Đầu dò là một phân tử axit nucleic (ADN sợi đơn hoặc ARN sợi đơn) có ái lực mạnh với đích đặc hiệu (trình tự ADN hoặc ARN). Đầu dò oligonucleotide gắn chính xác với trình tự đích. Chiều dài của chúng phù hợp cho phản ứng lai trong các điều kiện ngặt nghèo, giúp phân biệt ADN với những sai khác rất nhỏ trong trình tự. Việc thiết kế đầu dò dựa trên các đặc điểm sau [28]:
19
- Thành phần G+C từ 40-60% để tăng khả năng lai đặc hiệu
- Không đƣợc có các trình tự bổ sung bên trong đầu dò để tránh hình thành cấu trúc “kẹp tóc” (hair-pin), ngăn cản quá trình lai
- Tránh trình tự có nhiều hơn 4 nucleotide lặp lại
- Không sử dụng đầu dò có độ tƣơng đồng >70% với các vùng không phải trình tự đích để tránh hiện tƣợng lai không đặc hiệu.
Đầu dò cho kỹ thuật lai điểm ngƣợc thƣờng đƣợc gắn thêm nhóm amin bậc một („amino-linkers‟) vào đầu 5' ở bƣớc cuối cùng của quá trình tổng hợp đầu dò, ngăn cách với đầu dò bởi nhóm spacer („spacer arm‟). Chiều dài đầy đủ của nhóm amino-linker và spacer xấp xỉ khoảng 28 Å (Hình 1.5) [75].
Hình 1.5. Cấu trúc của oligonucleotide amino-linkers và spacer arm
[75].
Hình 1.6 mô tả hệ thống phát hiện màu của quá trình lai điểm ngƣợc. Đầu tiên, đầu dò đƣợc cố định lên màng và lai với ADN đƣợc đánh dấu. Thông thƣờng là sản phẩm PCR đánh dấu với biotin (vitamin H). Trong tự nhiên, tƣơng tác giữa biotin và streptavidin là tƣơng tác sinh học không cộng hóa trị mạnh nhất (hằng số phân ly Kd = 10-15) [17]. Do đó, streptavidine đƣợc đƣa vào phức streptavidin-alkaline phosphatase. Cuối cùng, cơ chất tạo màu của alkaline-phosphatase (5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate - BCIP) và thuốc nhuộm (nitro-blue-tetrazalium - NBT) đƣợc thêm vào hệ thống. Khi enzyme alkaline phosphatase loại bỏ nhóm phosphate khỏi BCIP, dung dịch
20
NBT-BCIP vàng nhạt sẽ chuyển sang dạng tủa xanh dƣơng. Kết quả là đầu dò trên màng lai với sợi ADN đánh dấu biotin sẽ có màu xanh đặc trƣng, quan sát dễ dàng bằng mắt thƣờng (Hình 1.6) [31,52].
Hình 1.6. Cơ chế phát hiện màu của quá trình lai điểm ngƣợc [78]. 1.3.3 Màng sử dụng trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc
Màng đƣợc sử dụng cho kỹ thuật lai điểm ngƣợc là màng nylon Biodyne C tích điện âm. Các nhóm carboxyl trên màng đƣợc hoạt hóa bằng EDC (1-ethyl-3-dimethylamino propyl carbodiimide hydrochloride) thành dạng O-acylurea. Dạng chất trung gian này lập tức phản ứng với nhóm amin trên đầu dò oligo thành liên kết amide. Theo nguyên tắc, trong môi trƣờng lỏng, cả amino-linkers và exocyclic amines của bazơ đều phản ứng với nhóm carboxyl hoạt hóa. Tuy nhiên, các amin bậc 1 đầu 5‟ có ái lực liên kết với nhóm carboxyl mạnh hơn so với các amin thơm trên bazơ. Do đó, nhóm carboxyl sẽ ƣu tiên gắn với các oligo có nhóm amin ở đầu 5' [77].
Các nhóm carboxyl sau khi đã đƣợc hoạt hóa có thể phản ứng với bất kì tác nhân nào có trong dung dịch. Việc bám không đặc hiệu này thông qua các tƣơng tác tĩnh điện, kị nƣớc hoặc tƣơng tác hóa học đều có thể làm giảm đáng kể độ nhạy của kỹ thuật lai. Do đó, đầu dò oligo sau khi đã đƣợc cố định trên
21
màng, cần bất hoạt tất cả các nhóm đã đƣợc hoạt hóa nhƣng không đƣợc gắn oligo. Dung dịch NaOH 0,1 N thƣờng đƣợc sử dụng cho quá trình này do tính hiệu quả và đơn giản. Màng sau khi đƣợc hoạt hóa đƣợc bảo quản trong môi trƣờng tránh ẩm [77].
1.3.4 Kỹ thuật lai điểm ngƣợc trong chẩn đoán bệnh β-thalassemia
Với ƣu điểm nổi bật cho phép phát hiện đƣợc nhiều đột biến trong cùng một lần thực hiện, phƣơng pháp lai điểm ngƣợc đã đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu để phát hiện đột biến β-thalassemia. Nghiên cứu của Sutcharitchan và cs. (1995) sử dụng lai điểm ngƣợc để phát hiện 14 đột biến gây bệnh β-thalassemia và các đột biến HbS, HbC ở những ngƣời Mỹ gốc Phi [56]. Trong nghiên cứu vào năm 2012, Lin và cs. đã thiết lập kỹ thuật lai điểm ngƣợc nhằm phát hiện 5 đột biến gây bệnh α-thalassemia và 16 đột biến gây bệnh β-thalassemia [34]. Kết quả thu đƣợc hoàn toàn phù hợp với kỹ thuật giải trình tự và gap-PCR (sử dụng kit thƣơng mại).
Ở một số quốc gia, kỹ thuật lai điểm ngƣợc đã đƣợc phát triển để chẩn đoán trƣớc sinh β-thalassemia [31,68]. Từ năm 1999, tại Thái Lan, kỹ thuật lai điểm ngƣợc đã đƣợc áp dụng cho phép phát hiện 10 đột biến phổ biến và 14 đột biến ít phổ biến để chẩn đoán trƣớc sinh trên 105 thai phụ [68]. Năm 2006, tại Trung Quốc, kỹ thuật này cũng đƣợc sử dụng nhằm phát hiện đồng thời 17 loại đột biến phổ biến β-thalassemia, kết hợp với giải trình tự để chẩn đoán trƣớc sinh trên 317 thai phụ [31].
Cho tới nay, lai điểm ngƣợc là kỹ thuật duy nhất đƣợc các hãng phát triển thành các kit thƣơng mại để chẩn đoán đột biến β-thalassemia. Bộ kit StripAssay của ViennaLab cho phép phát hiện đồng thời 21 đột biến α- thalassaemia và 22 đột biến β-thalassaemia là một ví dụ [80]. Tại Việt Nam, kỹ thuật này cũng đã đƣợc Công ty cổ phần công nghệ Việt Á áp dụng để sản xuất bộ kit LightPower iVAHPV Genotype RDB nhằm xác định sự đồng nhiễm
22
của 8 type HPV (Human papillomavirus) nguy cơ thấp và 16 type HPV nguy cơ cao liên quan đến bệnh ung thƣ cổ tử cung [79]. Tuy nhiên, đây là bộ kit duy nhất dựa trên kỹ thuật lai điểm ngƣợc đƣợc sản xuất ở nƣớc ta.
Hiện nay tại Việt Nam, kỹ thuật ARMS-PCR đã đƣợc áp dụng trong nhiều nghiên cứu để chẩn đoán đột biến β-thalassemia và cho kết quả rất khả quan [1,3,5]. Tuy nhiên, số nghiên cứu sử dụng lai điểm ngƣợc còn rất hạn chế. Nguyên nhân là do việc tối ƣu cho điều kiện lai và rửa đồng thời đối với nhiều đột biến trong cùng một lần lai gặp rất nhiều khó khăn. Vì vậy, chúng tôi mong muốn áp dụng kỹ thuật lai điểm ngƣợc để phân tích đồng thời một số đột biến phổ biến trên gen β-globin ở ngƣời Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi mong muốn áp dụng kỹ thuật lai điểm ngƣợc để phân tích đồng thời một số đột biến phổ biến trên gen β-globin ở ngƣời Việt Nam, từ đó tự chủ thêm kỹ thuật xét nghiệm hiệu quả. Vì lý do đó, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Phát hiện các đột biến trên gen beta globin bằng kỹ thuật ARMS-PCR và lai điểm ngƣợc (reverse dot blot)” với các nội dung nghiên cứu: (1) xây dựng đƣợc kỹ thuật ARMS-PCR để sàng lọc một số đột biến phổ biến trên gen β- globin tại Việt Nam; (2) tối ƣu đƣợc điều kiện cho kỹ thuật lai điểm ngƣợc phát hiện một số đột biến điểm phổ biến gây bệnh β-thalassemia.
23
Chƣơng 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.1 Nguyên liệu
- Hai trăm tám mƣơi tám (288) mẫu bệnh phẩm thalassemia đƣợc cung cấp bởi Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng (2012)
- Một trăm năm mƣơi hai (152) mẫu máu ngƣời bình thƣờng kiểm tra sức khỏe tại bệnh viện Bạch Mai (2015).
2.1.2 Hóa chất
- GoTaq Master Mix 2x (Promega)
- Đệm Taq DNA polymerase (có chứa Mg2+ 20 mM) - DreamTaq (Fermentas)
- Đệm DreamTaq polymerase 10x (có chứa Mg2+ 20 mM) (Fermentas) - Biotin-11-dUTP (Fermentas)
- Streptavidin Alkaline Phosphatase (Promega) - Tween 20 (Sigma)
24
- Chất hoạt hóa màng nylon Biodyne C: EDC (1-Ethyl-3-[3- dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) (Sigma-Aldrich)
- Cơ chất cho phản ứng tạo màu: Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase (Promega)
- Agarose (Takara)
- Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Lysogeny Broth (LB) gồm 1% trypton; 0,5% cao nấm men; 0,5% NaCl
- Marker 100 bp (Fermentas)
- Chủng tế bào khả biến E. coli JM109 đƣợc cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Kit tách ADN tổng số từ mẫu máu: Thermo Scientific™ GeneJET™ Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo)
- Kit nhân dòng gen: InsTAclone PCR Cloning Kit (Thermo)
- Các dung dịch d̀ùng trong quá trình lai đi ểm ngƣợc đƣợc trình bày trong Bảng 2.1
- Các hóa chất thông dụng khác đều đạt độ sạch dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử.
Bảng 2.1. Thành phần các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm ngƣợc
Dung dịch Thành phần H SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1% W SSC 2x; SDS 0,1% U1 Tris-HCl 0,1 M pH 7,5; NaCl 0,15 M U2 Tris-HCl 0,1 M pH 9,5; NaCl 0,1 M; MgCl2 0,05 M
25
SSC 1x NaCl 0,015 M; Natri citrat (Na3C6H5O7) 0,15 M pH 7
Denhardt 1x Ficoll 400 0,02%; Polyvinylpyrrolidone 0,02%; Bovine serum albumin 0,02%
2.1.3 Trình tự các đầu dò oligo sử dụng trong nghiên cứu
Các đầu dò oligo dùng trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc đƣợc gắn thêm nhóm amin ở đầu 5', giúp liên kết với nhóm carboxyl trên màng nylon Biodyne C. Toàn bộ các đầu dò dùng trong nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ). Trình tự các oligo đƣợc trình bày trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Trình tự các đầu dò oligo dùng trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc
(nucleotide gạch chân tƣơng ứng với đột biến)
Tên đầu dò oligo Trình tự (5' - 3') CD17 N NH2-C6-GTGGGGCAAGGTGAACG CD17 M (A→T) NH2-C6-TGGGGCTAGGTGAACG CD26 N NH2-C6-TTGGTGGTGAGGCCCT CD26 M (G→A) NH2-C6-TTGGTGGTAAGGCCCTG CD41 N NH2-C6-CAGAGGTTCTTTGAG CD41 M (- TCTT) NH2-C6-CAGAGGTTGAGTCCT P+ NH2-C12-GTCTTCTCTGTCTCC P- NH2-C12-
26
2.1.4 Trình tự các mồi
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các cặp mồi nhằm sàng lọc đồng thời bốn loại đột biến trên gen β-globin (NC_000011.8) phổ biến ở ngƣời Việt Nam: Cd 17 (A→T), Cd 26 (G→A), Cd 41/42 (-TCTT) và Cd 95 (+A). Trong đó, cặp mồi nội kiểm 95 NF/Control R đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen β-globin nhằm khuếch đại vùng chứa các đột biến đƣợc nghiên cứu. Các mồi 17 MR, 26 MR, 41/42 MR, 95 MR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự đột biến để phát hiện các đột biến tại Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 và Cd 95 trên gen β-globin đã đƣợc sử dụng trong một số nghiên cứu của Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên [4]. Các mồi 17 NF, 26 NF, 41/42 NF đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen β-globin nhằm xác định kiểu gen đồng hợp hoặc dị hợp. Toàn bộ mồi dùng trong nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ). Sơ đồ minh họa vị trí các mồi đƣợc trình bày ở Hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ minh họa vị trí các mồi sử dụng trong nghiên cứu.
Trình tự các mồi đƣợc trình bày trong Bảng 2.3. Toàn bộ mồi dùng trong nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ).
27
Bảng 2.3. Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự (5’-3’) Mục đích
95 NF CCAATCTACTCCCAGGAGCAG
GG
Mồi nội kiểm Control R CGATCCTGAGCTCCACACTGAT
G
17 MR ACTTCATCCACGTTCACCTA Phát hiện đột biến Cd 17
26 MR CCAACCTGCCCAGGGCCTT Phát hiện đột biến Cd 26 41/42 MR GGACAGATCCCCAAAGGACTC A Phát hiện đột biến Cd 41/42 95 MR TTCAGGATCCACGTGCAGCTTT G Phát hiện đột biến Cd 95 17 NF CCGTTACTGACCTGTGGGGCA Phát hiện đồng hợp/dị hợp Cd 17 26 NF GTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTG Phát hiện đồng hợp/dị hợp Cd 26 41/42 NF TCTACCCTTGGACCCAGAGGTTC Phát hiện đồng hợp/dị hợp Cd 41/42 Probe F2 GGCTCATGGCAAGAAAGTGCT Đánh dấu biotin đoạn
gen
β-globin
Aso beta R
GTTGCCCATAACAGCATCAGG
M13 F GTAAAACGACGGCCAGT Phát hiện đoạn ADN
chèn trong vector
M13 R GTAAAACGACGGCCAGT
2.1.5 Thiết bị
Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phòng thí nghiệm Sinh Y - Khoa Sinh học; Phòng Sinh học Phân tử - Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
28
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm 2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm
Chúng tôi thiết kế sơ đồ thí nghiệm nhƣ Hình 2.2, bao gồm 5 bƣớc: - Bƣớc 1: Tách ADN từ các mẫu bệnh phẩm; xác định nồng độ ADN bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ quang phổ ở bƣớc sóng 260 nm; điện di kiểm tra ADN
- Bƣớc 2: Thực hiện PCR đa mồi với các mẫu ADN đạt chất lƣợng nhằm sàng lọc 4 đột biến phổ biến trên gen β-globin ở ngƣời Việt Nam
- Bƣớc 3: Tiến hành kiểm tra với các mẫu có đột biến bằng kỹ thuật ARMS-PCR để xác định kiểu gen
- Bƣớc 4: Tách dòng, giải trình tự các đoạn có đột biến và không có đột biến trên gen β-globin
- Bƣớc 5: Thử nghiệm kỹ thuật lai điểm ngƣợc phát hiện đột biến trên các mẫu bệnh phẩm.
29
2.2.2 Tách ADN tổng số
ADN đƣợc tách chiết từ mẫu máu bằng Kit Thermo Scientific™ GeneJET™ Whole Blood Genomic DNA Purification. Quy trình gồm các bƣớc chính nhƣ sau:
- Mẫu máu bảo quản ở -80oC đƣợc lấy ra để tan hoàn toàn, đảo đều nhẹ nhàng
- Chia 20 µl Proteinase K vào các ống eppendorf 1,5 ml - Thêm 200 µl máu vào mỗi ống
- Thêm 400 µl Lysis Solution, trộn đều và ủ ở 56oC trong 10 phút - Bổ sung 200 µl ethanol (96-100%), trộn đều
- Chuyển hỗn hợp lên cột. Ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch. Chuyển cột sang ống thu 2 ml mới
- Bổ sung 500 µl dung dịch Wash Buffer 1. Ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch. Đặt cột trở lại ống thu
- Bổ sung 500 µl dung dịch Wash Buffer 2. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 3 phút, loại dịch
- Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm 200 µl Elution Buffer, ủ nhiệt độ phòng 2 phút. Ly tâm tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút. Thu dịch chứa ADN. Bảo quản ở -20oC.
2.2.3 Phƣơng pháp PCR
Trong nghiên cứu này, phƣơng pháp PCR đƣợc sử dụng với các mục đích:
30
(1) Sàng lọc 4 đột biến tại Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 và Cd 95 trên gen β- globin bằng kỹ thuật PCR đa mồi. Thành phần và điều kiện cho phản ứng PCR đa mồi phát hiện đồng thời 4 đột biến đƣợc trình bày trong Bảng 2.4.
(2) Đánh dấu đoạn gen β-globin với biotin (sử dụng biotin-11-dUTP) nhằm phục vụ cho quá trình lai điểm ngƣợc. Thành phần và điều kiện cho phản ứng PCR sử dụng biotin-11-dUTP đƣợc trình bày trong Bảng 2.5.
Bảng 2.4. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đa mồi sàng lọc đồng thời
các đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41/42 trên gen β-globin
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 2,1
GoTaq Master Mix 2x 7,5
95 NF 10 µM 1,0 17 MR 1 µM 0,7 26 MR 1µM 0,4 41/42 MR 2,5 µM 0,3 95 MR 2,5 µM 0,6 Control R 5 µM 0,4 ADN (15-25 ng) 2,0 Tổng 15,0 94oC 2’; [94oC 30s; 68oC 17s; 72oC 15s]x45 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞
Bảng 2.5. Thành phần và điều kiện phản ứng không đánh dấu và đánh dấu trình tự đích cho kỹ thuật lai điểm ngƣợc
Thành phần phản ứng không đánh dấu Thể tích (µl) Thành phần phản ứng đánh dấu Thể tích (µl) H2O 19,6 H2O 19,6
31 Đệm DreamTaq polymerase 10x 3,0 Đệm DreamTaq polymerase 10x 3,0 dNTPs 2mM 1,0 d(A,C,G)TP 1 mM mỗi loại 2,0 dTTP 1 mM 1,2 Biotin-11-dUTP 1 mM 0,8 95 NF 10 µM 0,6 95 NF 10 µM 0,6
Aso beta R 10 µM 0,6 Aso beta R 10 µM 0,6
DreamTaq (5 u/µl) 0,2 DreamTaq (5 u/µl) 0,2
ADN (30-40 ng) 2,0 ADN (30-40 ng) 2,0 Tổng 30,0 Tổng 30,0 94oC 2’; [94oC 30s; 65oC 20s; 72oC 20s]x45 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞ 94oC 2’; [94oC 30s; 65oC 20s; 72oC 20s]x45 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞ 2.2.4 Phƣơng pháp ARMS-PCR
Sau khi xác định các đột biến bằng kỹ thuật PCR đa mồi, các mẫu có đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 đƣợc kiểm tra lại bằng kỹ thuật ARMS-PCR với mồi đột biến và xác định kiểu gen đồng hợp hoặc dị hợp với mồi bình thƣờng. Những mẫu có xuất hiện đồng thời sản phẩm với mồi đột biến và mồi bình thƣờng cho phép kết luận đây là đột biến dị hợp. Với những mẫu có xuất hiện sản phẩm với mồi đột biến nhƣng không có sản phẩm với mồi bình thƣờng cho phép kết luận đây là đột biến đồng hợp. Điều kiện tối ƣu cho phản ứng ARMS-PCR để xác định kiểu gen các đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 đƣợc trình bày lần lƣợt trong Bảng 2.6, Bảng 2.7, Bảng 2.8.