KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI
Sử dụng kit Scientific™ GeneJET™ Whole Blood Genomic DNA Purification (Thermo), ADN tổng số đƣợc tách từ mẫu máu ngƣời bệnh thalassemia và ngƣời bình thƣờng. ADN tổng số đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và xác định nồng độ bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm. Kết quả trong Hình 3.1 và Bảng 3.1 cho thấy ADN ít bị đứt gãy và có độ sạch tốt, đủ điều kiện để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.1. Kết quả điện di minh họa ADN tổng số tách từ mẫu máu. Giếng 1-
28: mẫu T1-T28; M: thang chuẩn ADN SY 4,6 kb.
ADN tổng số đƣợc đƣa về nồng độ trong khoảng từ 15-20 ng/µl để làm khuôn cho phản ứng PCR đa mồi sàng lọc đột biến trên gen β-globin. Trong phạm vi luận văn, chúng tôi lựa chọn bốn loại đột biến phổ biến trên gen β- globin ở ngƣời Việt Nam, bao gồm: đột biến tại Cd 17 (A→T), Cd 26 (G→A), Cd 41/42 (-TCTT) và Cd 95 (+A). Điều kiện phản ứng PCR đa mồi trình bày ở Bảng 2.4 đƣợc hoàn thiện từ những kết quả đã có ở Phòng thí nghiệm Sinh Y [4].
40
Bảng 3.1. Nồng độ ADN tổng số tách từ mẫu máu thalassemia T1-T10 Mẫu Nồng độ (ng/µl) Độ tinh sạch (A 260/A280) T1 24,3 1,90 T2 30,4 1,83 T3 25,7 1,88 T4 28,8 1,93 T5 51,8 2,01 T6 27,8 1,97 T7 35,1 2,00 T8 20,5 2,01 T9 30,2 2,00 T10 25,4 1,99
Trong phản ứng PCR đa mồi, cặp mồi nội kiểm 95 NF/Control R khuếch đại trình tự từ promoter đến intron 2 của gen β-globin. Trình tự này có kích thƣớc 700 bp chứa bốn loại đột biến nghiên cứu. Việc sử dụng cặp mồi này nhằm kiểm tra chất lƣợng ADN tách chiết, khẳng định sự có mặt của gen
β-globin trong mẫu ADN, kiểm tra thao tác và thành phần trong phản ứng PCR. Bốn mồi 17 MR, 26 MR, 41/42 MR và 95 MR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự đột biến tại Cd tƣơng ứng. Các mồi đột biến này kết hợp với mồi 95 NF để tạo ra sản phẩm PCR có kích thƣớc lần lƣợt là 203 bp (phát hiện đột biến tại Cd 17), 227 bp (phát hiện đột biến tại Cd 26), 405 bp (phát hiện đột biến tại Cd 41/42) và 565 bp (phát hiện đột biến tại Cd 95) (Hình 2.1).
Sử dụng điều kiện với phản ứng PCR đa mồi, chúng tôi sàng lọc đột biến trên 288 mẫu bệnh phẩm thalassemia và 152 mẫu máu ngƣời khỏe mạnh
41
kiểm tra sức khỏe tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 2%.
Hình 3.2. Kết quả điện di minh họa sản phẩm PCR đa mồi. Giếng (-): đối
chứng âm (không có ADN khuôn); Giếng 1-12: các mẫu thalassemia; Giếng 13-26: các mẫu máu thƣờng; M: thang chuẩn ADN 100 bp.
Quan sát kết quả điện di trên Hình 3.2, chúng tôi nhận thấy tất cả các mẫu đều xuất hiện băng 700 bp chứng tỏ ADN tách chiết đạt chất lƣợng; thao tác PCR và thành phần phản ứng đảm bảo độ tin cậy. Kết quả sàng lọc đột biến bằng kỹ thuật PCR đa mồi trên mẫu bệnh phẩm thalassemia và ngƣời bình thƣờng đƣợc trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc đột biến tại Cd 17, Cd 26, Cd 41/42, Cd 95 trên
mẫu thalassemia và ngƣời bình thƣờng bằng kỹ thuật PCR đa mồi
Đột biến Mẫu thalassemia Ngƣời bình thƣờng
Cd 17 57 3
Cd 26 91 9
Cd 41/42 70 3
42
Tổng 288 152
Các mẫu có đột biến từ kết quả sàng lọc bằng kỹ thuật PCR đa mồi, tiếp tục đƣợc kiểm tra với mồi đặc hiệu bằng kỹ thuật ARMS-PCR để xác định kiểu gen của từng loại đột biến.