hair-pin), ngăn cản quá trình lai

- Tránh trình tự có nhiều hơn 4 nucleotide lặp lại

- Không sử dụng đầu dò có độ tương đồng >70% với các vùng không phải trình tự đích để tránh hiện tượng lai không đặc hiệu

Đầu dò cho kỹ thuật lai điểm ngược thường được gắn thêm nhóm amin

bậc một („amino-linkers‟) vào đầu 5' ở bước cuối cùng của quá trình tổng hợp đầu dò, ngăn cách với đầu dò bởi nhóm spacer („spacer arm‟) Chiều dài đầy

đủ của nhóm amino-linker và spacer xấp xỉ khoảng 28 Å (Hình 1.5) [75]

Hình 1.5 Cấu trúc của oligonucleotide amino-linkers và spacer arm

[75]

Hình 1.6 mô tả hệ thống phát hiện màu của quá trình lai điểm ngược Đầu tiên, đầu dò được cố định lên màng và lai với ADN được đánh dấu Thông thường là sản phẩm PCR đánh dấu với biotin (vitamin H) Trong tự nhiên, tương tác giữa biotin và streptavidin là tương tác sinh học không cộng

hóa trị mạnh nhất (hằng số phân ly Kd = 10-15) [17] Do đó, streptavidine được đưa vào phức streptavidin-alkaline phosphatase Cuối cùng, cơ chất tạo màu của alkaline-phosphatase (5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate - BCIP) và thuốc nhuộm (nitro-blue-tetrazalium - NBT) được thêm vào hệ thống Khi enzyme alkaline phosphatase loại bỏ nhóm phosphate khỏi BCIP, dung dịch

NBT-BCIP vàng nhạt sẽ chuyển sang dạng tủa xanh dương Kết quả là đầu dò trên màng lai với sợi ADN đánh dấu biotin sẽ có màu xanh đặc trưng, quan sát dễ dàng bằng mắt thường (Hình 1.6) [31,52]

Hình 1.6 Cơ chế phát hiện màu của quá trình lai điểm ngược [78] 1.3.3 Màng sử dụng trong kỹ thuật lai điểm ngược

Màng được sử dụng cho kỹ thuật lai điểm ngược là màng nylon Biodyne C tích điện âm Các nhóm carboxyl trên màng được hoạt hóa bằng EDC (1-ethyl-3-dimethylamino propyl carbodiimide hydrochloride) thành dạng O-acylurea Dạng chất trung gian này lập tức phản ứng với nhóm amin trên đầu dò oligo thành liên kết amide Theo nguyên tắc, trong môi trường lỏng, cả amino-linkers và exocyclic amines của bazơ đều phản ứng với nhóm carboxyl hoạt hóa Tuy nhiên, các amin bậc 1 đầu 5‟ có ái lực liên kết với nhóm carboxyl mạnh hơn so với các amin thơm trên bazơ Do đó, nhóm carboxyl sẽ ưu tiên gắn với các oligo có nhóm amin ở đầu 5' [77]

Các nhóm carboxyl sau khi đã được hoạt hóa có thể phản ứng với bất kì tác nhân nào có trong dung dịch Việc bám không đặc hiệu này thông qua các tương tác tĩnh điện, kị nước hoặc tương tác hóa học đều có thể làm giảm đáng

kể độ nhạy của kỹ thuật lai Do đó, đầu dò oligo sau khi đã được cố định trên

màng, cần bất hoạt tất cả các nhóm đã được hoạt hóa nhưng không được gắn oligo Dung dịch NaOH 0,1 N thường được sử dụng cho quá trình này do tính hiệu quả và đơn giản Màng sau khi được hoạt hóa được bảo quản trong môi trường tránh ẩm [77]

1.3.4 Kỹ thuật lai điểm ngược trong chẩn đoán bệnh β-thalassemia

Với ưu điểm nổi bật cho phép phát hiện được nhiều đột biến trong cùng một lần thực hiện, phương pháp lai điểm ngược đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để phát hiện đột biến β-thalassemia Nghiên cứu của Sutcharitchan và cs (1995) sử dụng lai điểm ngược để phát hiện 14 đột biến gây bệnh β-thalassemia và các đột biến HbS, HbC ở những người Mỹ gốc Phi [56] Trong nghiên cứu vào năm 2012, Lin và cs đã thiết lập kỹ thuật lai điểm ngược nhằm phát hiện 5 đột biến gây bệnh α-thalassemia và 16 đột biến gây bệnh β-thalassemia [34] Kết quả thu được hoàn toàn phù hợp với kỹ thuật giải trình tự và gap-PCR (sử dụng kit thương mại)

Ở một số quốc gia, kỹ thuật lai điểm ngược đã được phát triển để chẩn đoán trước sinh β-thalassemia [31,68] Từ năm 1999, tại Thái Lan, kỹ thuật lai điểm ngược đã được áp dụng cho phép phát hiện 10 đột biến phổ biến và

14 đột biến ít phổ biến để chẩn đoán trước sinh trên 105 thai phụ [68] Năm

2006, tại Trung Quốc, kỹ thuật này cũng được sử dụng nhằm phát hiện đồng thời 17 loại đột biến phổ biến β-thalassemia, kết hợp với giải trình tự để chẩn đoán trước sinh trên 317 thai phụ [31]

Cho tới nay, lai điểm ngược là kỹ thuật duy nhất được các hãng phát triển thành các kit thương mại để chẩn đoán đột biến β-thalassemia Bộ kit StripAssay của ViennaLab cho phép phát hiện đồng thời 21 đột biến α-thalassaemia và 22 đột biến β-thalassaemia là một ví dụ [80] Tại Việt Nam,

kỹ thuật này cũng đã được Công ty cổ phần công nghệ Việt Á áp dụng để sản

xuất bộ kit LightPower iVAHPV Genotype RDB nhằm xác định sự đồng nhiễm

của 8 type HPV (Human papillomavirus) nguy cơ thấp và 16 type HPV nguy

cơ cao liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung [79] Tuy nhiên, đây là bộ kit duy nhất dựa trên kỹ thuật lai điểm ngược được sản xuất ở nước ta

Hiện nay tại Việt Nam, kỹ thuật ARMS-PCR đã được áp dụng trong nhiều nghiên cứu để chẩn đoán đột biến β-thalassemia và cho kết quả rất khả quan [1,3,5] Tuy nhiên, số nghiên cứu sử dụng lai điểm ngược còn rất hạn chế Nguyên nhân là do việc tối ưu cho điều kiện lai và rửa đồng thời đối với nhiều đột biến trong cùng một lần lai gặp rất nhiều khó khăn Vì vậy, chúng tôi mong muốn áp dụng kỹ thuật lai điểm ngược để phân tích đồng thời một

số đột biến phổ biến trên gen β-globin ở người Việt Nam Vì vậy, chúng tôi

mong muốn áp dụng kỹ thuật lai điểm ngược để phân tích đồng thời một số

đột biến phổ biến trên gen β-globin ở người Việt Nam, từ đó tự chủ thêm kỹ thuật xét nghiệm hiệu quả Vì lý do đó, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu:

“Phát hiện các đột biến trên gen beta globin bằng kỹ thuật ARMS-PCR và lai

điểm ngược (reverse dot blot)” với các nội dung nghiên cứu: (1) xây dựng

được kỹ thuật ARMS-PCR để sàng lọc một số đột biến phổ biến trên gen

β-globin tại Việt Nam; (2) tối ưu được điều kiện cho kỹ thuật lai điểm ngược

phát hiện một số đột biến điểm phổ biến gây bệnh β-thalassemia

Chương 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

- GoTaq Master Mix 2x (Promega)

- Đệm Taq DNA polymerase (có chứa Mg2+ 20 mM)

- Chất hoạt hóa màng nylon Biodyne C: EDC dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) (Sigma-Aldrich)

(1-Ethyl-3-[3 Cơ chất cho phản ứng tạo màu: Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase (Promega)

- Agarose (Takara)

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lysogeny Broth (LB) gồm 1% trypton; 0,5% cao nấm men; 0,5% NaCl

- Marker 100 bp (Fermentas)

- Chủng tế bào khả biến E coli JM109 được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm

Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Kit tách ADN tổng số từ mẫu máu: Thermo Scientific™ GeneJET™ Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo)

- Kit nhân dòng gen: InsTAclone PCR Cloning Kit (Thermo)

- Các dung dịch d̀ùng trong quá trình lai đi ểm ngược được trình bày trong Bảng 2.1

- Các hóa chất thông dụng khác đều đạt độ sạch dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử

Bảng 2.1 Thành phần các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm ngược

SSC 1x NaCl 0,015 M; Natri citrat (Na3C6H5O7) 0,15 M

pH 7 Denhardt 1x Ficoll 400 0,02%; Polyvinylpyrrolidone 0,02%; Bovine serum albumin 0,02%

2.1.3 Trình tự các đầu dò oligo sử dụng trong nghiên cứu

Các đầu dò oligo dùng trong kỹ thuật lai điểm ngược được gắn thêm nhóm amin ở đầu 5', giúp liên kết với nhóm carboxyl trên màng nylon Biodyne C Toàn bộ các đầu dò dùng trong nghiên cứu được cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ) Trình tự các oligo được trình bày trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Trình tự các đầu dò oligo dùng trong kỹ thuật lai điểm ngược

(nucleotide gạch chân tương ứng với đột biến)

2.1.4 Trình tự các mồi

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các cặp mồi nhằm sàng lọc

đồng thời bốn loại đột biến trên gen β-globin (NC_000011.8) phổ biến ở

người Việt Nam: Cd 17 (A→T), Cd 26 (G→A), Cd 41/42 (-TCTT) và Cd 95 (+A) Trong đó, cặp mồi nội kiểm 95 NF/Control R được thiết kế dựa trên

trình tự gen β-globin nhằm khuếch đại vùng chứa các đột biến được nghiên

cứu Các mồi 17 MR, 26 MR, 41/42 MR, 95 MR được thiết kế dựa trên trình

tự đột biến để phát hiện các đột biến tại Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 và Cd 95 trên

gen β-globin đã được sử dụng trong một số nghiên cứu của Phòng thí nghiệm

Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên [4] Các mồi 17

NF, 26 NF, 41/42 NF được thiết kế dựa trên trình tự gen β-globin nhằm xác

định kiểu gen đồng hợp hoặc dị hợp Toàn bộ mồi dùng trong nghiên cứu được cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ) Sơ đồ minh họa vị trí các mồi được trình bày ở Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ minh họa vị trí các mồi sử dụng trong nghiên cứu

Trình tự các mồi được trình bày trong Bảng 2.3 Toàn bộ mồi dùng trong nghiên cứu được cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ)

Bảng 2.3 Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu

A

Phát hiện đột biến Cd 41/42

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm

Chúng tôi thiết kế sơ đồ thí nghiệm như Hình 2.2, bao gồm 5 bước:

- Bước 1: Tách ADN từ các mẫu bệnh phẩm; xác định nồng độ ADN

bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 260 nm; điện di kiểm tra ADN

- Bước 2: Thực hiện PCR đa mồi với các mẫu ADN đạt chất lượng

nhằm sàng lọc 4 đột biến phổ biến trên gen β-globin ở người Việt Nam

- Bước 3: Tiến hành kiểm tra với các mẫu có đột biến bằng kỹ thuật ARMS-PCR để xác định kiểu gen

- Bước 4: Tách dòng, giải trình tự các đoạn có đột biến và không có đột

biến trên gen β-globin

- Bước 5: Thử nghiệm kỹ thuật lai điểm ngược phát hiện đột biến trên

các mẫu bệnh phẩm

Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm phát hiện các đột biến trên gen β-globin