2.1.1 Nguyên liệu
- Hai trăm tám mƣơi tám (288) mẫu bệnh phẩm thalassemia đƣợc cung cấp bởi Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng (2012)
- Một trăm năm mƣơi hai (152) mẫu máu ngƣời bình thƣờng kiểm tra sức khỏe tại bệnh viện Bạch Mai (2015).
2.1.2 Hóa chất
- GoTaq Master Mix 2x (Promega)
- Đệm Taq DNA polymerase (có chứa Mg2+ 20 mM) - DreamTaq (Fermentas)
- Đệm DreamTaq polymerase 10x (có chứa Mg2+ 20 mM) (Fermentas) - Biotin-11-dUTP (Fermentas)
- Streptavidin Alkaline Phosphatase (Promega) - Tween 20 (Sigma)
24
- Chất hoạt hóa màng nylon Biodyne C: EDC (1-Ethyl-3-[3- dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) (Sigma-Aldrich)
- Cơ chất cho phản ứng tạo màu: Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase (Promega)
- Agarose (Takara)
- Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Lysogeny Broth (LB) gồm 1% trypton; 0,5% cao nấm men; 0,5% NaCl
- Marker 100 bp (Fermentas)
- Chủng tế bào khả biến E. coli JM109 đƣợc cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Kit tách ADN tổng số từ mẫu máu: Thermo Scientific™ GeneJET™ Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo)
- Kit nhân dòng gen: InsTAclone PCR Cloning Kit (Thermo)
- Các dung dịch d̀ùng trong quá trình lai đi ểm ngƣợc đƣợc trình bày trong Bảng 2.1
- Các hóa chất thông dụng khác đều đạt độ sạch dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử.
Bảng 2.1. Thành phần các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm ngƣợc
Dung dịch Thành phần H SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1% W SSC 2x; SDS 0,1% U1 Tris-HCl 0,1 M pH 7,5; NaCl 0,15 M U2 Tris-HCl 0,1 M pH 9,5; NaCl 0,1 M; MgCl2 0,05 M
25
SSC 1x NaCl 0,015 M; Natri citrat (Na3C6H5O7) 0,15 M pH 7
Denhardt 1x Ficoll 400 0,02%; Polyvinylpyrrolidone 0,02%; Bovine serum albumin 0,02%
2.1.3 Trình tự các đầu dò oligo sử dụng trong nghiên cứu
Các đầu dò oligo dùng trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc đƣợc gắn thêm nhóm amin ở đầu 5', giúp liên kết với nhóm carboxyl trên màng nylon Biodyne C. Toàn bộ các đầu dò dùng trong nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ). Trình tự các oligo đƣợc trình bày trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Trình tự các đầu dò oligo dùng trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc
(nucleotide gạch chân tƣơng ứng với đột biến)
Tên đầu dò oligo Trình tự (5' - 3') CD17 N NH2-C6-GTGGGGCAAGGTGAACG CD17 M (A→T) NH2-C6-TGGGGCTAGGTGAACG CD26 N NH2-C6-TTGGTGGTGAGGCCCT CD26 M (G→A) NH2-C6-TTGGTGGTAAGGCCCTG CD41 N NH2-C6-CAGAGGTTCTTTGAG CD41 M (- TCTT) NH2-C6-CAGAGGTTGAGTCCT P+ NH2-C12-GTCTTCTCTGTCTCC P- NH2-C12-
26
2.1.4 Trình tự các mồi
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các cặp mồi nhằm sàng lọc đồng thời bốn loại đột biến trên gen β-globin (NC_000011.8) phổ biến ở ngƣời Việt Nam: Cd 17 (A→T), Cd 26 (G→A), Cd 41/42 (-TCTT) và Cd 95 (+A). Trong đó, cặp mồi nội kiểm 95 NF/Control R đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen β-globin nhằm khuếch đại vùng chứa các đột biến đƣợc nghiên cứu. Các mồi 17 MR, 26 MR, 41/42 MR, 95 MR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự đột biến để phát hiện các đột biến tại Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 và Cd 95 trên gen β-globin đã đƣợc sử dụng trong một số nghiên cứu của Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên [4]. Các mồi 17 NF, 26 NF, 41/42 NF đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen β-globin nhằm xác định kiểu gen đồng hợp hoặc dị hợp. Toàn bộ mồi dùng trong nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ). Sơ đồ minh họa vị trí các mồi đƣợc trình bày ở Hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ minh họa vị trí các mồi sử dụng trong nghiên cứu.
Trình tự các mồi đƣợc trình bày trong Bảng 2.3. Toàn bộ mồi dùng trong nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ).
27
Bảng 2.3. Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự (5’-3’) Mục đích
95 NF CCAATCTACTCCCAGGAGCAG
GG
Mồi nội kiểm Control R CGATCCTGAGCTCCACACTGAT
G
17 MR ACTTCATCCACGTTCACCTA Phát hiện đột biến Cd 17
26 MR CCAACCTGCCCAGGGCCTT Phát hiện đột biến Cd 26 41/42 MR GGACAGATCCCCAAAGGACTC A Phát hiện đột biến Cd 41/42 95 MR TTCAGGATCCACGTGCAGCTTT G Phát hiện đột biến Cd 95 17 NF CCGTTACTGACCTGTGGGGCA Phát hiện đồng hợp/dị hợp Cd 17 26 NF GTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTG Phát hiện đồng hợp/dị hợp Cd 26 41/42 NF TCTACCCTTGGACCCAGAGGTTC Phát hiện đồng hợp/dị hợp Cd 41/42 Probe F2 GGCTCATGGCAAGAAAGTGCT Đánh dấu biotin đoạn
gen
β-globin
Aso beta R
GTTGCCCATAACAGCATCAGG
M13 F GTAAAACGACGGCCAGT Phát hiện đoạn ADN
chèn trong vector
M13 R GTAAAACGACGGCCAGT
2.1.5 Thiết bị
Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phòng thí nghiệm Sinh Y - Khoa Sinh học; Phòng Sinh học Phân tử - Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
28
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm 2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm
Chúng tôi thiết kế sơ đồ thí nghiệm nhƣ Hình 2.2, bao gồm 5 bƣớc: - Bƣớc 1: Tách ADN từ các mẫu bệnh phẩm; xác định nồng độ ADN bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ quang phổ ở bƣớc sóng 260 nm; điện di kiểm tra ADN
- Bƣớc 2: Thực hiện PCR đa mồi với các mẫu ADN đạt chất lƣợng nhằm sàng lọc 4 đột biến phổ biến trên gen β-globin ở ngƣời Việt Nam
- Bƣớc 3: Tiến hành kiểm tra với các mẫu có đột biến bằng kỹ thuật ARMS-PCR để xác định kiểu gen
- Bƣớc 4: Tách dòng, giải trình tự các đoạn có đột biến và không có đột biến trên gen β-globin
- Bƣớc 5: Thử nghiệm kỹ thuật lai điểm ngƣợc phát hiện đột biến trên các mẫu bệnh phẩm.
29
2.2.2 Tách ADN tổng số
ADN đƣợc tách chiết từ mẫu máu bằng Kit Thermo Scientific™ GeneJET™ Whole Blood Genomic DNA Purification. Quy trình gồm các bƣớc chính nhƣ sau:
- Mẫu máu bảo quản ở -80oC đƣợc lấy ra để tan hoàn toàn, đảo đều nhẹ nhàng
- Chia 20 µl Proteinase K vào các ống eppendorf 1,5 ml - Thêm 200 µl máu vào mỗi ống
- Thêm 400 µl Lysis Solution, trộn đều và ủ ở 56oC trong 10 phút - Bổ sung 200 µl ethanol (96-100%), trộn đều
- Chuyển hỗn hợp lên cột. Ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch. Chuyển cột sang ống thu 2 ml mới
- Bổ sung 500 µl dung dịch Wash Buffer 1. Ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch. Đặt cột trở lại ống thu
- Bổ sung 500 µl dung dịch Wash Buffer 2. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 3 phút, loại dịch
- Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm 200 µl Elution Buffer, ủ nhiệt độ phòng 2 phút. Ly tâm tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút. Thu dịch chứa ADN. Bảo quản ở -20oC.
2.2.3 Phƣơng pháp PCR
Trong nghiên cứu này, phƣơng pháp PCR đƣợc sử dụng với các mục đích:
30
(1) Sàng lọc 4 đột biến tại Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 và Cd 95 trên gen β- globin bằng kỹ thuật PCR đa mồi. Thành phần và điều kiện cho phản ứng PCR đa mồi phát hiện đồng thời 4 đột biến đƣợc trình bày trong Bảng 2.4.
(2) Đánh dấu đoạn gen β-globin với biotin (sử dụng biotin-11-dUTP) nhằm phục vụ cho quá trình lai điểm ngƣợc. Thành phần và điều kiện cho phản ứng PCR sử dụng biotin-11-dUTP đƣợc trình bày trong Bảng 2.5.
Bảng 2.4. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đa mồi sàng lọc đồng thời
các đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41/42 trên gen β-globin
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 2,1
GoTaq Master Mix 2x 7,5
95 NF 10 µM 1,0 17 MR 1 µM 0,7 26 MR 1µM 0,4 41/42 MR 2,5 µM 0,3 95 MR 2,5 µM 0,6 Control R 5 µM 0,4 ADN (15-25 ng) 2,0 Tổng 15,0 94oC 2’; [94oC 30s; 68oC 17s; 72oC 15s]x45 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞
Bảng 2.5. Thành phần và điều kiện phản ứng không đánh dấu và đánh dấu trình tự đích cho kỹ thuật lai điểm ngƣợc
Thành phần phản ứng không đánh dấu Thể tích (µl) Thành phần phản ứng đánh dấu Thể tích (µl) H2O 19,6 H2O 19,6
31 Đệm DreamTaq polymerase 10x 3,0 Đệm DreamTaq polymerase 10x 3,0 dNTPs 2mM 1,0 d(A,C,G)TP 1 mM mỗi loại 2,0 dTTP 1 mM 1,2 Biotin-11-dUTP 1 mM 0,8 95 NF 10 µM 0,6 95 NF 10 µM 0,6
Aso beta R 10 µM 0,6 Aso beta R 10 µM 0,6
DreamTaq (5 u/µl) 0,2 DreamTaq (5 u/µl) 0,2
ADN (30-40 ng) 2,0 ADN (30-40 ng) 2,0 Tổng 30,0 Tổng 30,0 94oC 2’; [94oC 30s; 65oC 20s; 72oC 20s]x45 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞ 94oC 2’; [94oC 30s; 65oC 20s; 72oC 20s]x45 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞ 2.2.4 Phƣơng pháp ARMS-PCR
Sau khi xác định các đột biến bằng kỹ thuật PCR đa mồi, các mẫu có đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 đƣợc kiểm tra lại bằng kỹ thuật ARMS-PCR với mồi đột biến và xác định kiểu gen đồng hợp hoặc dị hợp với mồi bình thƣờng. Những mẫu có xuất hiện đồng thời sản phẩm với mồi đột biến và mồi bình thƣờng cho phép kết luận đây là đột biến dị hợp. Với những mẫu có xuất hiện sản phẩm với mồi đột biến nhƣng không có sản phẩm với mồi bình thƣờng cho phép kết luận đây là đột biến đồng hợp. Điều kiện tối ƣu cho phản ứng ARMS-PCR để xác định kiểu gen các đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 đƣợc trình bày lần lƣợt trong Bảng 2.6, Bảng 2.7, Bảng 2.8.
Bảng 2.6. Thành phần và điều kiện phản ứng ARMS-PCR đã tối ƣu để sàng
32
Mồi bình thƣờng Mồi đột biến
Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Thành phần phản ứng Thể tích (µl) H2O 3,8 H2O 3,5
GoTaq Master Mix 2x
7,5 GoTaq Master Mix 2x 7,5
95 NF 10 µM 0,4 95 NF 10 µM 1,0 17 NF 10 µM 0,3 17 MR 10 µM 0,2 Control R 10 µM 1,0 Control R 10 µM 0,8 ADN (15-20 ng) 2,0 ADN (15-20 ng) 2,0 Tổng 15,0 Tổng 15,0 94oC 2’; [94oC 30s; 68oC 17s; 72oC 30s]x30 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞ Bảng 2.7. Thành phần và điều kiện phản ứng ARMS-PCR đã tối ƣu để sàng
lọc kiểu gen đột biến Cd 26
Mồi bình thƣờng Mồi đột biến
Thành phần Thể tích (µl)
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 3,6 H2O 3,6
GoTaq Master Mix 2x
7,5 GoTaq Master Mix 2x 7,5
95 NF 10 µM 0,6 95 NF 10 µM 1,0 26 NF 10 µM 0,3 26 MR 10 µM 0,1 Control R 10 µM 1,0 Control R 10 µM 0,8 ADN (15-20 ng) 2,0 ADN (15-20 ng) 2,0 Tổng 15,0 Tổng 15,0 94oC 2’; [94oC 30s; 70oC 60s]x35 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞ 94oC 2’; [94oC 30s; 68oC 17s; 72oC 30s]x30 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞
33
Bảng 2.8. Thành phần và điều kiện phản ứng ARMS-PCR đã tối ƣu để sàng
lọc kiểu gen đột biến Cd 41/42
Mồi bình thƣờng Mồi đột biến
Thành phần Thể tích (µl)
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 3,5 H2O 3,5
GoTaq Master Mix 2x
7,5 GoTaq Master Mix 2x 7,5
95 NF 10 µM 0,3 95 NF 10 µM 1,0 41/42 NF 10 µM 0,4 41/42 MR 10 µM 0,4 Control R 10 µM 0,8 Control R 10 µM 0,6 ADN (15-20 ng) 2,0 ADN (15-20 ng) 2,0 Tổng 15,0 Tổng 15,0 94oC 2’; [94oC 30s; 68oC 17s; 72oC 30s]x40 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞ 94oC 2’; [94oC 30s; 68oC 17s; 72oC 30s]x30 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞ 2.2.5 Phƣơng pháp điện di
Điện di là phƣơng pháp phổ biến để phân tách các đoạn ADN có kích thƣớc khác nhau. Sản phẩm PCR đa mồi và ARMS-PCR đƣợc điện di trên gel agarose 2%, sản phẩm đánh dấu với biotin đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 8% (Bảng 2.9) trong đệm TBE 1x. Thành phần chứa trong 100 µl TBE nhƣ sau: 1,08 g Tris-base; 0,55 g boric acid; 400 µl EDTA 0,5 M pH 8.
Bảng 2.9. Thành phần gel polyacrylamide 8% Thành phần Thể tích (ml)
H2O 3,135
34
Bis-acrylamide 30% 1,33
APS 10% 0,035
TEDMED 0,005
Tổng 5,0
2.2.6 Quá trình lai điểm ngƣợc
2.2.6.1 Hoạt hóa và cố định đầu dò trên màng nylon Biodyne C (Pall)
- Rửa màng với dung dịch HCl 0,1 N trong 3 phút
- Chuyển màng vào dung dịch EDC 16%, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng 15 phút
- Để khô màng ở nhiệt độ phòng
- Đầu dò oligo (Bảng 2.2) đƣợc pha loãng đến nồng độ tối ƣu trong đệm NaHCO3/Na2CO3 0,5 M, pH 8,4
- Chấm 1 µl đầu dò đã pha loãng lên màng, để khô 10 phút - Cố định bằng NaOH 0,1 N trong 10 phút
- Rửa màng 2 lần với H2O
- Để khô và bảo quản ở 4oC hoặc dùng màng lai ngay.
2.2.6.2 Tiền lai và lai
- Tiền lai: chuyển màng vào đệm tiền lai (SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1%) ở nhiệt độ lai trong 20 phút
- Biến tính sản phẩm PCR đánh dấu biotin trong đệm lai: bổ sung 28 µl sản phẩm PCR đƣợc đánh dấu với biotin-11-dUTP vào 100 µl đệm lai H (SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1%), ủ 95oC trong 10 phút rồi chuyển ngay lên đá
35
- Cho sản phẩm biến tính vào 1,5 ml đệm lai H (SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1%). Chuyển màng sang dung dịch này và duy trì ở nhiệt độ lai trong 60 phút
- Rửa màng để loại bỏ đầu dò dƣ thừa: chuyển màng vào dung dịch rửa W (SSC 2x; SDS 0,1%) ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Lặp lại bƣớc này thêm một lần nữa.
2.2.6.3 Phát hiện đầu dò Khóa màng
- Ủ màng với dung dịch U1 (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5; NaCl 0,15 M) trong 20 phút ở nhiệt độ phòng
Gắn đầu dò với SA-AP
- Pha loãng SA-AP trong đệm U1 (SA-AP : đệm U1 = 1: 1500). Chuyển màng vào dung dịch này trong 30 phút ở nhiệt độ phòng
- Sau khi loại bỏ dung dịch trên, chuyển màng vào đệm U1 (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5; NaCl 0,15 M) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Lặp lại bƣớc này thêm một lần nữa
- Ủ màng với dung dịch đệm U2 (Tris-HCl 0,1 M pH 9,5; NaCl 0,1 M; MgCl2 0,05 M) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng
Phát hiện đầu dò
- Thêm cơ chất của enzyme Alkaline phosphatase và ủ tránh ánh sáng. Quan sát kết quả sau 90 phút.
2.2.7 Phƣơng pháp tách dòng
36
Đoạn gen đích chứa đột biến đƣợc khuếch đại bằng cặp mồi 95 NF và Control R với điều kiện và thành phần phản ứng nhƣ Bảng 2.10.
Bảng 2.10. Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn gen đích cần
tách dòng
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 4,9
GoTaq Master Mix 2x 7,5
95 NF 10 µM 0,3 Control R 10 µM 0,3 ADN (15-20 ng) 2,0 Tổng 15,0 94oC 2’; [94oC 30s; 68oC 20s; 72oC 15s]x35 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞ 2.2.7.2 Phản ứng nối
Sản phẩm PCR đƣợc đƣa vào vector pTZ57R/T tạo plasmid tái tổ hợp theo quy trình của InsTAclone PCR Cloning Kit (Thermo) theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.7.3 Biến nạp bằng sốc nhiệt
Các sản phẩm của phản ứng nối đƣợc biến nạp vào tế bào theo phƣơng pháp sốc nhiệt gồm các bƣớc cơ bản nhƣ sau:
- Lấy tế bào khả biến E. coli JM109 từ -80oC, để trên đá 5-10 phút - Bổ sung 5 μl hỗn hợp của phản ứng nối, búng nhẹ, ủ trên đá 10 phút - Sốc nhiệt hỗn hợp ở 42oC trong 45 giây, để lại trên đá 90 giây
- Bổ sung 1 ml môi trƣờng LB, ủ 37oC trong 30 phút, lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 1 giờ
37
- Ly tâm hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ 900 μl dịch phía trên
- Hoà tan phần tủa bằng 100 μl dung dịch còn lại và trải trên đĩa thạch LB có bổ sung ampicillin (50 μg/ml).
2.2.7.4 Sàng lọc khuẩn lạc và nuôi tế bào bão hòa
Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp đƣợc sàng lọc trực tiếp bằng phƣơng pháp PCR sử dụng cặp mồi M13 F/R của vetor pTZ57R/T. Sau đó các khuẩn lạc tiếp tục đƣợc sàng lọc với cặp mồi đặc hiệu của đoạn chèn. Phản ứng PCR với mồi vector M13 F/R đƣợc tiến hành với các thành phần và điều kiện nhƣ trong Bảng 2.11.
Bảng 2.11. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi M13 F/R Thành phần Thể tích (µl)
H2O 10,0
Đệm Taq DNA polymerase 1,5
dNTPs (2 mM mỗi loại) 0,5
M13 F 10 μM 0,25
M13 R 10 μM 0,25
Taq DNA polymerase 0,5
ADN 2,0