Trong nghiên cứu này, phƣơng pháp PCR đƣợc sử dụng với các mục đích:
30
(1) Sàng lọc 4 đột biến tại Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 và Cd 95 trên gen β- globin bằng kỹ thuật PCR đa mồi. Thành phần và điều kiện cho phản ứng PCR đa mồi phát hiện đồng thời 4 đột biến đƣợc trình bày trong Bảng 2.4.
(2) Đánh dấu đoạn gen β-globin với biotin (sử dụng biotin-11-dUTP) nhằm phục vụ cho quá trình lai điểm ngƣợc. Thành phần và điều kiện cho phản ứng PCR sử dụng biotin-11-dUTP đƣợc trình bày trong Bảng 2.5.
Bảng 2.4. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đa mồi sàng lọc đồng thời
các đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41/42 trên gen β-globin
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 2,1
GoTaq Master Mix 2x 7,5
95 NF 10 µM 1,0 17 MR 1 µM 0,7 26 MR 1µM 0,4 41/42 MR 2,5 µM 0,3 95 MR 2,5 µM 0,6 Control R 5 µM 0,4 ADN (15-25 ng) 2,0 Tổng 15,0 94oC 2’; [94oC 30s; 68oC 17s; 72oC 15s]x45 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞
Bảng 2.5. Thành phần và điều kiện phản ứng không đánh dấu và đánh dấu trình tự đích cho kỹ thuật lai điểm ngƣợc
Thành phần phản ứng không đánh dấu Thể tích (µl) Thành phần phản ứng đánh dấu Thể tích (µl) H2O 19,6 H2O 19,6
31 Đệm DreamTaq polymerase 10x 3,0 Đệm DreamTaq polymerase 10x 3,0 dNTPs 2mM 1,0 d(A,C,G)TP 1 mM mỗi loại 2,0 dTTP 1 mM 1,2 Biotin-11-dUTP 1 mM 0,8 95 NF 10 µM 0,6 95 NF 10 µM 0,6
Aso beta R 10 µM 0,6 Aso beta R 10 µM 0,6
DreamTaq (5 u/µl) 0,2 DreamTaq (5 u/µl) 0,2
ADN (30-40 ng) 2,0 ADN (30-40 ng) 2,0 Tổng 30,0 Tổng 30,0 94oC 2’; [94oC 30s; 65oC 20s; 72oC 20s]x45 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞ 94oC 2’; [94oC 30s; 65oC 20s; 72oC 20s]x45 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞ 2.2.4 Phƣơng pháp ARMS-PCR
Sau khi xác định các đột biến bằng kỹ thuật PCR đa mồi, các mẫu có đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 đƣợc kiểm tra lại bằng kỹ thuật ARMS-PCR với mồi đột biến và xác định kiểu gen đồng hợp hoặc dị hợp với mồi bình thƣờng. Những mẫu có xuất hiện đồng thời sản phẩm với mồi đột biến và mồi bình thƣờng cho phép kết luận đây là đột biến dị hợp. Với những mẫu có xuất hiện sản phẩm với mồi đột biến nhƣng không có sản phẩm với mồi bình thƣờng cho phép kết luận đây là đột biến đồng hợp. Điều kiện tối ƣu cho phản ứng ARMS-PCR để xác định kiểu gen các đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 đƣợc trình bày lần lƣợt trong Bảng 2.6, Bảng 2.7, Bảng 2.8.
Bảng 2.6. Thành phần và điều kiện phản ứng ARMS-PCR đã tối ƣu để sàng
32
Mồi bình thƣờng Mồi đột biến
Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Thành phần phản ứng Thể tích (µl) H2O 3,8 H2O 3,5
GoTaq Master Mix 2x
7,5 GoTaq Master Mix 2x 7,5
95 NF 10 µM 0,4 95 NF 10 µM 1,0 17 NF 10 µM 0,3 17 MR 10 µM 0,2 Control R 10 µM 1,0 Control R 10 µM 0,8 ADN (15-20 ng) 2,0 ADN (15-20 ng) 2,0 Tổng 15,0 Tổng 15,0 94oC 2’; [94oC 30s; 68oC 17s; 72oC 30s]x30 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞ Bảng 2.7. Thành phần và điều kiện phản ứng ARMS-PCR đã tối ƣu để sàng
lọc kiểu gen đột biến Cd 26
Mồi bình thƣờng Mồi đột biến
Thành phần Thể tích (µl)
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 3,6 H2O 3,6
GoTaq Master Mix 2x
7,5 GoTaq Master Mix 2x 7,5
95 NF 10 µM 0,6 95 NF 10 µM 1,0 26 NF 10 µM 0,3 26 MR 10 µM 0,1 Control R 10 µM 1,0 Control R 10 µM 0,8 ADN (15-20 ng) 2,0 ADN (15-20 ng) 2,0 Tổng 15,0 Tổng 15,0 94oC 2’; [94oC 30s; 70oC 60s]x35 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞ 94oC 2’; [94oC 30s; 68oC 17s; 72oC 30s]x30 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞
33
Bảng 2.8. Thành phần và điều kiện phản ứng ARMS-PCR đã tối ƣu để sàng
lọc kiểu gen đột biến Cd 41/42
Mồi bình thƣờng Mồi đột biến
Thành phần Thể tích (µl)
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 3,5 H2O 3,5
GoTaq Master Mix 2x
7,5 GoTaq Master Mix 2x 7,5
95 NF 10 µM 0,3 95 NF 10 µM 1,0 41/42 NF 10 µM 0,4 41/42 MR 10 µM 0,4 Control R 10 µM 0,8 Control R 10 µM 0,6 ADN (15-20 ng) 2,0 ADN (15-20 ng) 2,0 Tổng 15,0 Tổng 15,0 94oC 2’; [94oC 30s; 68oC 17s; 72oC 30s]x40 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞ 94oC 2’; [94oC 30s; 68oC 17s; 72oC 30s]x30 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞ 2.2.5 Phƣơng pháp điện di
Điện di là phƣơng pháp phổ biến để phân tách các đoạn ADN có kích thƣớc khác nhau. Sản phẩm PCR đa mồi và ARMS-PCR đƣợc điện di trên gel agarose 2%, sản phẩm đánh dấu với biotin đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 8% (Bảng 2.9) trong đệm TBE 1x. Thành phần chứa trong 100 µl TBE nhƣ sau: 1,08 g Tris-base; 0,55 g boric acid; 400 µl EDTA 0,5 M pH 8.
Bảng 2.9. Thành phần gel polyacrylamide 8% Thành phần Thể tích (ml)
H2O 3,135
34
Bis-acrylamide 30% 1,33
APS 10% 0,035
TEDMED 0,005
Tổng 5,0
2.2.6 Quá trình lai điểm ngƣợc
2.2.6.1 Hoạt hóa và cố định đầu dò trên màng nylon Biodyne C (Pall)
- Rửa màng với dung dịch HCl 0,1 N trong 3 phút
- Chuyển màng vào dung dịch EDC 16%, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng 15 phút
- Để khô màng ở nhiệt độ phòng
- Đầu dò oligo (Bảng 2.2) đƣợc pha loãng đến nồng độ tối ƣu trong đệm NaHCO3/Na2CO3 0,5 M, pH 8,4
- Chấm 1 µl đầu dò đã pha loãng lên màng, để khô 10 phút - Cố định bằng NaOH 0,1 N trong 10 phút
- Rửa màng 2 lần với H2O
- Để khô và bảo quản ở 4oC hoặc dùng màng lai ngay.
2.2.6.2 Tiền lai và lai
- Tiền lai: chuyển màng vào đệm tiền lai (SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1%) ở nhiệt độ lai trong 20 phút
- Biến tính sản phẩm PCR đánh dấu biotin trong đệm lai: bổ sung 28 µl sản phẩm PCR đƣợc đánh dấu với biotin-11-dUTP vào 100 µl đệm lai H (SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1%), ủ 95oC trong 10 phút rồi chuyển ngay lên đá
35
- Cho sản phẩm biến tính vào 1,5 ml đệm lai H (SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1%). Chuyển màng sang dung dịch này và duy trì ở nhiệt độ lai trong 60 phút
- Rửa màng để loại bỏ đầu dò dƣ thừa: chuyển màng vào dung dịch rửa W (SSC 2x; SDS 0,1%) ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Lặp lại bƣớc này thêm một lần nữa.
2.2.6.3 Phát hiện đầu dò Khóa màng
- Ủ màng với dung dịch U1 (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5; NaCl 0,15 M) trong 20 phút ở nhiệt độ phòng
Gắn đầu dò với SA-AP
- Pha loãng SA-AP trong đệm U1 (SA-AP : đệm U1 = 1: 1500). Chuyển màng vào dung dịch này trong 30 phút ở nhiệt độ phòng
- Sau khi loại bỏ dung dịch trên, chuyển màng vào đệm U1 (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5; NaCl 0,15 M) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Lặp lại bƣớc này thêm một lần nữa
- Ủ màng với dung dịch đệm U2 (Tris-HCl 0,1 M pH 9,5; NaCl 0,1 M; MgCl2 0,05 M) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng
Phát hiện đầu dò
- Thêm cơ chất của enzyme Alkaline phosphatase và ủ tránh ánh sáng. Quan sát kết quả sau 90 phút.
2.2.7 Phƣơng pháp tách dòng
36
Đoạn gen đích chứa đột biến đƣợc khuếch đại bằng cặp mồi 95 NF và Control R với điều kiện và thành phần phản ứng nhƣ Bảng 2.10.
Bảng 2.10. Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn gen đích cần
tách dòng
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 4,9
GoTaq Master Mix 2x 7,5
95 NF 10 µM 0,3 Control R 10 µM 0,3 ADN (15-20 ng) 2,0 Tổng 15,0 94oC 2’; [94oC 30s; 68oC 20s; 72oC 15s]x35 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞ 2.2.7.2 Phản ứng nối
Sản phẩm PCR đƣợc đƣa vào vector pTZ57R/T tạo plasmid tái tổ hợp theo quy trình của InsTAclone PCR Cloning Kit (Thermo) theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.7.3 Biến nạp bằng sốc nhiệt
Các sản phẩm của phản ứng nối đƣợc biến nạp vào tế bào theo phƣơng pháp sốc nhiệt gồm các bƣớc cơ bản nhƣ sau:
- Lấy tế bào khả biến E. coli JM109 từ -80oC, để trên đá 5-10 phút - Bổ sung 5 μl hỗn hợp của phản ứng nối, búng nhẹ, ủ trên đá 10 phút - Sốc nhiệt hỗn hợp ở 42oC trong 45 giây, để lại trên đá 90 giây
- Bổ sung 1 ml môi trƣờng LB, ủ 37oC trong 30 phút, lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 1 giờ
37
- Ly tâm hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ 900 μl dịch phía trên
- Hoà tan phần tủa bằng 100 μl dung dịch còn lại và trải trên đĩa thạch LB có bổ sung ampicillin (50 μg/ml).
2.2.7.4 Sàng lọc khuẩn lạc và nuôi tế bào bão hòa
Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp đƣợc sàng lọc trực tiếp bằng phƣơng pháp PCR sử dụng cặp mồi M13 F/R của vetor pTZ57R/T. Sau đó các khuẩn lạc tiếp tục đƣợc sàng lọc với cặp mồi đặc hiệu của đoạn chèn. Phản ứng PCR với mồi vector M13 F/R đƣợc tiến hành với các thành phần và điều kiện nhƣ trong Bảng 2.11.
Bảng 2.11. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi M13 F/R Thành phần Thể tích (µl)
H2O 10,0
Đệm Taq DNA polymerase 1,5
dNTPs (2 mM mỗi loại) 0,5
M13 F 10 μM 0,25
M13 R 10 μM 0,25
Taq DNA polymerase 0,5
ADN 2,0
Tổng 15,0
94oC 5’; [94oC 30s; 62oC 30s; 72oC 20s]x40 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞
2.2.7.5 Phƣơng pháp tách plasmid
Plasmid đƣợc tách theo quy trình của Sambrook và Russell [52]. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
38
- Cho 1,5 ml môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn chứa plasmid vào ống eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi, để cặn tế bào khô
- Hoà cặn trong 100 µl dung dịch I (50 mM Tris-HCl pH 8; 5 mM glucose; 10 mM EDTA pH 8) bằng máy vortex, ủ trên đá 5 phút
- Thêm 200 µl dung dịch II (0,2 N NaOH; 1% SDS), ủ ở nhiệt độ phòng 3 phút
- Thêm 150 µl dung dịch III (3 M C2H3O2K pH 5,2), đảo nhẹ, ủ trên đá 5 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC, 15 phút, thu dịch nổi phía trên
- Bổ sung 1 thể tích Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1), trộn đều bằng máy vortex. Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, thu dịch pha trên
- Thêm 0,6 thể tích Isopropanol, đảo 3-5 lần, ủ ở nhiệt độ phòng 5-10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút
- Bổ sung 1 ml cồn 70% để rửa tủa. Ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút, bỏ dịch nổi và để khô tủa. Hoà tủa trong 30 µl H2O bổ sung RNase (20 µg/ml), ủ ở 37oC trong 30 phút. Plasmid đƣợc bảo quản ở 4oC.
39
1. KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN β-GLOBIN BẰNG
KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI
Sử dụng kit Scientific™ GeneJET™ Whole Blood Genomic DNA Purification (Thermo), ADN tổng số đƣợc tách từ mẫu máu ngƣời bệnh thalassemia và ngƣời bình thƣờng. ADN tổng số đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và xác định nồng độ bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm. Kết quả trong Hình 3.1 và Bảng 3.1 cho thấy ADN ít bị đứt gãy và có độ sạch tốt, đủ điều kiện để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.1. Kết quả điện di minh họa ADN tổng số tách từ mẫu máu. Giếng 1-
28: mẫu T1-T28; M: thang chuẩn ADN SY 4,6 kb.
ADN tổng số đƣợc đƣa về nồng độ trong khoảng từ 15-20 ng/µl để làm khuôn cho phản ứng PCR đa mồi sàng lọc đột biến trên gen β-globin. Trong phạm vi luận văn, chúng tôi lựa chọn bốn loại đột biến phổ biến trên gen β- globin ở ngƣời Việt Nam, bao gồm: đột biến tại Cd 17 (A→T), Cd 26 (G→A), Cd 41/42 (-TCTT) và Cd 95 (+A). Điều kiện phản ứng PCR đa mồi trình bày ở Bảng 2.4 đƣợc hoàn thiện từ những kết quả đã có ở Phòng thí nghiệm Sinh Y [4].
40
Bảng 3.1. Nồng độ ADN tổng số tách từ mẫu máu thalassemia T1-T10 Mẫu Nồng độ (ng/µl) Độ tinh sạch (A 260/A280) T1 24,3 1,90 T2 30,4 1,83 T3 25,7 1,88 T4 28,8 1,93 T5 51,8 2,01 T6 27,8 1,97 T7 35,1 2,00 T8 20,5 2,01 T9 30,2 2,00 T10 25,4 1,99
Trong phản ứng PCR đa mồi, cặp mồi nội kiểm 95 NF/Control R khuếch đại trình tự từ promoter đến intron 2 của gen β-globin. Trình tự này có kích thƣớc 700 bp chứa bốn loại đột biến nghiên cứu. Việc sử dụng cặp mồi này nhằm kiểm tra chất lƣợng ADN tách chiết, khẳng định sự có mặt của gen
β-globin trong mẫu ADN, kiểm tra thao tác và thành phần trong phản ứng PCR. Bốn mồi 17 MR, 26 MR, 41/42 MR và 95 MR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự đột biến tại Cd tƣơng ứng. Các mồi đột biến này kết hợp với mồi 95 NF để tạo ra sản phẩm PCR có kích thƣớc lần lƣợt là 203 bp (phát hiện đột biến tại Cd 17), 227 bp (phát hiện đột biến tại Cd 26), 405 bp (phát hiện đột biến tại Cd 41/42) và 565 bp (phát hiện đột biến tại Cd 95) (Hình 2.1).
Sử dụng điều kiện với phản ứng PCR đa mồi, chúng tôi sàng lọc đột biến trên 288 mẫu bệnh phẩm thalassemia và 152 mẫu máu ngƣời khỏe mạnh
41
kiểm tra sức khỏe tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 2%.
Hình 3.2. Kết quả điện di minh họa sản phẩm PCR đa mồi. Giếng (-): đối
chứng âm (không có ADN khuôn); Giếng 1-12: các mẫu thalassemia; Giếng 13-26: các mẫu máu thƣờng; M: thang chuẩn ADN 100 bp.
Quan sát kết quả điện di trên Hình 3.2, chúng tôi nhận thấy tất cả các mẫu đều xuất hiện băng 700 bp chứng tỏ ADN tách chiết đạt chất lƣợng; thao tác PCR và thành phần phản ứng đảm bảo độ tin cậy. Kết quả sàng lọc đột biến bằng kỹ thuật PCR đa mồi trên mẫu bệnh phẩm thalassemia và ngƣời bình thƣờng đƣợc trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc đột biến tại Cd 17, Cd 26, Cd 41/42, Cd 95 trên
mẫu thalassemia và ngƣời bình thƣờng bằng kỹ thuật PCR đa mồi
Đột biến Mẫu thalassemia Ngƣời bình thƣờng
Cd 17 57 3
Cd 26 91 9
Cd 41/42 70 3
42
Tổng 288 152
Các mẫu có đột biến từ kết quả sàng lọc bằng kỹ thuật PCR đa mồi, tiếp tục đƣợc kiểm tra với mồi đặc hiệu bằng kỹ thuật ARMS-PCR để xác định kiểu gen của từng loại đột biến.
2. SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN β-GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT
ARMS-PCR
2.1 Sàng lọc đột biến Cd 17 trên mẫu thalassemia bằng ARMS-PCR
Chúng tôi xác định kiểu gen đồng hợp hay dị hợp trên 57 mẫu bệnh phẩm thalassemia có đột biến Cd 17 sử dụng thành phần và điều kiện tối ƣu cho phản ứng ARMS-PCR đƣợc trình bày trên Bảng 2.6. Kết quả sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 2%.
Hình 3.3. Kết quả sàng lọc đột biến Cd 17 bằng kỹ thuật ARMS-PCR. Giếng
(-): đối chứng âm (không có ADN khuôn); Giếng M: sản phẩm với cặp mồi đột biến; Giếng N: sản phẩm với cặp mồi bình thƣờng; T92-T178: khuôn là mẫu bệnh phẩm T92-T178; L: thang chuẩn ADN 100 bp.
43
Kết quả điện di đƣợc thể hiện trên Hình 3.3 và Phụ lục 1 cho thấy tất cả các mẫu đều xuất hiện băng nội chuẩn 700 bp và băng đột biến 203 bp. Các mẫu đột biến dị hợp lên băng kích thƣớc 558 bp với mồi bình thƣờng. Các mẫu đột biến đồng hợp không lên băng với mồi bình thƣờng. Kết quả, trong 57 mẫu có đột biến Cd 17, có 3 mẫu (5,26%) là đột biến đồng hợp, 54 mẫu (94,74%) là đột biến dị hợp.
2.2 Sàng lọc đột biến Cd 26 trên mẫu thalassemia bằng ARMS-PCR
Với các điều kiện phản ứng ARMS-PCR đã tối ƣu đƣợc trình bày trên Bảng 2.7, chúng tôi tiến hành sàng lọc kiểu gen đồng hợp hay dị hợp trên 91 mẫu bệnh phẩm thalassemia có đột biến Cd 26. Kết quả sàng lọc đột biến Cd 26 đƣợc thể hiện trên Hình 3.4 và Phụ lục 2. Nhận thấy, tất cả các mẫu đều xuất hiện băng nội chuẩn 700 bp và băng đột biến 227 bp. Các mẫu lên băng kích thƣớc 534 bp với mồi bình thƣờng chúng tôi kết luận đây là mẫu đột biến dị hợp Cd 26. Các mẫu không lên băng với mồi bình thƣờng kết luận đây là