ARMS-PCR còn đƣợc gọi là PCR đặc hiệu allen (Allele-specific PCR- ASP) hay PCR khuếch đại allen đặc hiệu (PCR Amplification of Specific Alleles-PASA), đƣợc sử dụng hiệu quả trong việc phát hiện các đột biến
14
điểm. Đƣợc mô tả lần đầu tiên bởi Newton, kỹ thuật này sau đó đã đƣợc phát triển để phát hiện các đột biến β-thalassemia phổ biến ở tất cả các nhóm dân tộc [41,42].
Phƣơng pháp này dựa trên đặc tính DNA polymerase yêu cầu nucleotide ở đầu 3‟ của mồi bắt cặp bổ sung với nucleotide trên sợi khuôn. Nếu nucleotide đầu 3‟ của mồi không bổ sung với trình tự đích thì Taq polymerase không thể tổng hợp sợi mới đƣợc. Do đó, kỹ thuật này đòi hỏi nucleotide đầu 3‟ của mồi phải mang tính đặc hiệu [41]. Sơ đồ của kỹ thuật ARMS-PCR đƣợc trình bày ở Hình 1.4.
Hình 1.4. Sơ đồ kỹ thuật ARMS-PCR phát hiện đột biến điểm [67]. 1.2.2 Thiết kế mồi cho phản ứng ARMS-PCR
Mồi sử dụng cho một phản ứng ARMS-PCR bao gồm mồi bình thƣờng và mồi đột biến. Mồi bình thƣờng đặc hiệu cho trình tự ADN bình thƣờng, không khuếch đại đƣợc trình tự ADN đột biến và ngƣợc lại. Sự có mặt của đột biến đƣợc thể hiện bằng sản phẩm ADN đƣợc khuếch đại với các kích thƣớc đã biết trƣớc. Trong phản ứng ARMS-PCR còn có một cặp mồi nội
15
chuẩn nhằm khuếch đại vùng gen đích không có đột biến để tránh trƣờng hợp âm tính giả do các nguyên nhân nhƣ: quá ít hoặc quá nhiều ADN, ADN chất lƣợng không tốt, không có mồi, không có Taq DNA polymerase hay các thành phần khác hoặc có mặt chất ức chế phản ứng PCR [35].
Sự nghiêm ngặt của điều kiện phản ứng có thể ảnh hƣởng tới độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ARMS-PCR. Do đó, các yếu tố nhƣ thiết kế mồi tốt, nhiệt độ gắn mồi cao và số chu kì giới hạn rất quan trọng để cho kết quả chính xác. Nhiệt độ gắn mồi quá thấp hoặc số chu kì phản ứng quá cao, đều có thể dẫn tới kết quả dƣơng tính giả [35].
Việc thiết kế mồi bình thƣờng và mồi đột biến dựa trên các đặc điểm đƣợc trình bày ở Bảng 1.2.
Bảng 1.2. Đặc điểm các mồi bình thƣờng và mồi đột biến của phản ứng
ARMS-PCR [35]
Mồi bình thƣờng Mồi đột biến
- Dài khoảng 30 bp
- Thành phần G+C từ 40-60%
- Trình tự các nucleotide tại đầu 3‟ không bổ sung với mồi đột biến hoặc mồi nội chuẩn
- Không có trình tự nucleotide lặp lại để tránh hiện tƣợng bắt cặp nhầm.
- Dài khoảng 30 bp
- Nucleotide tận cùng đầu 3‟ của mồi bổ sung với nucleotide đích. Bắt cặp sai tại vị trí này làm giảm hiệu quả khuếch đại. Bắt cặp sai giữa các nucleotide A:G, G:A, C:C dẫn tới hiệu quả khuếch đại giảm nhiều nhất, trong khi các bắt cặp sai khác làm giảm khuếch đại ở các mức độ khác nhau
- Bổ sung thêm vị trí bắt cặp sai tại một trong 5 nucleotide cuối cùng của
16
mồi làm tăng tính đặc hiệu của sản phẩm.
1.2.3 Ƣu điểm và nhƣợc điểm của kỹ thuật ARMS-PCR
Kỹ thuật ARMS-PCR phù hợp để phát hiện các đột biến điểm, cho phép phân biệt giữa trình tự bình thƣờng, đột biến đồng hợp, dị hợp. Đây là kỹ thuật nhanh, ít tốn kém, không yêu cầu mồi phải đánh dấu và hệ thống phát hiện phức tạp [67].
Tuy vậy, kỹ thuật này chỉ có thể phát hiện đƣợc các đột biến đã biết và đa hình. Do đó, cần kết hợp với các phƣơng pháp chẩn đoán phân tử khác (ví dụ giải trình tự). Đối với phản ứng đơn ARMS-PCR, trong một lần thực hiện phản ứng chỉ có thể phát hiện đƣợc một đột biến, dẫn tới chi phí khá tốn kém. Để giải quyết vấn đề này, kỹ thuật multiplex ARMS-PCR đã đƣợc phát triển cho phép phát hiện nhiều đột biến trong cùng một phản ứng [67]. Kỹ thuật multiplex ARMS-PCR do sự kết hợp giữa multiplex PCR và ARMS-PCR, cho phép sử dụng đồng thời allen bình thƣờng và allen đột biến trong cùng một phản ứng để phát hiện trạng thái đồng hợp, dị hợp của các đột biến [51].
1.2.4 Kỹ thuật ARMS-PCR trong chẩn đoán bệnh β-thalassemia
Kỹ thuật ARMS-PCR đã đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác nhau để phát hiện đột biến trên gen β-globin. Tại Singapore, Tan và cs. đã sử dụng kỹ thuật ARMS-PCR để chẩn đoán trƣớc sinh sáu đột biến phổ biến gây bệnh β-thalassemia là -28 (A→G), IVS1.1 (G→T), IVS1.5 (G→C), Cd 17 (A→T), Cd 41/42 (-TCTT) và IVS2.654 (C→T) [59]. Kỹ thuật này cũng đã đƣợc áp dụng thành công để phát hiện các đột biến hiếm -29 (A→G), đột biến codon mở đầu ATG→AGG, Cd 8/9 (+G), CAP (+1) (A→C), đột biến đuôi poly A (A→G) của ngƣời Malay và Trung Quốc tại Malaysia [20]. Trong nghiên cứu năm 2001, Najmabadi và cs. đã thiết lập phƣơng pháp ARMS-
17
PCR để sàng lọc 10 đột biến β-thalassemia phổ biến nhất và HbS trên 82 bệnh nhân thể vừa và nặng tại Iran [40]. Tại Pakistan, năm 2009, kỹ thuật ARMS- PCR cũng đã đƣợc áp dụng để sàng lọc 5 đột biến phổ biến IVS1.1 (G→T), IVS1.5 (G→C), Cd 8/9 (+G), Cd 41/42 (-CTTT) và đột biến mất đoạn 619 bp [64].
Tại Việt Nam, Lý Thị Thanh Hà và cs. (2008) đã áp dụng kỹ thuật ARMS-PCR trong chẩn đoán trƣớc và sau sinh bệnh β-thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung Uơng nhằm phát hiện các đột biến gen β-globin trên bệnh nhân β-thalassemia. Kết quả đã đƣa ra tần suất của các đột biến thƣờng gặp và chẩn đoán trƣớc sinh cho thai phụ có nguy cơ sinh con bị β-thalassemia thể nặng [1]. Năm 2008, Nguyễn Khắc Hân Hoan và cs. đã xây dựng kỹ thuật multiplex ARMS-PCR ứng dụng vào chẩn đoán trƣớc sinh đột biến β- thalassemia cho các cặp vợ chồng bị bệnh β-thalassemia khám thai tại Bệnh viện Từ Dũ. Kết quả cho thấy, kỹ thuật ARMS-PCR có chi phí thấp, thời gian chẩn đoán nhanh và độ chính xác 100% [3]. Gần đây nhất, năm 2014, Trần Vân Khánh và cs. khi áp dụng multiplex ARMS-PCR để xác định đồng thời 9 đột biến phổ biến trên gen β-globin ở bệnh nhân β-thalassemia cho kết quả 39/52 trƣờng hợp mang đột biến chiếm tỷ lệ 75% [5].
1.3 KỸ THUẬT LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT) 1.3.1 Nguyên tắc chung của kỹ thuật lai axit nucleic 1.3.1 Nguyên tắc chung của kỹ thuật lai axit nucleic
Các bazơ nitơ giữa hai mạch đơn polynucleotide liên kết với nhau theo nguyên tắc bổ sung (A liên kết với T và C liên kết với G) thông qua các mối liên kết hydro để tạo nên chuỗi ADN mạch kép [66]. Dƣới các yếu tố nhƣ nhiệt độ cao, urê, kiềm, liên kết hydro có thể bị phá vỡ, phân tử ADN sợi kép có thể tách thành các sợi đơn. Khi các yếu tố biến tính bị loại bỏ, hai mạch đơn có thể tái liên kết thành dạng sợi đôi. Trƣờng hợp các sợi đơn ADN từ
18
các nguồn khác nhau và có trình tự tƣơng đồng, chúng có thể bắt cặp với nhau đƣợc gọi là quá trình lai [71].
Lai pha rắn là dạng kỹ thuật lai khi trình tự axit nucleic đích (ADN hoặc ARN) đƣợc cố định trên pha rắn, thông thƣờng là màng nitrocellulose hoặc nylon; trong khi đầu dò (đoạn ADN hoặc ARN có độ tƣơng đồng cao với phân tử đích) tự do trong dung dịch. Các kỹ thuật lai pha rắn thƣờng là: Southern blots, Northern blot, dot blot. Một dạng cải biến của kỹ thuật lai pha rắn đang đƣợc sử dụng phổ biến hiện nay là kỹ thuật lai ngƣợc, đầu dò đƣợc cố định trên màng, trình tự đích đƣợc đánh dấu và bổ sung vào dung dịch [55]. Cả hai kỹ thuật lai đều diễn ra theo 3 bƣớc. Đầu tiên, màng đƣợc ủ với đệm tiền lai để các vị trí trên màng không có ADN sẽ bị bão hòa đối với các loại ADN và phân tử trùng phân. Sau đó, màng đƣợc ủ với đệm chứa đầu dò ở điều kiện thích hợp để quá trình lai giữa đầu dò và trình tự ADN đích diễn ra. Cuối cùng, màng đƣợc rửa với các dung dịch để loại bỏ các liên kết không đặc hiệu. Điều kiện rửa ít nghiêm ngặt (nồng độ muối cao và nhiệt độ thấp) làm tăng độ nhạy, tuy nhiên kết quả lai không đặc hiệu và tín hiệu nền cao. Ngƣợc lại, điều kiện rửa nghiêm ngặt (nồng độ muối thấp, nhiệt độ cao) làm giảm tín hiệu nền, tăng tính đặc hiệu của kết quả lai [65].
1.3.2 Đầu dò trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc
Đầu dò là một phân tử axit nucleic (ADN sợi đơn hoặc ARN sợi đơn) có ái lực mạnh với đích đặc hiệu (trình tự ADN hoặc ARN). Đầu dò oligonucleotide gắn chính xác với trình tự đích. Chiều dài của chúng phù hợp cho phản ứng lai trong các điều kiện ngặt nghèo, giúp phân biệt ADN với những sai khác rất nhỏ trong trình tự. Việc thiết kế đầu dò dựa trên các đặc điểm sau [28]:
19
- Thành phần G+C từ 40-60% để tăng khả năng lai đặc hiệu
- Không đƣợc có các trình tự bổ sung bên trong đầu dò để tránh hình thành cấu trúc “kẹp tóc” (hair-pin), ngăn cản quá trình lai
- Tránh trình tự có nhiều hơn 4 nucleotide lặp lại
- Không sử dụng đầu dò có độ tƣơng đồng >70% với các vùng không phải trình tự đích để tránh hiện tƣợng lai không đặc hiệu.
Đầu dò cho kỹ thuật lai điểm ngƣợc thƣờng đƣợc gắn thêm nhóm amin bậc một („amino-linkers‟) vào đầu 5' ở bƣớc cuối cùng của quá trình tổng hợp đầu dò, ngăn cách với đầu dò bởi nhóm spacer („spacer arm‟). Chiều dài đầy đủ của nhóm amino-linker và spacer xấp xỉ khoảng 28 Å (Hình 1.5) [75].
Hình 1.5. Cấu trúc của oligonucleotide amino-linkers và spacer arm
[75].
Hình 1.6 mô tả hệ thống phát hiện màu của quá trình lai điểm ngƣợc. Đầu tiên, đầu dò đƣợc cố định lên màng và lai với ADN đƣợc đánh dấu. Thông thƣờng là sản phẩm PCR đánh dấu với biotin (vitamin H). Trong tự nhiên, tƣơng tác giữa biotin và streptavidin là tƣơng tác sinh học không cộng hóa trị mạnh nhất (hằng số phân ly Kd = 10-15) [17]. Do đó, streptavidine đƣợc đƣa vào phức streptavidin-alkaline phosphatase. Cuối cùng, cơ chất tạo màu của alkaline-phosphatase (5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate - BCIP) và thuốc nhuộm (nitro-blue-tetrazalium - NBT) đƣợc thêm vào hệ thống. Khi enzyme alkaline phosphatase loại bỏ nhóm phosphate khỏi BCIP, dung dịch
20
NBT-BCIP vàng nhạt sẽ chuyển sang dạng tủa xanh dƣơng. Kết quả là đầu dò trên màng lai với sợi ADN đánh dấu biotin sẽ có màu xanh đặc trƣng, quan sát dễ dàng bằng mắt thƣờng (Hình 1.6) [31,52].
Hình 1.6. Cơ chế phát hiện màu của quá trình lai điểm ngƣợc [78]. 1.3.3 Màng sử dụng trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc
Màng đƣợc sử dụng cho kỹ thuật lai điểm ngƣợc là màng nylon Biodyne C tích điện âm. Các nhóm carboxyl trên màng đƣợc hoạt hóa bằng EDC (1-ethyl-3-dimethylamino propyl carbodiimide hydrochloride) thành dạng O-acylurea. Dạng chất trung gian này lập tức phản ứng với nhóm amin trên đầu dò oligo thành liên kết amide. Theo nguyên tắc, trong môi trƣờng lỏng, cả amino-linkers và exocyclic amines của bazơ đều phản ứng với nhóm carboxyl hoạt hóa. Tuy nhiên, các amin bậc 1 đầu 5‟ có ái lực liên kết với nhóm carboxyl mạnh hơn so với các amin thơm trên bazơ. Do đó, nhóm carboxyl sẽ ƣu tiên gắn với các oligo có nhóm amin ở đầu 5' [77].
Các nhóm carboxyl sau khi đã đƣợc hoạt hóa có thể phản ứng với bất kì tác nhân nào có trong dung dịch. Việc bám không đặc hiệu này thông qua các tƣơng tác tĩnh điện, kị nƣớc hoặc tƣơng tác hóa học đều có thể làm giảm đáng kể độ nhạy của kỹ thuật lai. Do đó, đầu dò oligo sau khi đã đƣợc cố định trên
21
màng, cần bất hoạt tất cả các nhóm đã đƣợc hoạt hóa nhƣng không đƣợc gắn oligo. Dung dịch NaOH 0,1 N thƣờng đƣợc sử dụng cho quá trình này do tính hiệu quả và đơn giản. Màng sau khi đƣợc hoạt hóa đƣợc bảo quản trong môi trƣờng tránh ẩm [77].
1.3.4 Kỹ thuật lai điểm ngƣợc trong chẩn đoán bệnh β-thalassemia
Với ƣu điểm nổi bật cho phép phát hiện đƣợc nhiều đột biến trong cùng một lần thực hiện, phƣơng pháp lai điểm ngƣợc đã đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu để phát hiện đột biến β-thalassemia. Nghiên cứu của Sutcharitchan và cs. (1995) sử dụng lai điểm ngƣợc để phát hiện 14 đột biến gây bệnh β-thalassemia và các đột biến HbS, HbC ở những ngƣời Mỹ gốc Phi [56]. Trong nghiên cứu vào năm 2012, Lin và cs. đã thiết lập kỹ thuật lai điểm ngƣợc nhằm phát hiện 5 đột biến gây bệnh α-thalassemia và 16 đột biến gây bệnh β-thalassemia [34]. Kết quả thu đƣợc hoàn toàn phù hợp với kỹ thuật giải trình tự và gap-PCR (sử dụng kit thƣơng mại).
Ở một số quốc gia, kỹ thuật lai điểm ngƣợc đã đƣợc phát triển để chẩn đoán trƣớc sinh β-thalassemia [31,68]. Từ năm 1999, tại Thái Lan, kỹ thuật lai điểm ngƣợc đã đƣợc áp dụng cho phép phát hiện 10 đột biến phổ biến và 14 đột biến ít phổ biến để chẩn đoán trƣớc sinh trên 105 thai phụ [68]. Năm 2006, tại Trung Quốc, kỹ thuật này cũng đƣợc sử dụng nhằm phát hiện đồng thời 17 loại đột biến phổ biến β-thalassemia, kết hợp với giải trình tự để chẩn đoán trƣớc sinh trên 317 thai phụ [31].
Cho tới nay, lai điểm ngƣợc là kỹ thuật duy nhất đƣợc các hãng phát triển thành các kit thƣơng mại để chẩn đoán đột biến β-thalassemia. Bộ kit StripAssay của ViennaLab cho phép phát hiện đồng thời 21 đột biến α- thalassaemia và 22 đột biến β-thalassaemia là một ví dụ [80]. Tại Việt Nam, kỹ thuật này cũng đã đƣợc Công ty cổ phần công nghệ Việt Á áp dụng để sản xuất bộ kit LightPower iVAHPV Genotype RDB nhằm xác định sự đồng nhiễm
22
của 8 type HPV (Human papillomavirus) nguy cơ thấp và 16 type HPV nguy cơ cao liên quan đến bệnh ung thƣ cổ tử cung [79]. Tuy nhiên, đây là bộ kit duy nhất dựa trên kỹ thuật lai điểm ngƣợc đƣợc sản xuất ở nƣớc ta.
Hiện nay tại Việt Nam, kỹ thuật ARMS-PCR đã đƣợc áp dụng trong nhiều nghiên cứu để chẩn đoán đột biến β-thalassemia và cho kết quả rất khả quan [1,3,5]. Tuy nhiên, số nghiên cứu sử dụng lai điểm ngƣợc còn rất hạn chế. Nguyên nhân là do việc tối ƣu cho điều kiện lai và rửa đồng thời đối với nhiều đột biến trong cùng một lần lai gặp rất nhiều khó khăn. Vì vậy, chúng tôi mong muốn áp dụng kỹ thuật lai điểm ngƣợc để phân tích đồng thời một số đột biến phổ biến trên gen β-globin ở ngƣời Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi mong muốn áp dụng kỹ thuật lai điểm ngƣợc để phân tích đồng thời một số đột biến phổ biến trên gen β-globin ở ngƣời Việt Nam, từ đó tự chủ thêm kỹ thuật xét nghiệm hiệu quả. Vì lý do đó, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Phát hiện các đột biến trên gen beta globin bằng kỹ thuật ARMS-PCR và lai điểm ngƣợc (reverse dot blot)” với các nội dung nghiên cứu: (1) xây dựng đƣợc kỹ thuật ARMS-PCR để sàng lọc một số đột biến phổ biến trên gen β- globin tại Việt Nam; (2) tối ƣu đƣợc điều kiện cho kỹ thuật lai điểm ngƣợc phát hiện một số đột biến điểm phổ biến gây bệnh β-thalassemia.
23
Chƣơng 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.1 Nguyên liệu
- Hai trăm tám mƣơi tám (288) mẫu bệnh phẩm thalassemia đƣợc cung cấp bởi Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng (2012)
- Một trăm năm mƣơi hai (152) mẫu máu ngƣời bình thƣờng kiểm tra sức khỏe tại bệnh viện Bạch Mai (2015).
2.1.2 Hóa chất
- GoTaq Master Mix 2x (Promega)
- Đệm Taq DNA polymerase (có chứa Mg2+ 20 mM) - DreamTaq (Fermentas)
- Đệm DreamTaq polymerase 10x (có chứa Mg2+ 20 mM) (Fermentas) - Biotin-11-dUTP (Fermentas)
- Streptavidin Alkaline Phosphatase (Promega) - Tween 20 (Sigma)
24
- Chất hoạt hóa màng nylon Biodyne C: EDC (1-Ethyl-3-[3- dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) (Sigma-Aldrich)
- Cơ chất cho phản ứng tạo màu: Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase (Promega)
- Agarose (Takara)
- Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Lysogeny Broth (LB) gồm 1% trypton; 0,5% cao nấm men; 0,5% NaCl
- Marker 100 bp (Fermentas)
- Chủng tế bào khả biến E. coli JM109 đƣợc cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc