2.2.6.1 Hoạt hóa và cố định đầu dò trên màng nylon Biodyne C (Pall)
- Rửa màng với dung dịch HCl 0,1 N trong 3 phút
- Chuyển màng vào dung dịch EDC 16%, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng 15 phút
- Để khô màng ở nhiệt độ phòng
- Đầu dò oligo (Bảng 2.2) đƣợc pha loãng đến nồng độ tối ƣu trong đệm NaHCO3/Na2CO3 0,5 M, pH 8,4
- Chấm 1 µl đầu dò đã pha loãng lên màng, để khô 10 phút - Cố định bằng NaOH 0,1 N trong 10 phút
- Rửa màng 2 lần với H2O
- Để khô và bảo quản ở 4oC hoặc dùng màng lai ngay.
2.2.6.2 Tiền lai và lai
- Tiền lai: chuyển màng vào đệm tiền lai (SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1%) ở nhiệt độ lai trong 20 phút
- Biến tính sản phẩm PCR đánh dấu biotin trong đệm lai: bổ sung 28 µl sản phẩm PCR đƣợc đánh dấu với biotin-11-dUTP vào 100 µl đệm lai H (SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1%), ủ 95oC trong 10 phút rồi chuyển ngay lên đá
35
- Cho sản phẩm biến tính vào 1,5 ml đệm lai H (SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1%). Chuyển màng sang dung dịch này và duy trì ở nhiệt độ lai trong 60 phút
- Rửa màng để loại bỏ đầu dò dƣ thừa: chuyển màng vào dung dịch rửa W (SSC 2x; SDS 0,1%) ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Lặp lại bƣớc này thêm một lần nữa.
2.2.6.3 Phát hiện đầu dò Khóa màng
- Ủ màng với dung dịch U1 (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5; NaCl 0,15 M) trong 20 phút ở nhiệt độ phòng
Gắn đầu dò với SA-AP
- Pha loãng SA-AP trong đệm U1 (SA-AP : đệm U1 = 1: 1500). Chuyển màng vào dung dịch này trong 30 phút ở nhiệt độ phòng
- Sau khi loại bỏ dung dịch trên, chuyển màng vào đệm U1 (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5; NaCl 0,15 M) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Lặp lại bƣớc này thêm một lần nữa
- Ủ màng với dung dịch đệm U2 (Tris-HCl 0,1 M pH 9,5; NaCl 0,1 M; MgCl2 0,05 M) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng
Phát hiện đầu dò
- Thêm cơ chất của enzyme Alkaline phosphatase và ủ tránh ánh sáng. Quan sát kết quả sau 90 phút.